全 文 ：　[收稿日期] 　2007-05-09;2007-08-29修回
　[基金项目] 　贵州省科学技术基金[ 黔科同 J字(2006)2017]
　[作者简介] 　彭全材(1983-),男 ,在读硕士 ,研究方向:植物化学。 E-mail:cjxpxai@yahoo.com.cn
　＊通讯作者:胡继伟 ,男 ,教授 ,从事药用植物研究.E-mail:jw hu@gznu.edu.cn
专论与综述 [ 文章编号] 1001-3601(2007)06-0406-0130-03
HPLC法测定知母中菝葜皂苷元含量的方法探讨
彭全材 , 杨占南 , 胡继伟＊ , 夏品华
(贵州师范大学 贵州省山地环境重点实验室 , 贵州 贵阳 550001)
　　[ 摘　要] 对近年来应用 H PLC 法测定知母中菝葜皂苷含量的样品前处理方法和色谱条件的研究情况进行了介绍和综
合分析 ,结合作者的研究总结了样品纯化的基本纯化流程 , 探索了科学的色谱条件 , 为探究菝葜皂苷元的可靠检测手段提供
依据。[ 关键词] 菝葜皂苷元;提取法;高效液相色谱[ 中图分类号] S567 [ 文献标识码] A
Determination of Sarsasapogenin Content in
Anemarrhenaasphodeloides Bge.by HPLC
PENG Quancai , YANG Zhannan , HU Jiw ei＊ , XIA Pinhua
(GuizhouNormal University , Guizhou Key Laboratory of Mountainous Environment , Guiyang , Guizhou 550001 , China)
　　Abstract:The paper r eview s the pre treatment method and its chromatog raphic condition o f de te rmining sarsasapogenin
content in Rhizoma Anemarrhenae by H PLC , int roduces the basic purification pr ocess for the sample purifica tion and probes
the scientific chroma to g raphic condition to provide the basis for de te rmining sar sasapogenin content in R hizoma Anemarrhenae.
Key words:sa rsasapogenin;ex traction method;High-pe rformance Liquid Chromato gr aphy(H PLC)
　　菝葜皂苷元(sarsasapogenin)是中药中知母
(Anemarrhenaasphodeloides Bge.)的指标成分[ 1 ,2] ,目
前知母药材以及含知母的单方及复方中药制剂大多
以菝葜皂苷为质量评价指标 ,由于菝葜皂苷元只在
紫外末端有吸收 ,近年来通过 HPLC 方法测定菝葜
皂苷以其在准确性 、重现性 、灵敏度等方面的优势而
逐渐为人们广泛使用。本文对近 6 年来 HPLC 法
测定知母药材及制剂中菝葜皂苷的前处理方法及色
谱条件两方面结合自己的研究进行了论述 ,为菝葜
皂苷含量的测定及开发利用提供参考。
1 菝葜皂苷含量测定的前处理方法
1.1 不同样品提取纯化方法
知母本身含有多种成分 ,复方中药成分更加复
杂 ,而菝葜皂苷的含量相对不高 ,在药材中一般含量
为 1%就为合格[ 3] 。因此 ,在 HPLC 测定前进行适
当有效的前处理对于保护色谱柱和提高供试液中菝
葜皂苷含量都非常必要。
1.1.1 复方知母胶囊样品[ 4] 取复方知母胶囊内
容物置量瓶中 ,加乙醇超声提取 ,取出后 ,加乙醇稀
释到刻度 。过滤 ,精密吸取滤液置圆底烧瓶中 ,加盐
酸 ,置水浴上用蒸汽缓慢回流 ,放冷 ,加水 ,回收溶剂
至无醇味 ,用氯仿萃取 4 次 ,每次 20mL ,合并萃取
液 ,回收氯仿 ,蒸干 ,残渣用甲醇溶解定容 , 0.45μm
滤膜过滤作为供试品溶液 。
1.1.2 抗病毒口服液样品[ 5] 精密量取本品 ,以
氯仿振摇提取 4次 ,弃去氯仿液 ,水液用水饱和的正
丁醇振摇提取 5次 ,合并正丁醇提取液 ,蒸干 ,残渣
加乙醇溶解 ,移至量瓶中 ,稀释至刻度 ,摇匀 ,滤过 ,
取滤液 10mL ,加盐酸 1mL 水浴回流 1 h ,放冷 ,倾
入小烧杯中 ,边振摇边滴加氢氧化钠溶液至中性 ,用
乙醇洗涤容器 ,洗液并入烧杯中。用乙醇移至量瓶
中 ,稀释至刻度 ,摇匀 ,滤过 ,精密量取滤液 ,蒸干 ,残
渣加苯溶解转移至量瓶中 ,稀释至刻度 ,摇匀 ,作为
供试品溶液 。
1.1.3 金莲清热胶囊样品[ 6] 取本品内容物加入
乙醇 50mL ,加热回流提取 ,放冷 ,再称定重量 ,用乙
醇补足减失的重量 ,摇匀 ,滤过 ,精密量取续滤液 ,加
盐酸 ,置水浴上用蒸汽缓缓回流 ,浓缩 ,加水 20mL ,
用苯提取 5次 ,合并苯提取液 ,蒸干 ,残渣加苯溶解
并转移至 2mL 量瓶中 ,加苯至刻度 ,摇匀 ,即得。
1.1.4 知母制剂样品[ 7] 取知母制剂样品 ,干燥
至恒重 ,精密称取适量置锥形瓶中 ,加乙醇浸泡 ,超
声处理 ,离心 ,吸取上清液;残渣再用乙醇超声处理
2次离心 ,合并 3次上清液 ,加盐酸 ,置水浴上用蒸
气缓慢回流移至蒸发皿中浓缩至适量 ,用苯振摇提
取 2次 ,合并提取液并蒸干;残渣用甲醇溶解并转移
容量瓶中 ,稀释至刻度 ,摇匀 ,作为供试品溶液。
1.1.5 知母药材样品[ 8] 知母样品经干燥粉碎后
用乙醇于索氏提取器中提取 ,提取液用旋转蒸发仪
回收溶剂 ,残渣加盐酸溶液回流水解 ,用氯仿分 3次
萃取 ,合并萃取液并回收氯仿 ,所得残渣经石油醚脱
　贵州农业科学　2007 , 35(6):130～ 132　Guizhou Ag ricultural Science s
脂后用甲醇溶解并最后定容 ,制成样品溶液。
1.1.6 知母提取物样品[ 9] 将提取液分别通过不
同的大孔树脂(药材与树脂比例约 3∶1 ～ 2)上 ,吸
附速率 2BV/h ,吸附完成后 ,用水洗至还原糖反应
呈阴性(Molish反应),改用 80%乙醇洗脱 ,将乙醇
洗脱液继续通过 D392 大孔吸附树脂进行脱色 ,并
用 2BV 80%乙醇洗脱至皂苷类物质全部洗脱完全 ,
合并流出液 ,减压回收乙醇 ,真空干燥。
1.1.7 知母药材样品[ 10] 70%乙醇超声提取 2
次 ,合并提取液并过滤 ,精密量取续滤液 10mL ,水浴
蒸干 ,加水 10mL ,盐酸 1mL ,水浴回流 ,冷至室温 ,用
氯仿萃取 2次 ,合并氯仿提取液 ,蒸干 ,残渣加甲醇溶
解 ,转移至 10mL量瓶中 ,并稀释至刻度 ,摇匀。
综合上述样品提取纯化方法 ,可以把方法的基
本纯化流程总结如图 1 ,如果样品中干扰仍较大 ,则
可以参考前述通过大孔树脂柱的处理方法。
图 1 菝葜皂苷元样品的提取流程
1.2 衍生化
　　菝葜皂苷元只在紫外末端有最大吸收 ,我们运
用 ChemDraw 软件模拟了其分子结构同时使用
Chem3D软件模拟了其 3D构象(图 2),以便于直观
了解其最低能量(energ y m inimum)时的分子构象
和衍生的部位。菝葜皂苷元含量一般比较低 ,含量
测定时影响准确性及检出限 ,采取适当的方法对其
进行衍生化加以改善。狄维[ 11] 等使知母中提取的
菝葜皂苷元 3位羟基与活化的保护单糖反应 ,再脱
去单糖保护得到目标化合物 。所合成的 7个(A6 ～
G6)知母螺旋甾烷型皂苷衍生物中 ,除半乳糖基知
母螺旋甾烷型皂苷衍生物外 ,其它6个化合物为新
图 2 Molecular mechanics MM2能量优化 3D图
化合物 。
2 色谱条件
2.1 流动相
2.1.1 甲醇 通常用纯甲醇 ,但流速各有不同[ 7] ,
笔者曾测定知母药材中菝葜皂苷元含量 ,流动相为
纯甲醇 ,保留时间为 6.8min ,对照与样品的分析图
谱见图 3。
图 3 高效液相色谱图
2.1.2 甲醇-水 甲醇-水梯度洗脱(85∶15※100
∶0 ,时间 60min)[ 12] ,甲醇-水(95∶5)[ 8] , 甲醇-水
(88∶12)[ 13] ,甲醇-水(96∶4 ,98∶2)[ 14] 。
2.1.3 其它流动相 笔者曾试用甲醇-水 、甲醇-乙
腈 、甲醇-乙腈-水及甲醇-四氢呋喃等系统为流动相 ,
均可达到一定的分离效果。
2.2 检测器
2.2.1 紫外检测器(UV Detector) 为最常使用
的检测器 ,通常测定波长选用 210nm ,波长小 ,吸收
强 ,干扰较大;而波长大 ,干扰小 ,吸收强度又较差 ,
所以应根据实际需要选定检测波长。经过衍生化的
菝葜皂苷元检测波长为 230 nm 。
2.2.2 示差折光检测器(Refract ive index detec-
tor , RID) 流动相:甲醇 ,流速 0.9mL/min ,示差折
光检测参照文献[ 4] 。
2.2.3 蒸发光检测器(Evaporative L ight2 scat-
tering Detector ,ELSD) 为一新型通用检测器 ,其
信号响应与被测物的质量成正比 ,而不依赖于被测
物的光学特性及官能团 ,理论上可用于挥发性低于
流动相的任何组分的检测 。ELSD作为一种新型通
用型检测器 ,弥补了 HPLC 传统检测器的不足 ,特
别是对无紫外或紫外末端吸收的大分子有机化合物
的检测 ,具有极大的优越性。王明娟 、金少鸿等[ 15]
综述了 ELSD 在药物分析中的应用 , 沈岚 、朱沪平
等[ 1 6] 应用于测定知母药材及制剂中的菝葜皂苷元 ,
郭继红等[ 8] 以:甲醇-水(88∶12)为流动相 , 流速:
1mL/min ,进样量:20μL ,柱温:室温 ,漂移管温度:
80℃;气体流速:1.99 L/min 。沈岚等[ 7] 以甲醇为流
动相 , 流速:115mL/min;柱温:室温 , 蒸发温度:
100℃,雾化温度:80℃,气体流速比:115;测定菝葜
皂苷元 ,其重现性和精密度较原方法有较大提高 。
·131·　第 6 期 彭全材 等　H PLC 法测定知母中菝葜皂苷元含量的方法探讨
3 讨论
知母药材中菝葜皂苷元并不是最主要的存在形
式 ,通常与糖结合形成皂苷 ,单纯采用乙醇为提取溶
剂 ,采用超声方法提取皂苷类成分 ,难以提取完全 。
在实验前处理中 ,样品要经过适当提取纯化过程 ,尽
可能除去杂质而减少菝葜皂苷元的损失 。笔者经验
表明 ,回流后用 4%氢氧化钠水溶液调节 pH 到 7时
效果较好 ,杂质含量相对较少且过碱菝葜皂苷将溶
解性增强 ,使回收率下降 。如果使用 D101 大孔树
脂分离纯化提取知母皂苷 ,取得的效果更好。根据
文献的溶剂系统以及笔者的试验 ,采用甲醇为流动
相就可达到较好的分离效果 。在检测器选择方面 ,
笔者认为蒸发光检测器(ELSD)较其它几种要优
越 ,主要是由于其信号是溶剂挥发后的溶质粒子 ,流
动相浓度的变化不会引起基线的明显漂移 ,因此 ,样
品前处理的要求就至关重要 ,大孔树脂分离纯化样
品就有其特殊的意义 。
本文进一步完善了药典方法 ,使其步骤中的一
些细节进一步量化 ,详细综述了近 6 年来 HPLC 法
测定知母药材及制剂中菝葜皂苷的前处理方法及色
谱条件 ,对近来应用 HPLC 法测定知母中菝葜皂苷
含量的样品前处理方法和色谱条件的研究情况进行
了介绍和综合分析 ,并制定了样品纯化的基本纯化
流程 ,探索了科学的色谱条件 ,力图为探究菝葜皂苷
元的可靠检测手段提供依据。
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(责任编辑:高红卫)
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(责任编辑:高红卫)
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