全 文 ：2015 第十七卷 第五期 ★Vol.17 No.5
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕1108
收稿日期：2014-10-10
修回日期：2014-12-24
＊ 北京中医药大学国际科技合作项目（2012DFG31550）：南非传统草药抗糖尿病活性成分筛选及机制研究，负责人：刘铜华；北京中医药大学创
新团队项目（2011-CXTD-19）：中医药干预糖尿病及其并发症研究团队，负责人：刘铜华。
＊＊ 通讯作者：张晶，教授，硕士生导师，主要研究方向：中药新药研究与开发；徐暾海，教授，主要研究方向：中药活性成分研究。
斑鸠菊果实中总黄酮的提取工艺研究＊
孙美利 1，2，3，李蕾 1，2，3，王和宇 1，2，3，张 晶 1＊＊，徐暾海 2，3，4＊＊，刘铜华 2，3
（1. 吉林农业大学中药材学院 长春 130118；2. 北京中医药大学中医养生学教育部重点
实验室 北京 100102；3. 北京中医药大学中医养生学北京市重点实验室 北京 100102；
4. 北京中医药大学中药学院 北京 100102）
摘 要：目的：优选斑鸠菊果实中总黄酮的最佳提取工艺。方法：采用分光光度法，通过单因素实验考
察乙醇浓度、提取次数、提取时间以及液料比对斑鸠菊果实中总黄酮提取率的影响。结果：最佳提取条件为
乙醇浓度 70%、提取 4次，每次 1 h、料液比为 1:20。结论：采用最佳提取条件，得到的斑鸠菊果实中总黄酮
含量为 103.55 mg·g-1。
关键词：斑鸠菊 总黄酮 正交试验 分光光度法
doi：10.11842/wst.2015.05.036 中图分类号：R284 文献标识码：A
斑 鸠 菊（Vernonia esculenta Hemsl. ）是 菊 科
（Compositae）斑鸠菊属（Vernonia）植物。又名鸡菊
花、大滕菊、火烧叶等，主要分布在四川、云南、贵州、
广西等地[1]。此属植物中多含有黄酮类、萜类及甾体
类化合物等，而黄酮类化合物在降血糖[2，3]、降血压、
降血脂[4-6] 等方面收到了很好的效果。目前，已有
少量关于斑鸠菊属植物中黄酮类化合物提取研究
的报道[7-11]，但尚未见报道此种斑鸠菊中黄酮类化
合物的研究，由于南非及中国多个地区具有丰富的
斑鸠菊属植物资源，因此，本实验利用超声提取法
提取斑鸠菊果实中的总黄酮，并用紫外分光光度法
测定总黄酮含量，为斑鸠菊资源的进一步开发及利
用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
样 品 购 自 河 北 省 安 国 市，于 2013 年 9 月 由 北
京中医药大学刘春生教授鉴定为斑鸠菊果实；芦丁
标 准 品（纯 度 ≥ 90.5%，批 号：100080-200707，购
于中国食品药品鉴定研究院）；所用试剂亚硝酸钠
（NaNO2）、硝 酸 铝 Al（NO3）3、氢 氧 化 钠（NaOH）、
甲 醇（CH3OH）、无 水 乙 醇（CH3CH2OH）均 为 分 析
纯（北京化工厂）。电子天平 [ 梅特勒 - 托利多仪器
（上海）有限公司 ]；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器
厂）；超声机（昆山市超声仪器有限公司）；移液枪
（Transferpette，上海玖荣实业有限公司）；紫外可见
分光光度计（美国贝克曼公司）。
1.2 方法
1.2.1 斑鸠菊果实中总黄酮含量的测定
1.2.1.1 芦丁标准品的制备
准确称取芦丁标准品 5.00 mg 放至 50 mL 容量瓶
中，用甲醇溶解并稀释至刻度，浓度为 0.1 mg·mL-1。
1.2.1.2 测定波长的选择
取“1.2.1.1”项配制的标准品溶液 1 mL 放至 10
mL 比色管中，加入甲醇至 5 mL，加 0.3 mL5% 亚硝
酸钠，混合均匀，静置 6 min，再加 0.3 mL10% 硝酸
铝，混合均匀，静置 6 min，最后加 1.5 mL10% 氢氧
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水平
因素
A乙醇浓度 /%
B液料比
/mL·g-1
C提取时间
/min
D提取次数
/次
1 50 10:1 45 2
2 70 20:1 60 3
3 80 30:1 75 4
表1 L9（34）正交试验设计
化钠，加甲醇稀释至 10 mL，混合均匀，静置 15 min，
空 白 为 不 加 芦 丁 标 准 品 溶 液，采 用 紫 外 分 光 光 度
法，在 400-800 nm 波长范围内测定上述标准液的
吸光度[12，13]，最后确定其测定波长为 500 nm。
1.2.1.3 芦丁标准曲线的绘制
取芦丁标准品溶液 0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、
3.00、4.00、5.00 mL 共 8 份，分 别 置 于 10 mL 具 塞
试管中，各加入甲醇溶液至 5 mL，加 0.3 mL5% 亚
硝酸钠，混合均匀，静置 6 min，再加 0.3 mL10% 硝
酸铝，混合均匀，静置 6 min，最后加 1.5 mL10% 氢
氧化钠，加甲醇稀释至 10 mL，混合均匀，空白为相
应试剂，静置 15 min 后，在 500 nm 波长处测定吸光
度。以横坐标为芦丁浓度（x），以纵坐标为吸光度
（y），绘制标准曲线，得回归方程。见图 1。
1.2.1.4 样品液的制备和黄酮含量的测定
准确称取 5.00 g 斑鸠菊果实粉末，按照一定的
条件，进行超声提取，提取液过滤后减压浓缩，将浓
缩液转移至 100 mL 容量瓶中，用甲醇定容。用移
液枪精密量取 0.1 mL 样品液，按“1.2.1.3”项操作
的方法显色并测定其吸光度，根据回归方程计算样
品中总黄酮的含量。
1.2.2 单因素试验
1.2.2.1 乙醇浓度的考察
称取斑鸠菊果实粉末 6 份，每份 5.00 g，分别加
入 10%、30%、50%、70%、80%、95% 乙 醇 150 mL，
超声提取 3 次，每次 30 min，合并 3 次提取液，提取
液过滤后减压浓缩，将浓缩液转移至 100 mL 容量
瓶中，用甲醇定容，用移液枪精密量取 0.1 mL 样品
液，按照“1.2.1.3”项操作的方法显色并测定其吸光
度，根据回归方程计算总黄酮得率。
1.2.2.2 料液比的考察
称取斑鸠菊药材 5 份，每份 5.00 g，分别用料液
比为 1:5、1:10、1:20、1:40、1:50 的 70% 乙醇超声提
取 3 次，每次 30 min，合并 3 次提取液，过滤后减压
浓缩，将浓缩液转移至 100 mL 容量瓶中，用甲醇定
容，按照“1.2.1.3”项操作的方法显色并测定其吸光
度，根据回归方程计算总黄酮得率。
1.2.2.3 提取时间的考察
称 取 斑 鸠 菊 果 实 粉 末 6 份，每 份 5.00 g，加 入
100 mL70% 的乙醇进行超声提取，提取时间分别为
15、30、45、60、75、90 min，合并 3 次提取液，提取液
过滤后减压浓缩，将浓缩液转移至 100 mL 容量瓶
中，用甲醇定容，按照“1.2.1.3”项操作的方法显色
并测定其吸光度，根据回归方程计算总黄酮得率。
1.2.2.4 提取次数的考察
准 确 称 取 斑 鸠 菊 药 材 5 份，每 份 5.00 g，加 入
100 mL70% 的乙醇进行超声提取，提取次数分别为
1、2、3、4、5 次，提取液过滤后减压浓缩，将浓缩液转
移至 100 mL 容量瓶中，用甲醇定容，按照“1.2.1.3”
项操作的方法显色，并测定其吸光度，根据回归方
程计算总黄酮得率。
1.2.3 正交试验
根据以上单因素试验的结果，用 L9（3
4）正交
表进行正交试验设计，选取的因素与水平见表 1。
并按“1.2.1.3”项操作的方法进行斑鸠菊果实总黄
酮的提取、显色、测定以及含量计算，以确定总黄酮
的最佳提取条件。
1.2.4 试验方法考察
1.2.4.1 精密度试验
准 确 称 取 5 份 芦 丁 标 准 溶 液，各 1 mL，至 10
mL 比色管中，加甲醇至 5 mL，按“1.2.1.3”项操作
的方法显色并测定其吸光度值，经计算得出的 RSD
值为 1.31%（n=5）。
1.2.4.2 显色稳定性试验
准 确 称 取 斑 鸠 菊 果 实 样 品 溶 液 0.1 mL 至 10
mL 比色管中，加甲醇至 5 mL，按“1.2.1.3”项操作
的方法显色，空白为不加 NaNO2 的溶液，分别在 0、
10、20、30、40 min 测定 1 次吸光度，共测 5 次，计算
斑鸠菊果实中总黄酮的含量，经计算得出的 RSD 值
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图 1 标准曲线
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为 1.74%（n=5）。
1.2.4.3 方法重现性试验
准确称取 5 份斑鸠菊果实粉末，各 5.00 g，按照
正交试验筛选出的最佳提取条件进行总黄酮提取，
过滤并减压浓缩，将斑鸠菊浓缩液转移至 100 mL
容量瓶中，加入甲醇定容。用移液枪精密吸取斑鸠
菊果实提取液 0.1 mL，置于 10 mL 比色管中，加甲
醇至 5 mL，按“1.2.1.3”项操作的方法显色并测定
其吸光度，经计算得出的 RSD 值为 0.95%（n=5）。
1.2.4.4 回收率试验
准 确 称 取 5 份 斑 鸠 菊 果 实 粉 末，各 5.00 g，按
正交试验筛选出的最佳提取条件进行总黄酮提取，
过滤并减压浓缩，将斑鸠菊浓缩液转移至 100 mL
容量瓶中，加入甲醇定容。准确吸取斑鸠菊果实提
取液 0.1 mL，置于 10 mL 比色管中，各加芦丁标准
品溶液 1 mL，加甲醇至 5 mL，按“1.2.1.3”项操作
的方法显色并测定其吸光度，经计算加样回收率为
99.63%，RSD 为 0.93%（n=5）。
1.2.4.5 验证试验
准确称取 3 份斑鸠菊果实粉末，各 5.00 g，按正交
试验筛选出的最佳提取条件进行总黄酮提取，过滤并
减压浓缩，将斑鸠菊浓缩液转移至 100 mL 容量瓶中，
加入甲醇定容。准确吸取斑鸠菊果实提取液 0.1 mL，
置于 10 mL 比色管中，加甲醇至 5 mL，按“1.2.1.3”项
操作的方法显色并测定其吸光度，计算总黄酮含量。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 乙醇浓度对斑鸠菊果实总黄酮提取效果的
影响
由图 1 看出，乙醇浓度越高，总黄酮得率越大，
当乙醇浓度高于 70% 时，总黄酮得率随乙醇浓度的
增加反而减少，由此可见，乙醇浓度过高反而不易于
提取率的增加。所以，选择乙醇浓度 70% 进行考察。
2.1.2 料液比对斑鸠菊果实总黄酮提取效果的影响
由图 2 可看出，随着料液比的增多，总黄酮得率
也在不断增大，当料液比的比例大于 1:20 时，总黄酮
得率增加开始变得缓慢，说明提取溶剂量过多不适
合总黄酮提取率的增加，因此，选择料液比为 1:20。
2.1.3 提取时间对斑鸠菊果实总黄酮提取效果的
影响
由图 3 看出，提取时间越长，总黄酮提取率越
大，当提取 1 h 后，总黄酮得率增长速度不再明显且
趋于稳定。由此可见，达到一定的提取时间后，提
取率变化很小，因此，最佳提取时间选择为 1 h。
2.1.4 提取次数对斑鸠菊果实总黄酮提取效果的
影响
由图 4 可看出，提取次数越多，总黄酮得率也
越大，但提取 3 次后，总黄酮得率开始降低至平缓。
由此可见，提取次数过多不易于总黄酮提取率的增
加，甚至会降低，从节约时间考虑，提取次数选择为
3 次。
2.2 正交试验结果
正 交 试 验 结 果 见 表 2，由 表 2 中 4 个 因 素 的 3
个 K 值 的 大 小 可 知 ，A 因 素：A2 ＞ A1 ＞ A3，B 因
素：B2 ＞ B3 ＞ B1，C 因 素：C2 ＞ C1 ＞ C3，D 因 素：
D3 ＞ D2 ＞ D1。由极差可以看出，影响斑鸠菊果实
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图 2 乙醇浓度对斑鸠菊果实总黄酮提取效果的影响ᕧ台䚚ᓃ⢳NHeH ᫅⋞℀喋HN-喌
图 3 料液比对斑鸠菊果实总黄酮提取率的影响ᕧ台䚚ᓃ⢳NHeH ंᬢ䬠喋NJO喌
图 4 提取时间对斑鸠菊果实总黄酮提取效果的影响ᕧ台䚚ᓃ⢳NHeH ं⁍喋⁍喌
图 5 提取次数对斑鸠菊果实总黄酮提取效果的影响
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总黄酮提取率的大小依次为提取次数（D）＞液料
比（B）＞乙醇浓度（A）＞提取时间（C），即 RD ＞
RB ＞ RA ＞ RC。因此，可以得出结论，影响最小的
是提取时间，其次是乙醇浓度和料液比，提取次数
的影响最大。综合以上因素，最佳提取参数组合为
A2B2C2D3，即 70% 乙醇、液料比为 1:20、提取时间是
60 min/ 次、提取 4 次。
2.3 试验方法结果
根据芦丁的标准曲线方程可知，芦丁标准品在
浓度为 0.005-0.07 mg·mL-1 的范围内，芦丁的质量
浓度与吸光度线性关系良好；平均加样回收率、稳
定性、精密度和重现性试验的 RSD 值均小于 2%。
由此得出结论，该方法测定斑鸠菊果实中总黄酮含
量的加样回收率高、稳定性和重复性好，精密度也
高；验证试验结果见表 3，斑鸠菊果实中总黄酮含量
平均值为 103.55 mg·g-1，RSD 为 1.82%（n=3），均
高于正交试验表中的值，所以确定 A2B2C2D3 为最佳
提取工艺条件。
3 结论
正交试验是一种高效率、快速、经济的试验设
计 方 法，通 过 正 交 试 验 可 以 观 察 多 个 因 素 综 合 的
结果，无论单味药[14] 还是组方[15，16]，做提取工艺试
验多通过正交试验法验证单因素对其提取物的提
取率，本研究通过正交试验法优化了斑鸠菊果实总
实验号 A B C D
总黄酮含量
/mg·g-1
1 1 1 1 1 78.47
2 1 2 2 2 96.76
3 1 3 3 3 101.04
4 2 1 2 3 103.43
5 2 2 3 1 94.38
6 2 3 1 2 102.42
7 3 1 3 2 74.31
8 3 2 1 3 103.29
9 3 3 2 1 89.21
K1 92.09 85.40 94.73 87.35
K2 100.08 98.14 96.47 91.16
K3 88.94 97.56 89.91 102.59
R 11.4 12.74 6.56 15.24
表2 正交实验结果
实验号 总黄酮含量 /mg·g-1 平均含量 /mg·g-1 RSD/%
1 101.53
103.55 1.822 103.86
3 105.27
表3 验证实验结果
黄酮的提取工艺，最佳提取条件为 70% 乙醇、料液
比 1:20、提取时间 60 min/ 次，提取 4 次，此条件下
的总黄酮得率的平均值较高，均高于正交试验的结
果，为 103.55 mg·g-1。
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参考文献
2015 第十七卷 第五期 ★Vol.17 No.5
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕1112
Study on Extraction Conditions of Total Flavonoids from Fruit of Vernonia esculenta Hemsl.
Sun Meili1,2,3, Li Lei1,2,3, Wang Heyu1,2,3, Zhang Jing1, Xu Tunhai2,3,4, Liu Tonghua2,3
(1. College of Traditional Chinese Medicine, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China;
2. Health Cultivation Laboratory of the Ministry of Education, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing
100102, China;
3. Beijing Health Cultivation Laboratory, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China;
4. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)
Abstract: Spectrophotometry and single factor test were used in the investigation of effects on extraction results
of total flavonoids from the fruit of Vernonia esculenta Hemsl. from aspects of ethanol concentration, frequency
of extraction, length of extraction time, and the solid-liquid ratio. The extraction conditions were optimized by
orthogonal test. The results showed that the optimum extraction conditions were ethanol concentration of 70%,
extracted for 4 times, 1 h for each time, and the solid-liquid ratio of 1:20. Under these extraction conditions, the
content of total flavonoids in the fruit of Vernonia esculenta Hemsl. was 103.55 mg·g-1.
Keywords: Vernonia esculenta Hemsl., total flavonoids, orthogonal array, spectrophotometry
（责任编辑：曹新伟 张志华，责任译审：王 晶）