全 文 ：菝葜降血糖活性成分及对相关酶的抑制作用
沈忠明 ,丁　勇 ,施　堃 ,殷建伟
(上海大学生命科学学院 ,上海 200444)
　　摘要　目的:研究中药菝葜中的降血糖活性成分及对 α-葡萄糖苷酶和醛糖还原酶的抑制作用。方法:采用有
机溶剂萃取 、硅胶柱层析等分离纯化技术进行降血糖活性成分的分离纯化 , 并通过理化性质和波谱数据鉴定活性
物质的结构 , 继而通过动物实验模型和酶-抑制剂模型研究该活性物质的降血糖作用和酶学性质。结果:从菝葜中
分离并鉴定出一种具有显著降血糖活性的化合物 ,结构为 3(S)-5, 7, 4-三羟基二氢黄酮(柚皮素),具有 α-葡萄糖
苷酶和醛糖还原酶抑制活性。结论:柚皮素为首次从菝葜中分离得到的降血糖有效成分 , 其显著的酶抑制活性为
进一步阐明菝葜的降血糖机制提供了参考。
关键词　菝葜;柚皮素;α-葡萄糖苷酶;醛糖还原酶
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2008)11-1717-04
基金项目:上海市中药现代化专项基金资助(05dz19735)作者简介:沈忠明(1961-),副教授 ,硕士生导师 ,长期从事天然药物的研究工作;Tel:021-66135052, E-mail:szm@staf.shu.edu.cn。
　　菝葜为百合科植物菝葜 SmilaxchinaL.的根
茎 ,又名铁菱角 、马加勒等 ,味甘性平温 〔1〕 ,具有祛
风利湿 、解毒散瘀之功效 ,在我国主要分布于长江以
南地区 ,资源丰富 ,是较常用的中药材 。临床上常用
于治疗风湿性关节痛 、胃肠炎 、乳糜尿 、皮肤瘙痒 、头
痛 、疔疮 、痛经 、肺痈 、直肠粘膜纤维增生 、银屑病 、慢
性萎缩性胃炎 、癌症等疾病 。由于菝葜独特的临床
疗效 ,近年来对其化学成分 、药理学 、药效学的研究
十分活跃 ,据文献报道 〔2〕 ,菝葜煎剂可明显降低四
氧嘧啶糖尿病小鼠血糖浓度 ,并增加肝糖原含量 。
为进一步探明菝葜的降血糖有效成分及其作用机
制 ,本文采用生物活性指导下的导向分离技术(Bio-
activity-guidedisolation)结合硅胶柱层析等纯化技
术 ,对菝葜的有效降血糖成分进行了跟踪分析和分
离 ,经理化性质和波谱数据鉴定 ,确定得到的化合物
为 3(S)-5, 7, 4′-三羟基二氢黄酮(柚皮素),该化合
物为首次从本种植物中分离得到。进一步的体内外
生物活性研究显示该化合物能显著降低模型小鼠的
血糖含量 ,并具有抑制 α-葡萄糖苷酶和醛糖还原酶
活性的作用 。
1 　材料与仪器
1.1 　仪器　UV-2102分光光度计(尤尼柯(上海)
仪器有限公司);WRS-1B数字熔点仪(上海精密科
学仪器有限公司);质谱 、核磁共振数据由中国科学
院上海有机化学研究所测定。
1.2 　药物与试剂　菝葜(SmilaxchinaL.)药材购
自上海余天成药店 ,产地浙江;葡萄糖测定试剂盒
(上海科华 -东菱诊断用品有限公司);α-葡萄糖苷
酶(sigma公司 );邻硝基苯 -β -D吡喃葡萄糖苷
(PNPG)(E.merk公司);薄层层析硅胶及柱层析硅
胶(青岛海洋化工厂);市售拜糖苹 (Glucobay)(北
京拜耳医药保健有限公司 ,产品批号 109463);醛糖
还原酶 (自制);人胎盘(上海嘉定中心医院提供);
其余试剂均为分析纯。
1.3　实验动物　雄性昆明种小鼠 ,体重(17±1)g,
由同济大学实验动物中心提供(许可证号:SYXK
(沪)2007-0031)。
2　方法
2.1　分离和提取 　将 1000 g中药菝葜粉碎 ,用
70%乙醇冷浸 48h,浸出液浓缩得浸膏 ,混悬于蒸馏
水中 ,用等体积石油醚萃取脱脂 3次 ,脱脂后的水相
再用等体积乙酸乙酯萃取 ,分别浓缩得浸膏。将乙
酸乙酯相上硅胶柱进行层析 ,洗脱系统为乙酸乙酯
-甲醇 ,洗脱液分部收集 ,最前沿段合并浓缩后 ,再
上硅胶柱用氯仿-甲醇系统梯度洗脱 ,分部收集 ,浓
缩后析出沉淀物。反复过柱 ,甲醇重结晶后 ,得到白
色针状晶体 0.96 g。以上各步均进行酶活性跟踪 ,
分别测定分离各步和萃取各相的酶抑制活性 ,选取
具有显著抑制酶活性的活性部位 ,再进入下一步骤。
2.2　醛糖还原酶的提取　参照 Vander等〔3〕报道
的分离方法 ,以人胎盘为原料 ,经 75%硫酸铵分级
沉淀 、DEAE-纤维素柱层析(DE-52)得到 ,所有步骤
在 5℃以下进行。
2.3　酶学抑制活性
2.3.1 　α-葡萄糖苷酶抑制活性:根据 Piere等〔4〕
的方法 ,即以 PNPG为底物 , 0.1 mol/LNa2CO3为终
止液 ,于 400 nm波长处比色测定。活力单位定义
为:在 37℃、pH=6.8的条件下 , 1 min内水解 PNPG
释放 1 μmolPNP所需的酶量 。抑制活性即为加入
一定量的抑制剂溶液(相应减少缓冲液体积)后 ,在
·1717·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 11期 2008年 11月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2008.11.054
相同条件下降低 1个酶活力单位所需的抑制剂量。
2.3.2　醛糖还原酶抑制活性:在 0.8 ml磷酸钾缓
冲液(pH=6.5)中加入 40 μl0.4 mol/L硫酸锂 , 40
μl10mmol/L还原型辅酶Ⅱ溶液和 80 μl醛糖还原
酶提取液 , 37℃下保温 4 min, 再加入 40 μl10
mmol/LDL-甘油醛溶液 ,在 340nm波长下扫描记录
吸光度 6 min的变化。活力单位定义:在 37℃、pH
=6.8条件下 ,在 340 nm波长下每分钟吸光度值下
降 0.01为一个活力单位 。抑制活性即为加入一定
量的抑制剂溶液(相应减少缓冲液体积)后 ,在相同
条件下降低 1个酶活力单位所需的抑制剂量。
2.4 　动物分组及处理
2.4.1　四氧嘧啶糖尿病小鼠模型的建立:小鼠适
应性喂养 5 d后 ,禁食不禁水 16h,腹腔注射 2%的
四氧嘧啶(200mg/kg)后 ,喂养 72 h再禁食 4 h后 ,
眼球后静脉丛取血测定血糖浓度(FSG),选取血糖
值在 13.0 mmol/L以上者 ,分组时各组动物血糖平
均差值不大于 0.5 mmol/L。
2.4.2　对正常小鼠的降糖作用:取健康小鼠 50
只 ,随机分为 5组:对照组(灌胃等容积生理盐水),
拜糖苹阳性对照组(100 mg/kg), Nar(见 “3.1”项)
80、120、160 mg/kg组 ,每组 10只。给药 1次 /d,连
续 7d,末次给药后禁食 4h,眼底取血葡萄糖氧化酶
法测定血浆血糖浓度 。
2.4.3　对四氧嘧啶糖尿病小鼠的降糖作用:四氧
嘧啶糖尿病小鼠 48只 ,随机分为 6组:对照组 ,模型
组 ,拜糖苹阳性对照组(100 mg/kg), Nar80、120、
160mg/kg组 ,每组 8只。模型组灌胃等容积生理
盐水 ,其余组给药方式同 “ 2.4.2”。连续给药 8 d。
末次灌胃后禁食 4 h,取血测定血浆血糖浓度。
2.5 　统计学处理　实验数据以 x±s表示 ,组间数
据进行 t检验分析比较差异显著程度 ,以 P<0.05
为显著差异 ,以 P<0.01为差异极显著 。
3 　结果
3.1 　结构鉴定　菝葜的乙醇提物经乙酸乙酯萃
取 、硅胶柱层析及甲醇重结晶后化合物的理化数据
和波谱分析结果如下:白色针晶 (甲醇), mp259 ～
261℃。 ESI-MSm/z:273[ M-H] +,分子量为 272,分
子式 C15H12O5。1H-NMR(CD3OD)δ:7.36(2H, d, J=
8.5, 2.7Hz, C2′-H, C6′-H), 6.82(2H, d, J=8.5,
2.7Hz, C3′-H, C5′-H), 5.98(1H, d, J=2.1Hz, C6-
H), 5.96(1H, d, J=2.1Hz, C8-H), 5.35(1H, dd, J
=13.5, 3.0Hz, C2-H), 3.05(1H, d, J=14.5Hz, C3-
Hα), 2.78(1H, dd, J=14.6 , 3.0Hz, C3-Hβ )。13 C-
NMR(CD3OD)δ:79.1(C-2), 42.6(C-3), 196.3(C-
4), 164.1(C-5), 127.6(C-6), 167.1(C-7), 94.8(C-
8), 163.5(C-9), 101.9(C-10), 129.7(C-2′), 115.0
(C-3′), 157.6(C-4′), 115.0(C-5′), 127.6(C-6′)。
立体结构是通过比较文献 〔5〕中的核磁数据而决定
的 ,二位 δH5.98, 1H, d, J=2.1 Hz, δC(CH)79.1;三位
CH2 [ δH3.05(1H, d, J=14.5Hz)和 δH2.78(1H, dd,
J=14.6, 3.0Hz)] , δC(CH2)42.6最终决定了二位立体
构型为 S。综上所述 ,化合物为 3(S)-5 , 7, 4′-三羟
基二氢黄酮(柚皮素 Naringenin, Nar)。
3.2　Nar对 α-葡萄糖苷酶的抑制作用
3.2.1 　对 α-葡萄糖苷酶活性的影响:不同量的
Nar对 α-葡萄糖苷酶的抑制作用如图 1所示 ,当加
入 40 μl浓度为 1 mg/ml的 Nar时 ,抑制率达到
45.5%,表明 Nar对 α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制
活性 。
图 1　Nar对 α-葡萄糖苷酶的抑制作用
3.2.2　Nar的抑制作用类型:按照 Lineweaver-Burk
作图法 , Nar对 α-葡萄糖苷酶抑制作用动力学曲线
如图 2 ,当加入不同量 Nar时所得的直线在横轴上
交于一点 ,确定 Nar对 α-葡萄糖苷酶的抑制作用类
型属非竞争性抑制 ,其 Km=0.67mM。
图 2　Nar对 α-葡萄糖苷酶的非竞争性抑制曲线
3.3　Nar对醛糖还原酶的抑制作用
3.3.1 　对醛糖还原酶活性的影响:如图 3所示 ,当
加入 4μl浓度为 1 mg/ml的 Nar时 ,对醛糖还原酶
的抑制率为 34.2%,当 Nar的量增加到 10 μl时 ,抑
·1718· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 11期 2008年 11月
制率可达到 100%,表明其对醛糖还原酶有较强的
抑制作用。
图 3　Nar对醛糖还原酶的抑制作用
3.3.2　Nar的抑制作用类型:按照 Lineweaver-Burk
作图法 , Nar对醛糖还原酶抑制作用动力学曲线如
图 4所示 ,当加入不同量 Nar时所得的直线在纵轴
上交于一点 ,即纵轴截距相等 ,因此确定其对醛糖还
原酶的抑制作用性质属竞争性抑制 , 其米氏常数
Km=0.26mM。根据有抑制剂存在时 ,回归曲线与
X轴的交点为 -1/Km(1+[ I] /Ki),得出 Ki=2.45
μg/ml。
图 4　Nar对醛糖还原酶的竞争性抑制曲线
3.4 　动物实验
3.4.1　对健康小鼠血糖含量的影响:结果如表 1
所示 ,拜糖苹阳性对照组与 Nar组均可降低正常小
鼠的血糖含量。
　表 1　　　　　一次给药对正常小鼠血糖
含量的影响( x±s, n=10)
组别 剂量(mg/kg)
血糖 FSG(mmol/L)
给药前 给药后
正常组 - 10.21±0.92 10.07±0.54
拜糖苹 100 9.98±0.87 7.45±0.63＊＊
80 9.79±0.68 9.17±0.96＊
Nar 120 9.72±1.01 8.55±0.93＊＊
160 10.08±1.15 8.68±0.54＊＊
　　注:与正常组相比 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01。下表同
3.4.2　对四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的影响:结果
如表 2所示 ,拜糖苹的阳性对照组与 Nar组均可显
著降低模型小鼠的血糖含量 (P<0.05或 P<
0.01),提示 Nar有较好的降糖作用 。
　表 2　　对四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的影响( x±s, n=8)
组别 剂量(mg/kg)
血糖(mmol/L)
给药前 给药后
降糖率(%)
正常组 - 10.00±0.44 9.71±1.65 2.90
模型组 - 17.45±2.68 16.95±4.29 2.87
拜糖苹 100 17.36±2.56 12.62±1.44＊＊ 27.3
80 17.22±2.64 13.12±3.14＊＊ 23.8
Nar 120 17.42±2.21 15.05±0.98＊ 13.6
160 17.31±1.97 14.71±2.37＊ 15.0
4　讨论
α-葡萄糖苷酶抑制剂如拜糖苹(阿卡波糖)、倍
欣(伏格列波糖)等通过调控小肠刷状缘上该酶活
性从而起到防治糖尿病 、肥胖症的作用 。醛糖还原
酶是多元醇代谢旁路中的限速酶 ,抑制该酶活性可
以有效改善机体代谢通路异常 ,主要作用于视网膜 、
晶状体和肾脏等 ,从而达到预防和延缓糖尿病并发
症的目的 。
本文通过建立酶抑制剂模型 ,从中药菝葜中首
次筛选获得了同时具有醛糖还原酶和 α-葡萄糖苷
酶抑制作用的活性物质 ,经结构鉴定 ,确认为 3(S)-
5, 7, 4′-三羟基二氢黄酮 (柚皮素)。其对醛糖还原
酶的抑制类型属于竞争性抑制 ,最大抑制率可达到
100%。对 α-葡萄糖苷酶的抑制类型属于非竞争性
抑制 ,最大抑制率为 52.9%。动物实验显示 ,柚皮
素能显著降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖含量 ,效
果接近于阳性对照药拜糖苹 。其对 α-葡萄糖苷酶
及醛糖还原酶的抑制作用提示〔6, 7〕 ,柚皮素的降血
糖机制可能具有拜糖苹样的作用特性和药效机理 ,
并兼具预防糖尿病并发症的作用 ,菝葜柚皮素对模
型小鼠体内 α-葡萄糖苷酶及醛糖还原酶活性的影
响正在进一步研究中。
参 考 文 献
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(2008-02-18收稿)
维通注射液的急性毒性实验研究
钟延松 1 ,曾煦欣2 ,侯连兵 1
(1.南方医科大学南方医院药学部 ,广东广州 510515;2.佛山科学技术学院 ,广东佛山 528000)
　　摘要　目的:观察小鼠对维通注射液的急性毒性反应。方法:小鼠随机分为 5组 , 各组注射不同浓度维通注射
液 , 观察小鼠的活动与毒性反应 , 根据小鼠死亡情况计算出 LD50。结果:维通注射液的 LD50为 8.4mg/kg。结论:维
通注射液具有良好的安全性 ,实验所获得的 LD50值可为其药理学药效学等的研究提供依据。
关键词　维通注射液;急性毒性实验
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2008)11-1720-02
基金项目:国家新药基金(96-901-05-245)作者简介:钟延松 ,男 ,汉族 ,硕士 ,主要从事中药防治术后粘连研究;Tel:020-61364510, E-mail:hotdog80@ 163.com。＊通讯作者:侯连兵 , Tel:020-61642175。
　　在外科手术中 ,有高达 93% ～ 100%的病人发
生术后粘连 〔1〕 , 它能引起严重并发症 , 包括肠梗
阻 〔2〕 、腹痛〔3〕和女性不孕 〔4〕等。目前 ,国内外对术
后粘连防治尚无较好的办法 。维通注射液(Weitong
Injection, WTI)为我院自主开发研究的术后粘连防
治新药 ,本研究主要参考了陈奇 〔5〕的药理实验方
法 ,在预实验中测出最低的 100%致死剂量 Dmax和
最高的 0 %致死剂量 Dmin,在正式实验中根据各组
小鼠的死亡情况用 Bliss法计算出维通注射液的
LD50。
1 　材料
1.1 　受试药品　维通注射液:南方医院药学部提
供 ,批号:20071227。
1.2 　实验动物　健康 KM小鼠 70只 ,体重 18 ～ 22
g,雌雄各半 ,由南方医科大学实验动物中心提供 ,合
格证号:2006A044。
2 　方法
2.1 　预实验　取 KM小鼠 20只 ,随机分为 5组 ,
每组 4只 ,雌雄各半 ,按 10倍的剂量间隔尾静脉给
药 ,测得 Dmax为 24mg/kg, Dmin为 4 mg/kg。
2.2 　急性毒性实验　取 KM小鼠 50只 ,每只 18 ～
22g,随机分为 5组 ,每组 10只 ,雌雄各半 ,适应性喂
养 3d,温度为 15 ～ 26℃,湿度为 30% ～ 60%,每天
明暗时间各为 12h,给药前禁食 12 ～ 16 h。小鼠的
尾静脉给药体积为 0.1 ml/10 g。给药后禁食 2 ～ 3
h,连续观察 2w。
2.3 　半数致死量(LD50)的计算　用 Bliss法计算
WTI的 LD50。
3　结果
3.1　中毒反应　给药 1 d后 ,发现小鼠活动明显
减少 ,食量也减少 ,无叫声异常 、惊厥 、运动失调 、流
涎 、流泪 、流鼻涕 、呼吸困难 、腹泻 、便秘 、肠胀气等现
象发生 ,动物皮毛光泽。死亡的小鼠进行解剖 ,肉眼
观察心 、肝 、脾 、肺 、肾 、肾上腺 、胸腺 、卵巢 、子宫 、精
囊 、前列腺 、睾丸 、胃 、肠及胸腔 、腹腔 ,各器官均无异
常。
3.2　死亡情况与半数致死量(LD50)
3.2.1 　死亡情况:结果如表 1所示。
　表 1　 死亡情况表
分组 给药剂量(mg/kg) 对数剂量(mg/kg) 动物数(只) 死亡数(只) 死亡率(%)
1 24 1.380 10 10 1.00
2 16 1.204 10 8 0.80
3 10 1.000 10 6 0.60
4 6 0.778 10 3 0.30
5 4 0.602 10 1 0.10
3.2.2 　LD50及其 95%可信区间:结果如表 2所示。
4　讨论
小鼠的死亡集中发生在给药后 3d内 , 实验发
现死亡的小鼠以雄性居多 ,是否与动物性别和应激
反应有关有待进一步研究。
在实验设计时 ,为了方便各组剂量的配制 ,相邻
两组间的剂量比 K不同 , K的范围也相应的增大 ,
在 0.6 ～ 0.9之间 。
·1720· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 11期 2008年 11月