全 文 ：［7］ 国家药典委员会． 中华人民共和国药典:2005 年版一部
［S］． 北京:化学工业出版社，2005:21．
［8］ 郑少华，姜奉华． 正交设计［M］． 北京:中国建材工业出
版社，2005．
［9］ 卫静莉，高松平，董 梅，等． 柿叶提取黄酮类化合物方
法及鉴定［J］． 林业科技开发，2007，21(3) :21-23．
［10］ 肖 骏． 生物酶法提取柿叶黄酮类化合物的研究［D］． 太
原:太原工业学院，2009．
大孔树脂纯化驱虫斑鸠菊总黄酮的工艺研究
杨 科1， 霍仕霞2， 刘晓东1， 彭晓明2， 高 莉2， 甘 萍1， 何 燕1，闫 明2*
(1． 石河子大学药学院，新疆 石河子 832000;2． 新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所，新疆 乌鲁木齐
830049)
收稿日期:2012-10-18
基金项目:国家自然科学基金(81260689)
作者简介:杨 科(1985—) ，硕士生，主要从事中药及天然药物工艺研究。Tel:15886937531，E-mail:yk-andy@ hotmail． com
* 通信作者:闫 明(1959—) ，男，研究员，主要从事新药及天然产物活性研究。Tel:13999171809，E-mail:yanming21cn@ sohu． com
摘要:目的 采用大孔树脂对驱虫斑鸠菊总黄酮进行分离纯化，确定其分离纯化条件。方法 通过对 5 种不同型号大
孔树脂 (D3520、NKA-9、AB-8、LS-300、LS-300B)进行静态吸附与解吸试验，优选出 LS-300B 进行动态吸附及洗脱
试验，确定最佳纯化工艺参数。结果 LS-300B纯化驱虫斑鸠菊总黄酮最佳工艺参数为:树脂径高比 1 ∶ 10;上样液
的质量浓度为 2. 583 mg /mL;pH值为 2. 5;上样体积流量为 2 mL /min;洗脱剂乙醇体积分数为 50%;先用 4 BV水将
杂质洗脱，然后用 6 BV50%的乙醇洗脱;洗脱体积流量为 1 mL /min。采用该工艺最终可纯化总黄酮量至 70%。结论
利用 LS-300B富集驱虫斑鸠菊总黄酮成分，综合效能较好，为进一步研究提供理论依据。
关键词:驱虫斑鸠菊;大孔树脂;总黄酮;工艺研究
中图分类号:Ｒ284. 2 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2013)10-2268-04
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2013. 10. 047
驱虫斑鸠菊 Vernonia anthelmintica为菊科斑鸠菊属，一
年生草本植物。别名印度山茴香(《中国植物志》)、艾特
日拉力 (维吾尔语)。始载于《中国植物志》，《维吾尔药
材标准》及《维吾尔药志》 (上册)亦有记载。其果实在
维吾尔医药学中常用来治疗白癜风［1］，驱虫斑鸠菊黄酮是
驱虫斑鸠菊果实的主要活性成分，主要通过促进黑素细胞
中优黑素的合成而发挥其有效的促进黑素合成的作用［2-3］。
大孔树脂是一类有较好吸附性的有机高聚物吸附剂，
它具有比表面积较大、交换速度较快、机械强度高、对被
提取物污染小、热稳定好等特点，与其他分离技术相比，
它具有提高有效成分的相对含有量、产品不吸潮、生产周
期短、树脂再生方便、可重复使用等优点，因而近几年在
天然产物的分离纯化中被广泛应用，尤其适用于黄酮类化
合物的分离纯化，常用于天然产物中黄酮类物质的分离纯
化［4-5］。本实验应用大孔树脂对驱虫斑鸠菊总黄酮进行分离
纯化，确定其分离纯化条件，为工业化生产提供实验依据。
1 仪器与试药
1. 1 仪器 GBC 紫外-可见分光光度计;Milli—Q 超纯水
纯化系统 (18 MΩ，Millipore 公司) ;SGT7200HBT 型超声
清洗器 (上海冠特超声仪器有限公司) ;BS110S 电子天平
(北京赛多利斯有限公司) ;数显恒温水浴锅 HH—4 型
(金坛市新航仪器厂) ;多用途水浴恒温振荡器 DSHZ—300
型 (江苏太仓市实验设备厂)。
1. 2 试药 驱虫斑鸠菊购于新疆维吾尔自治区维吾尔医医
院草药房，经新疆维吾尔自治区维吾尔医医院艾尼瓦尔主
任鉴定为菊科驱虫斑鸠菊 Vernonia anthelmintica药材。芦丁
对照品 (中国药品生物制品检定所，批号:100080—
200306) ;超纯水 (18 MΩ，Millipore公司) ;5 种大孔吸附
树脂 D3520，NKA － 9，AB － 8，LS － 300，LS － 300B 均购
自沧州宝恩化工有限公司。95%乙醇，甲醇，氢氧化钠，
硝酸钠，硝酸铝等均为分析纯。
2 方法与结果
2. 1 试验方法
2. 1. 1 对照品溶液的制备 精密称取 105 ℃ 干燥至恒重
的芦丁对照品 20 mg，置 100 mL 量瓶中，加 85%乙醇适
量，置水浴微热使溶解，放冷，加 85%乙醇稀释至刻度，
摇匀;精密吸取 25 mL置 50 mL量瓶中，加 85%乙醇稀释
至刻度，摇匀，即得 (每毫升中含芦丁 0. 100 mg) ，置于 4
℃冰箱保存。
2. 1. 2 供试液的制备 将粉碎的驱虫斑鸠菊粉末用 85%的
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乙醇回流浸提 3 次，3 次溶剂用量依次为 10、8 和 8 倍，3
次提取时间分别为 2、1和 1 h。合并提取液，减压浓缩水浴
挥至无醇味，加少量水制成混悬液，制得试样溶液，备用。
2. 1. 3 显色溶液的配制［6-7］ 精密量取对照品溶液或供试液
5. 0 mL，置 10 mL 量瓶中，精密加入 5%亚硝酸钠溶液 0. 3
mL，摇匀，放置 6 min，加10%硝酸铝溶液0. 3 mL，摇匀，放
置 6 min;再加 4%氢氧化钠溶液 4 mL，用 85%乙醇稀释至刻
度，摇匀，放置 15 min，即得对照品或供试品的显色溶液。
2. 1. 4 芦丁标准曲线的绘制 精密吸取芦丁对照品溶液
0. 0、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0 mL 分别置于 10 mL 量瓶
中，分别用 85%乙醇加至 5. 0 mL，按照 3. 4 项加入显色溶
液，以相应试剂作空白，用紫外-可见分光光度法于 510 nm
处测定吸光度。用最小二乘法作线性回归，得回归方程为
y = 12. 966x － 0. 0319，r = 0. 999 9。结果表明，芦丁在 100
～ 500 μg /mL范围内，线性良好。
2. 1. 5 树脂的预处理［8-11］ 树脂与处理过程如图 1。
图 1 大孔树脂预处理过程图
2. 1. 6 大孔树脂的静态吸附试验［8-11］
2. 1. 6. 1 大孔吸附树脂对总黄酮的吸附量 准确称取预处
理好的树脂约 1. 0 g (滤纸吸干) ，置于具塞三角瓶中，准
确加入质量浓度为 0. 612 mg /mL 的总黄酮试样溶液 100
mL，盖紧瓶塞置于恒温水浴振荡器中于 25 ℃下振荡 5 h，
振荡频率 150 次 /min，使树脂充分吸附总黄酮，过滤，测定
不同树脂吸附后滤液中剩余总黄酮浓度，按下式计算各种
树脂对驱虫斑鸠菊总黄酮的吸附量 Qe。
2. 1. 6. 2 大孔吸附树脂对总黄酮的解吸率 将 2. 1. 6. 1 项
中已吸附饱和的树脂放入具塞三角瓶中，准确加入 V1 = 100
mL 85%的乙醇，置恒温水浴震荡器中震荡 5 h，温度 25 ℃，
振荡频率 150 次 /min，使总黄酮充分解析，过滤，测定滤
液中总黄酮浓度并计算解吸率。
2. 1. 7 大孔吸附树脂的动态吸附试验［8-11］ 将预处理好的
树脂装入 (1. 0 cm × 20 cm)玻璃柱中，柱床体积为 5 mL，
将制备好的供试液以一定体积流量上柱，分步收集流出液
(5 mL /管) ，当流出液吸光度达上样液的 1 /10 时，认为总
黄酮已透过，停止上样，计算吸附量。用上述确定的上样
液条件，取 25 mL 黄酮溶液，使其流经大孔树脂柱，让大
孔树脂吸附饱和，用大量的蒸馏水洗掉杂质，然后用乙醇
进行洗脱，分别考察洗脱液浓度、体积流量、用量等单因
素对洗脱的影响。
吸附量 = 上样液质量浓度 (mg /mL) × 流出液体积
(mL)
2. 2 结果分析
2. 2. 1 最大吸收波长的确定 通过对比芦丁对照品溶液与
驱虫斑鸠菊提取液显色后的光谱图，两者在 510 nm处均有
吸收峰，且干扰较小，故选择 510 nm为检测波长。
2. 2. 2 大孔吸附树脂静态吸附试验结果
2. 2. 2. 1 大孔吸附树脂的选择 树脂在分离纯化植物有效
成分时，利用的是树脂吸附的可逆性，对 5 种不同极性的
树脂进行吸附率和解吸率的测定，结果见表 1。
表 1 不同型号的大孔吸附树脂吸附率及解吸率的结果
树脂型号
吸附前
总黄酮 /
mg
吸附后
总黄酮 /
mg
吸附
率 /%
解吸液
中总黄
酮量 /
mg
解吸
率 /%
AB-8 61. 2 24. 6 53. 27 30. 2 82. 51
LS-300 61. 2 23. 6 54. 90 36. 4 96. 81
LS-300B 61. 2 21. 8 59. 48 38. 6 97. 97
NKA-9 61. 2 36. 4 33. 99 22. 5 90. 73
D3520 61. 2 41. 2 26. 14 19. 3 96. 5
由表 1 中结果可见，5 种树脂对黄酮的吸附效果由高至
低依次为 LS-300B ＞ LS-300 ＞ AB-8 ＞ NKA-9 ＞ D3520，解吸
效率由高至低依次为 LS-300B ＞ LS-300 ＞ NKA-9 ＞ D3520 ＞
AB-8。综合以上结果，LS-300B 大孔树脂的吸附与解吸附
能力均最优，故选定 LS-300B大孔树脂进行以下试验。
2. 2. 2. 2 大孔吸附树脂的静态吸附动力学特征 称取1. 0 g
预处理好的 LS-300B 树脂 (滤纸吸干) ，装入具塞三角瓶
中，精确加入试样溶液 V1 = 100 mL，置恒温水浴 (25 ℃)
振荡器中振荡，在 5 h 内，每隔一定时间 (10，20，40，
90，120，240，300 和 420 min)取上清液 1 mL，按照拟定
方法显色，测定总黄酮的量，绘制静态吸附动力学曲线，
见图 2。
由图 2 可见，100 min之前，LS—300B型大孔树脂吸附
速率显著增加，100 ～ 120 min 时增加缓慢，120 min 之后，
增长基本趋于 0，故确定 LS-300B型大孔吸附树脂的静态吸
附时间为 100 min左右。
2. 2. 2. 3 大孔吸附树脂的静态解吸动力学特征 将吸附饱
和的 LS-300B树脂经水洗后移入具塞锥形瓶中，加入 85%
的乙醇，置于水浴振荡器上解吸，每隔一定时间 (5、10、
18、25、30、50、90 min)取解吸液 1 mL，按照拟定方法
显色，测定总黄酮的量，绘制静态解吸动力学曲线，见
图 3。
由图 3 可知，随着时间的延长，解吸量迅速增加，25
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图 2 LS-300B大孔吸附树脂的静态吸附动力学学曲线
图 3 LS-300B大孔吸附树脂的静态解吸动力曲线
min时达到峰值，之后解吸量逐渐降低，50 min 后趋于平
衡，所以认为 25 min可以使大孔吸附树脂上的吸附成分全
部解吸，30 ～ 50 min 后曲线略有下降，可能是取出部分测
定造成的样品量损耗所致。
2. 2. 2. 4 吸附液质量浓度对吸附效果的影响 准确称取 10
份预处理好的 LS-300B树脂 (滤纸吸干)1 g 于 100 mL 的
具塞锥形瓶中，精确加入质量浓度为 0. 204、0. 408、
0. 612、 1. 020、 1. 428、 1. 836、 2. 244、 2. 652、 3. 060
mg /mL的供试液，置于振荡器上恒温振荡，吸附 5 h后取上
清液，按照拟定方法显色，测定其吸光度值，计算每克树
脂的吸附量，结果见图 4。
图 4 吸附液质量浓度对吸附量的影响
由图 4 可见，上样液质量浓度在 0. 204 ～ 2. 244 mg /mL
时，吸附率迅速增加，之后增加速度减慢。试验结果表明:
当上样液质量浓度达到 1. 836 ～ 3. 060 mg /mL时达到该树脂
的最佳吸附效果。
2. 2. 2. 5 pH对树脂吸附性能的影响 将预处理好的树脂
用滤纸吸干，取 10 份处理好的 LS-300B 树脂各 1 g 装入具
塞三角瓶中，以原药液的 pH值为基准，用 0. 5%的 HCl 溶
液和 0. 5%的 NaOH溶液左右调节试样溶液的 pH2. 0、2. 5、
3. 0、3. 5、4. 0、4. 5 (原液)、5. 0、5. 5 和 6. 5 的供试液
100 mL，置恒温水浴 (25 ℃)振荡器上振荡吸附 5 h 后，
测定上清液吸光度值，绘制试样溶液 pH值对吸附率的影响
曲线，见图 5。
图 5 pH对树脂吸附性能的影响
由图 5 可以看出，当 pH 值低于 3. 5 时吸附效果较好，
随 pH值的升高，吸附效果下降，供试液 pH 值在 2. 0 ～ 3. 5
之间对树脂吸附性能良好，故选择供试液 pH值在 2. 5 时进
行后续试验。
2. 2. 2. 6 洗脱剂乙醇体积分数的确定 取 10 份处理好的
LS—300B树脂各 1 g，用一定质量浓度的供试液使之吸附
平衡，然后分别用 10%、20%、30%、40%、50%、60%、
70%、80%、90%乙醇以及无水乙醇在恒温振荡器中解吸
附 5 h，测定解吸液的吸光度值，计算解吸量，见图 6。
图 6 洗脱剂乙醇体积分数对吸附量的影响
由图 6 可见，随洗脱剂乙醇的体积分数增加，洗脱力
增加，当达到 50%后，洗脱效果较好，之后增加缓慢，考
虑到实际及工业生产成本，决定选择 50%的乙醇为洗脱剂。
2. 2. 3 LS-300B大孔吸附树脂动态吸附试验测定 将质量
浓度为 1. 836 mg /mL的供试液加入到装有 5 mL LS-300B 树
脂的层析柱中，在体积流量为 2 mL /min 下上样，每 5 mL
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流出液收集一管，测定流出液吸光度，绘制吸附曲线，见
图 7。
图 7 LS-300B型大孔吸附树脂动态吸附曲线
从图 7 可看出，LS-300B型大孔吸附树脂在此试验条件
下对驱虫斑鸠菊总黄酮有比较好的吸附性能，泄漏点为 80
mL左右。
2. 3 LS-300B 大孔吸附树脂验证试验 取 LS-300B 型大孔
树脂 3份，湿法上柱，径高比为 1 ∶ 10。根据吸附量，精密
吸取 pH 值为 2. 5 的驱虫斑鸠菊浓缩液适量 (质量浓度为
2. 583 mg /mL)上柱，上样体积流量为 2 mL/min，用蒸馏水
洗 4 BV，用 6 BV50%乙醇以 1 mL/min进行洗脱，收集 50%
乙醇洗脱部位减压浓缩、干燥，计算纯度分别为 68. 81%，
69. 46%，72. 23%，最高可达到 70%，结果见表 2。
表 2 验证试验
Tab. 2 Verification test
样品号 初始量 /% 平均 /%
纯化后
量 /%
平均 /%
1 12. 23 68. 81
2 11. 98 12. 18 69. 46 70. 17
3 12. 34 72. 23
3 讨论
3. 1 结论 5 种大孔树脂中，LS-300B 型树脂的吸附率和
解吸附率都较高，是理想的适用于驱虫斑鸠菊总黄酮吸附
分离的树脂类型。
LS-300B型大孔树脂分离纯化驱虫斑鸠菊总黄酮的最佳
条件为:上样液质量浓度为 2. 583 mg /mL;pH 值为 2. 5;
上样体积流量为 2 mL /min，用 4 BV水洗去杂质，然后用 6
BV50%的乙醇以 1 mL /min进行洗脱。
用水洗脱除杂后，以 50%乙醇进行洗脱，目标成分纯
度得到了较大提高，最高可达到 70%，杂质干扰较小，具
有一定的应用价值。
3. 2 讨论 驱虫斑鸠菊总黄酮为药材主要药效成分，本实
验以富集较高纯度的总黄酮为目标，采用大孔树脂法进行
相关富集研究。大孔吸附树脂分离技术是一种高效节能的
新工艺，因其溶剂用量小，树脂可重复使用，在天然产物
有效成分富集中应用极为广泛。大孔吸附树脂的分离主要
运用了筛选原理和吸附原理。吸附作用是依靠它和被吸附
的分子 (吸附质)之间的范德华引力，通过它巨大的比表
面进行物理吸附而工作，使有机化合物根据吸附力的不同
被适当的溶剂洗脱下来［12］。筛选作用是大孔吸附树脂具有
多孔结构对分子大小不同的物质具有选择作用［13］。大孔吸
附树脂根据对物质吸附能力的不同及根据分子大小进行筛
选达到分离纯化的作用［12］。影响大孔树脂的因素众多，包
括树脂本身，被吸附化合物结构，吸附条件，上样浓度，
上样液 pH值，上样体积流量，洗脱溶剂，洗脱体积流量
等。根据化合物的性质不同，影响的主要方向也有差异，
本实验采用紫外可见分光光度法，将影响树脂性能的各因
素一一进行了考察，得到了较优的纯化驱虫斑鸠菊总黄酮
的工艺，为进一步研究做好理论依据。
参考文献:
［1］ 刘晓东，闫 明，刘 发． 维药驱虫斑鸠菊的研究进展
［J］． 时珍国医国药，2008，19(12) :2877-2880．
［2］ 马慧军，訾绍霞，李 铀，等． 驱虫斑鸠菊黄酮促人表皮
黑素细胞黑素合成及其机制的研究［J］． 中国美容医学，
2008，17(4) ，524-526．
［3］ Tian G L，Zhang U，Zhang T，et al． Separation of flavonoids
from the seeds of Vemonia anthelmintica Willd by hish-speed
counter-current chromatography［J］． J Chromatogr A，2004，
1049(1 /2) :219-222．
［4］ 陈雅维，王丹丹，大孔树脂纯化野葛总黄酮的工艺研究
［J］． 制剂与技术，2012，9(9) :106-108．
［5］ 朱会霞，孙金旭，张冰喆，等． 大孔树脂纯化山茱萸黄酮
工艺研究［J］． 食品研究与开发，2012，33(1) :33-37．
［6］ 国家药典委员会． 中华人民共和国药典:2010 年版一部
［S］． 北京:中国医药科技出版社，2010．
［7］ 肖文平，毛 威． 紫外-可见分光光度法测定福菊及杭菊中
总黄酮及绿原酸含量［J］． 湖北农业科学，2011，50(6) :
1278-1280．
［8］ 朱华旭，李 欢，顾晓莹，等． 基于药效学试验的黄连解
毒汤大孔树脂精制工艺筛选 ［J］． 中国实验方剂学杂志，
2011，17(18) :1-5．
［9］ 屠鹏飞，贾存勤，张洪全． 大孔吸附树脂在中药新药研究
和生产中的应用［J］． 世界科学技术-中医药现代化，2004，
6(3) :22．
［10］ 刘金玉，吴秀华，商雪娇，等． 不同大孔吸附树脂对苦荞
芦丁分离纯化效果的研究［J］． 食品研究与开发，2008，
29(7) :22-24．
［11］ 张晓旭． 大孔树脂在辣椒碱分离纯化中的应用研究 ［D］．
济南:山东轻工业学院，2011:27-44．
［12］ 李嘉蓉． 天然药物化学试验［M］． 北京:中国医药科技出
版社，1998:25-27．
［13］ 马振山． 大孔吸附树脂在药学研究领域中的应用［J］． 中
成药，1997，19(12) :40．
1722
2013 年 10 月
第 35 卷 第 10 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
October 2013
Vol． 35 No． 10