全 文 ：第 1 4卷 第 4期
18 9 1年 12月
实 验 生 物 学 报
A ct
aB io f哈 e aE xPe ri me nt al i sS in ie a
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1 4
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4
D e ce m be r 19 8 1
长叶车前花叶病毒上海分离株 ’ 外壳蛋白
赖氨酸残基的修饰对感染及重组的影响
郁操国 蔡同润 王鸣岐
(复旦大学 生物系 )
孙玉 昆
(中国科学院 上海生物化学研究所 )
引 言
关于烟草花叶病毒 ( T M v ) 外壳蛋白
结构与功能的研究 , R am ac h an dr a n a1[ 曾
用 O 一甲基异尿素与 T M V 的外壳 蛋 白反
应 , 指出只有当 T M V 的外壳蛋白经 加热
或尿素变性后 , 赖氨酸的 `一 氨基才与 O -
甲基异尿素反应 。 S e h e e l e 和玩 u fer r [s ]用
氨基修饰试剂三硝基苯磺酸研究了不同蛋
白质氨基的反应速度 , 说明 T M V 外壳 蛋
白与其他蛋白不同 , 只有在尿素变性条件
下 TM V 外壳蛋白的赖氨酸的 。一氨基才和
三硝基苯磺酸 ( T N BS )反应 。 这些结果都
说明 T M V 外壳蛋白亚基中的赖氨酸残 基
不在表面 , 难以同 T N BS 或 0 一甲基异 尿
素直接反应 。
F r a e n k e l一 C o n r a t [` ] 等人用 乙酸醉 修
饰 T M V 的外壳蛋 白 , 当一个酪氨酸残 基
的对位酚基和 0 . 6 个赖氨酸残基被 乙酞化
后 ,感染力下降达 53 % , 如果酪氨酸残基不
被修饰而 0 . 6 个赖氨酸残基被修饰时感染
力不受影响 。 A n d e er r 〔` 1 曾指出 , TM V与二
硝基氟苯反应 , 然后用胰蛋白酶水介分离
多肤 , 与对照相比 , 无论赖氨酸 、 酪氨酸的
组成以及多肤在层析中的位置皆无变化 ,
表明 TM V 病毒颗粒表面不存在 `一氨基 。
自从发现烟草花叶病毒的核酸单独具
有感染力以来 .1[ , 一般认为 T MV 外壳 蛋
白主要是保护其病毒核酸的作用 。 为了研
究这类病毒的蛋白外壳的功能 , 本文报导
了 H R .v 、 与 T M V不同 , 在缓和条件无尿
素存在时 , 其表面的一个赖氨酸残基可被
T N BS 修饰 , 修饰后的 H R vs h 虽保 持 了
完整病毒颗粒 , 但丧失了感染力达 90 % 以
上 , 而且 T N B S 修饰的 H R vs h 又能干 扰
天然的 H R vs h 的感染。 讨论了 H R vs 、 外
壳蛋白的功能 。
材料与方法
H R V hs 的翻奋 将 H R V . h 人工磨擦接种
于 5一 6 片叶的青菜 (B
~
a hc in esn 句叶上 , 二 、
三周后收获。 纯化方法按前文 l1[ 所述 。 用 o . ZM
的磷酸缓冲液抽提 , 冷正丁醇澄清抽提液 , 经二
次 s % 聚乙二醇沉淀及 1 0 , 00 0印m一3 0 , 00 0甲m
的差速离心 , 可得均一的病毒制剂。 每毫克病毒
的 A : e o n m = 3 . 1 7 。
三硝甚笨成吸 系戚正武教授赠给 。
19 8 1年 1月 24 日收到 .
. 注 : 长叶车前花叶病毒上海分离株下文中简称
H R V 立
3 3 2郁操国 蔡同润 王鸣岐 1 4卷
H R V
.b完盆一位翻书的抽奴吸的修饰 取
4一 5毫克 H R Vh s制剂与 3毫克三硝基苯磺酸溶
于 0 .IM, PH S
.
5
,
1毫升的 Na : C O : 一 N a H C O : 缓
冲液中, 35’ C保温 90 分钟。 反应液经 eS p h de xe
G 一2S 柱 ( 0 . 5 x 50厘米 ) 层析 , 用 0 . IM, PH S
.
5
的 N a . C q 一 N目以 C O : 缓冲液洗脱 , 除去反应试
剂 , 收集首先流出的黄色溶液 , 即是被三硝基苯
磺酸修饰的 H R V . b 颗粒 。
H R V
. h 砚白狡妞吸的修饰 采用两种方法
(一 )用 6 7%醋酸法制备 H R V s 、 蛋白口 ] , 取 5 毫
升 H R 、 、 h 制剂于冰冷条件下加冰醋酸 1 0毫升 ,
继续搅拌 30 分钟 , 4 0 0印m 离心 , 取上清液对
蒸馏水透析完全除去乙酸后得 H R V hs 蛋白。 用
修饰 H R V . b 完整颗粒相同的方法制备三硝基苯
磺酸修饰的 H R V s 、 蛋白。 (二 )用上述三硝基苯
磺酸修饰后的 H R V . h 完整病毒颗粒制剂再用上
述醋酸法民拆开病毒的蛋白与核酸 , 制得三硝基
苯磺酸修饰的 H R V : h 蛋白。
三成若笨 . 咬修饰的病套旅位及蛋白的吸收
光. 洲定及浓度润定 将修饰后的病毒颗粒制剂
和修饰后的蛋白稀释到适当的浓度 , 在 0 . IM ,
p划8[ . 5 的 Na , C O 「Na H C O : 缓冲液中 , 测定其
2 2O n m一5 20 n m 的吸收光谱。 同时用已知浓度的
病毒及蛋白作标准曲线 , 以 F iol n 法 s[] 测定被三
硝基苯磺酸修饰的病毒颗粒及蛋白的浓度 。 按照
4 20 ln 的克分子消光系数 = 1
.
32 x 10’ .[] , 计算
病毒颗粒或蛋白中每克分子外壳蛋白亚基所结合
的三硝基苯磺酸克分子数 。 H R V 比 外壳蛋白亚
基分子里为 16 , 50 O J。 算出每个 H R V s b 蛋白亚
基中被修饰的赖氨酸残基数 。
盛染力洲定 将修饰后的 H R V . 、 颗粒制剂
对 0 . ol M, PH 7 . O的磷酸缓冲液透 析 , 24 小 时
后 , 将已知浓度的病毒稀释到2 50 微克 /毫升。 磨
擦接种于心叶烟上作半叶试验 , 3一 5天后观察叶
片上的枯斑数 。
T N B S修饰的病毒的电谊现弃 将 已 知 浓
度的修饰后的病毒制剂用磷钨酸负染后作电镜观
察。
H R V
. h 班白及三确甚笨成吸修饰的H R V比
受白与 H R V ha 一 RN A 的 , 盆 2毫克 /毫 升 的
H RV . h 蛋白或三硝基苯磺酸修饰的 H R V hs 蛋白
与 10 0微克 /毫升的 H R V . b一 R N A 在 0 . 0 2鱿 p H
7
.
2的焦磷酸缓冲液中 30 0 保温 2小时 , 反应液
经 3 0 , 0 0() 甲m , ( M E S S x 1 4 m l T iat n i u m A” ga l
oR et )r 离心 , 沉淀用少量蒸馏水再悬浮后作电镜
观察。 清液对 O . ZM, p 7H
.
2的焦磷酸缓冲液透
析 2小时 , 3刃加 pr m 离心 , 除去透析后产生的
沉淀 , 测定其上清液中的核酸的吸收光谱 , 计算
重组后残余的 R N A 含量 。 以计算其参入重建的
R N A 量 。
结 果
(一 )三硝甚笨 . 吸修饰 的 H R vs h 的
吸收光进
H R矶 h 制剂在 p H S . 5 与三硝基苯 磺
酸保温后 , 用 eS phe de x G一 6 柱层 析 除
去过量的试剂 , 在 o . i M , PH s . 5 的 N a : -
COa 双 a H CO 3缓冲液中测定其吸收光谱 ,
其结果如图 l 。 与 H R str 、 制剂的吸 收 光
||叶
叭
牡汽”驾,
劝 O 邪 0
波长 n也
“ 0 6幼
日 i 三碗基笨嘴 . 修饰的 H R V ` h 的吸收光讼
. — . , H R V s` PH s . 5 , 0 . z M N a, C O : 一 N aH C o :缓冲液中 , 浓度为 0 . 25 毫克/毫升
O … … O , T N P一 H R V必 , pH S . 5 , 0 . I M N妇C ( ) : -
N a] 以C .o 缓冲液中 , 浓度为0 . 16 毫克/毫升
4 期 长叶车前花叶病毒上海分离株外壳蛋白赖氨酸残基的修饰对感染及重组的影响 33
谱比较。 在 34 0毫微米和4 2 0毫微米显示
了两个吸收峰 。 表明与赖氨酸残基结合的
三硝基苯磺酞基 。
(二) 三硝甚笨 , 酸修饰 的 H R从 、 蛋
白的光讼
用 H R叭 、 蛋白直接与三硝基苯磺 酸
反应或 H R矶 h制剂与三硝基苯磺酸 反 应
后再用醋酸法所得的两种三硝基苯磺酸修
饰 的 H R矶 h 蛋 白 , 在 0 . IM , 皿 8 . 5 的
N 、 c oa 一a H CO 。 缓冲液中测定其吸收光
谱 , 结果如图 2 。 两种方法所得的三硝基
苯磺酞蛋白的吸收光谱相同 。 每克分子蛋
白亚基都只有一个赖氨酸残基被修饰 。 当
有 4M 尿素存在时则有二个 。一氨基和一个
琉基与三硝基苯磺酸反应 。 如表 1所示 。
裹 1 H R V曲 外充班白亚` 抽奴 . 残若的修饰
反 应 条 件 被修饰的赖氨酸数
5 0 担
N O
,
PH
S
.
5
1分子 / 16 , 5 0 0
N O ,
p H S
.
5
2分子 卜N H以 16 , 50 0
1分子一 SH/ 1 6 , 5X()
Q一0阶一N
í |/O一H勺|/、
|入二.N/I一)s1!仪O切01/比\ l少心|/仪\N(
(三 )三硝鑫笨 . 酸修 饰 的 H R从 h 的
电镜观案
三硝基苯磺酞化的 H R矶 h 电镜照 片
如图 3 。 修饰后的病毒颗粒的大小 、外形 、
结构与天然 H R叭 h 相似 。
1 3 三鹅若笨二修饰的 H卫V 曲脚二位的电谊照片 4万倍 确钧 . 负染
波长 n m
口 2 三硝璐笨二修饰的 H R V曲班白的吸收光 ,
.一一 T N p - HR v hs ,在州 .8 5, .0I M的 N蟒 .o_ N aH C O :缓冲液中 , 浓度为 0 . 3 0毫克 /毫升 ;
O … … O , T N P一 H R V血 蛋白 , 叫8 . 5, 0 . IM 的
N a, c o 一 N aH C O : 缓冲液中 , 浓度为 0 . 27 毫克 /毫升 ;
@
-
.一@ , H R v sb 蛋白 , 州 8 . 5 , 0 . IM 的 N a, C o,一 N公 K O .缓冲液中 , 浓度为0 . 35 毫克 /毫升 .
(四 )三硝基笨玻酸修 饰 的 H R从 h 制
荆的感染力洲定
经三硝基苯磺酸修饰一个赖氨酸残基
的 H R vs 、 病毒顺粒对 0 . 01 M , p H 7 . 0 的
磷酸缓冲液透析 2 4 小时 , 并用 0 . 01 M ,
p H 7
.
0 的磷酸缓冲液稀释 到 2 50 微 克 /毫
郁操国 蔡同润 王鸣岐 14卷
升 , 磨擦接种于心叶烟上 , 3一 5 天后观察
枯斑数 。 对照用相同浓度的天然H R vs h制
剂 。 在 T N P - H R vs 、 的浓度与对照相同或
10 倍于对照浓度接种时 , 结果如表 2 。
裹 2 三硝基笨嘴吸化的 H R V血 制荆的感染力洲定
T N PI
一
H RV
o h 及 H RV 比 的感染力
感染心叶烟 。 结果表明混合病毒样品的感
染力只有对照的一半左右 , 见表 4 。 显示
了修饰后的 H R vs 、 对天然 H R vs h 的感染
有干扰作用 。
表 3 三确基笨确吐修饰的 H R V血 蛋白及夭然
H R V sb 蛋白与 H RV 曲一R N A 的 , 班
H RV hs 一蛋白和 T N P一 H RV hs 蛋白与 RN A 的重建
病 毒 接 种 浓 度(娜g/ m l )
局部枯斑数
(心叶烟 )
H RV山
2 5 0 0
2 5 0 0一 2 1 0
瓮髯…锐黔…霆…巍鳍
H·… 的 7一蛋白… 1。。 1( 一 )l
RH九 的蛋白 … 1。。 …( · )! 子
从表中局部枯斑数可见 , H R 矶 h颗粒
表面的赖氨酸残基被三硝基苯 磺 酸 修 饰
后 , 其感染力丧失 90 % 以上 。
(五 )三硝签笨成酸修饰 的 H R vs h 蛋
白以及天然 H R V曲 蛋白 与 H R vs h一 R N A
的盆盆
三硝基苯磺酸修饰的 H R矶 、 蛋 白 与
H R vs
h - R N A 按重量计算蛋白为 20 , 核酸
为 1 , 在 0 . 02 M 的 p H 7 . 2 焦磷酸缓冲液
中3 0o C保温。 然后 以电镜检查有否重建颗
粒 , 并测定上清液 中 的 H R矶 h一 N A 的
含量 , 以计算参入重建的 R N A 的百分比
数 , 结果如表 3 。
(六 )三硝甚笨 , 破修 饰的 H R从 h对
天然 H R va 、 感染的形晌
将三硝基苯磺酸修饰 的 H R V s h与天
然 H R Vs 、 混合 , 混合病毒 样 品 中天 然
H R va
h 浓度为 10 0” g /m l , T N P 一H R vs h浓
度为 10 昭 / iln 。 对照样品中天 然 H R从 h
浓 度 也 为 10 鸿 / iln , 上 述 样 品 均 在
0
.
01 M
,
PH 7
.
0的磷酸缓冲液中以半叶法
表 4 三硝甚笨 . 吐修饰后的 H R V hs 对夭然
H R V hs 感染的形晌
枯斑数 /半叶
H R Vs h
( 1 0 0”刁 m l )
H RVs
h ( 10 0” g/ m l ) +
T N P 一 H R V山 ( 10 0拜g/ m l )
讨 论
长叶车前花叶病毒上海分离株是从上
海郊区感病的青菜中分离而得。 如前文 l[]
所述与 T M V 不同 , 其外壳蛋白氨基酸组
成含有组氨酸和甲硫氨酸 , 但和烟草花叶
病毒普通株有血清学的亲 缘 关 系 。 根 据
R a m a
c h a n
dar
n 用 o 一甲基异尿素 [2 1 以 及
aL
u fl 池r 用三硝基苯磺 酸 a[] 对 T M V 外壳
蛋白亚基的作用的报导 , 其赖氨酸残基只
有在加热或尿素变性的情况下才反应 , 表
4 期 长叶车前花叶病毒上海分离株外壳蛋白赖氨酸残基的修饰对感染及重组的影响35 3
明其赖氨酸残基不在 表 面 。 H Rs vh 却 与
T MV外壳蛋白不同 , 在缓和条件下 , p H
7一 8无尿素存在下即能顺利地与三硝基苯
磺酸反应 , 根据计算只有一个赖氨酸残基
与三硝基苯磺酸反应 , 而另一个赖氨酸残
基需要在 4M 尿素存在时反应 , 表明两个
赖氨酸残基一个在病毒颗粒表面 , 另一个
在内部 (表 l ) 。
有意义的是当表面的一个赖氨酸残基
与三硝基苯磺酸反应 后 , H R vs h 病 毒 颗
粒仍保持完整 (图 3 ) , 却丧失了感染能力
达 90 % 以上 , 这一结果说明这个赖氨酸残
基是感染所必需的 , 另外 , 三硝基苯磺酸
修饰的 H R vs 。 虽然丧失感染能力却能 干
扰天然 H R vs h病毒的感染 (表 3 ) , 又进一
步说明 H R vs h 感染过程中可能存在 着专
一位点 ,三硝基苯磺酸修饰的 H R vs h 可能
干扰了天然 H R vs h 与寄主细胞位点 的结
合 。 由于修饰过程中T N P (三硝基苯磺酞 )
含量可 以根据 4 2 On m 的光密度增加 按 消
光系数计算 , 完整病毒的 T N P 修饰量与
单纯病毒外壳修饰结果相同 , 况且核酸包
在外壳蛋白内部 , 因此 表明 T N B S 与病毒
核酸的反应可能性很小。
虽然 T M V 等植物病毒的核酸单独 具
有感染力 , 但感染能力很低 , 只有完整病
毒颗粒的千分之一 。 一般认 、为 T MV 的外
壳蛋白的功能只是起保护 核 酸 作 用 。 而
’
T M V 在尿素存在下其外壳蛋白中赖 氨 酸
·残基与三硝基苯磺酸或二硝基 氟 苯 的 研
究 , 由于尿素对 T M V 外壳蛋白的变性 是
不可逆的 l[ 1 , 对修饰后的结果判断便受到
局限 。 本文结果表明 H R vs 、 的外壳 蛋 白
除保护核酸外 , 对感染起着重要作用 。
至于三硝基苯磺酸修饰后是由于赖氨
酸 。一氨基的正 电荷消失或由于影响了外壳
蛋白空间结构导致感染力的丧失 , 仍有待
于进一步的研究 。
摘 要
长叶车前花叶病毒上海分离株外壳蛋
白中有二个赖氨酸残基 。 完整 的病毒颗粒
或外壳蛋白在 PH S . 5 条件下 , 只有一个赖
氨酸残基与三硝基苯磺酸 反 应 。 如 果 有
4M 尿素存在 , 则有两个赖氨酸残基和 一
个半胧氨酸琉基被修饰 。 三硝基苯磺酞化
的 H R V s 、 病毒顺粒的感染力丧失 90 % 以
上 。 H R vs h的外壳蛋 白经三硝基苯磺酸修
饰后不能与 H R从 h一 R N A重建 。 这些结果
清楚地表明两个赖氨酸残基中一个位于病
毒颗粒表面 , 另一个则包在病毒颗粒中。
表面那个赖氨酸残基为 H R vs 、 的感 染 所
必需 。
今 考 文 献
〔 1 ] 郁操国等 1 97 9 长叶车前花叶病毒上海分离
株 ( H RV血 ) 的研究 1 . 纯化及性质 病毒
学集刊 1 98 0年第一期
[ 2 1 R
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