全 文 ：第 2 期
收稿日期：2009－10－03
基金项目：云南省大理州科技局资助项目；大理学院药物研究所资助项目（2009yy02）
作者简介：李海峰（1971－），男（白族），云南大理人，副教授，硕士，主要从事药用植物细胞培养及其次生代谢产物的研究，（电话）13170764216
（电子信箱）lihfzh888＠sina．com。
第 49 卷第 2期
2010 年 2月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 49 No.2
Feb．，2010
莲瓣兰（Cymbidium tortisepalum）别名小雪兰、
卑亚兰、菅草兰，是兰科（Orchidaceae）兰属（Cym-
bidium） 植物主要分布在滇西北三江并流区的温带
性地生兰［1］，具有很高的观赏价值和经济价值。但是
由于全球“兰花热”和经济利益的驱使，从上世纪 80
年代至今，经过 20 多年的野生挖掘，野生莲瓣兰种
质资源遭到了毁灭性破坏［2］，野生种质资源濒临灭绝。
多年来，本项目组对莲瓣兰杂交育种、杂交种
子非共生萌发、杂交种子在原生地播种共生萌发及
植株形态发生过程进行研究发现，莲瓣兰种间杂交
亲和性较强， 杂交种子在非共生条件下很难萌发，
但是莲瓣兰杂交种子在原生地播种容易萌发，从播
种到种子被共生萌发菌侵染突破种皮形成类原球
茎只需 6～12 个月， 可是从类原球茎转绿成根状茎
再到完整植株极其缓慢， 一般需要 4～6 年的时间。
为了缩短莲瓣兰原生地共生萌发过程中从类原球
茎到植株形态发生过程，建立稳定的莲瓣兰杂交育
种胚培养及植株再生体系， 达到快速繁殖的目的，
本研究以莲瓣兰大雪素、剑阳蝶杂交种子原生地萌
发突破种皮后的胚为外植体， 探讨氯化汞浓度、灭
菌时间及超声波处理时间对莲瓣兰杂交种子原生
地萌发突破种皮后的胚培养真菌污染控制及胚培
养成活情况的影响，以期为莲瓣兰杂交育种胚培养
及植株再生提供理论依据。
莲瓣兰原生地萌发胚培养真菌污染的控制
李海峰 1，赵志莲 2，张海珠 1，李 明1，刘光明 1
（1．大理学院药学院，云南 大理 671000；2．云南省大理农业学校，云南 大理 671003）
摘要：以莲瓣兰杂交种子原生地共生萌发突破种皮后的胚为材料，研究氯化汞浓度、灭菌时间及超声波
处理时间对莲瓣兰胚培养过程中真菌污染控制及胚成活情况的影响。结果表明，莲瓣兰杂交种子原生地
共生萌发突破种皮后的胚灭菌过程中氯化汞浓度越高、灭菌时间和超声波处理时间越长，胚培养过程中
真菌污染率越低，但是对胚造成的损伤程度高、胚成活率低。 较适宜的灭菌方法是氯化汞浓度 0．20％、灭
菌时间 10～15 min、超声波处理时间 4～6 min，胚污染率控制在 15.0％以内，胚成活率达到 80．0％以上。
关键词：莲瓣兰；胚培养；原生地；真菌污染
中图分类号：S682．31；S432．4＋4 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2010）02－0363-03
Control of Fungal Contamination in Cultivating Germinated Cymbidium tortisepalum
Embryo from Original Habitat
LI Hai－feng1，ZHAO Zhi－lian2，ZHANG Hai－zhu1，LI Ming1，LIU Guang－ming1
（1．College of Pharmacy，Dali University，Dali 671000，Yunnan，China；2．Dali Agriculture School， Dali 671003， Yunnan， China）
Abstract： The germinated Cymbidium tortisepalum embryo from original habitat was used in this paper． The effects of HgCl2
concentration， time of sterilization and time of ultrasonic treatment on the control fungal contamination in cultivating were
studied． The results showed that high concentration of HgCl2， long time sterilization and ultrasonic treatment could reduce the
fungal contermination． However， low survival rate of embryo was also obtained in these harmful conditions． So that the suit-
able approaches were established， including keeping the HgCl2 concentration to 0.20％ ， sterizating about 10 ～15 min and
treating with ultrasonic for 4 ～6 min． In these conditions， the embryo survival and fungal contamination rate were above
80.0％ and below 15.0％， respectively．
Key words： Cymbidium tortisepalum； cultivating embryo； original habitat； fungal contamination
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2010.02.056
湖 北 农 业 科 学 2010 年
1 材料与方法
1．1 试验材料
供试材料为莲瓣兰大雪素 （Cymbidium tor-
tisepalum cv. Daxuesu）、 莲瓣兰剑阳蝶（Cymbidium
tortisepalum cv. Jianyangdie） 杂交种子在原生地共
生萌发突破种皮后的胚为试验材料， 试验于 2008
年 3～12 月在大理学院药学院药物研究所药用植物
细胞培养次生代谢产物中心进行。
1．2 试验设计
氯化汞浓度设为 0．05％、0．10％、0．20％和 0．40％
（对照 ）4 个水平 ， 试验材料用 70％的乙醇灭菌
60 s，再分别用不同浓度的氯化汞溶液（加吐温 80
数滴）灭菌 10 min，无菌水洗涤 5 次，用无菌滤纸吸
干水分备用。 氯化汞灭菌时间设为 5、10、15、20 和
25 min（对照）5 个水平，试验材料用 70％的乙醇灭
菌 60 s，再分别用 0．20％的氯化汞溶液（加吐温 80
数滴） 分别按不同的时间进行灭菌， 无菌水洗涤 5
次，用无菌滤纸吸干水分备用。
超声波处理设为 0 min （对照）、2、4、6 和 8 min
5 个水平 ， 试验材料用 70％的乙醇灭菌 60 s，用
0．20％的氯化汞溶液（加吐温 80 数滴）分别按不同
的超声波处理时间灭菌，无菌水洗涤 5 次，用无菌
滤纸吸干水分备用。
1．3 培养基的配制及培养方法
以改良 RM ［3］作为基本培养基，培养基中分别
添加蔗糖 30 mg ／ L、活性炭 2 g ／ L、香蕉泥 20 g ／ L、琼
脂 12 g ／ L，pH值为 5．8。
培养容器为玻璃试管， 每支试管加入 3 mL 固
体培养基，121℃高压灭菌 15 min， 培养基放置成斜
面冷却。 在无菌操作条件下每支试管接种用无菌滤
纸吸干水分备用试验材料 1 个， 每个处理接种 100
支试管，接种好的外植体在光照强度 1 500 lx、光照
时间 12 h ／ d、25℃的人工气候箱中培养。
1．4 结果统计与分析
培养 20 d 后计算胚污染率，胚污染数指接种胚
中由于胚带菌而被污染数，胚污染率＝污染胚数 ／接
种胚数×100％；培养 60 d 后计算胚成活率，胚成活
数指培养 60 d 后没有被污染的胚转绿成根状茎数，
胚成活率 ＝胚成活数 ／ （接种胚数 －污染胚数 ）×
100％。 所得数据用 SPSS13．0统计软件分析。
2 结果与分析
2．1 氯化汞浓度对莲瓣兰胚培养过程中真菌污染
控制及胚成活情况的影响
如表 1 所示，莲瓣兰原生地萌发突破种皮后的
胚培养过程中， 氯化汞浓度越高胚污染率越低，但
是氯化汞浓度过高对胚造成损伤程度高、胚成活率
较低。较适宜的氯化汞浓度为 0．20％，用 0．20％氯化
汞溶液灭菌时，胚污染率可以控制在 40.0％以内、胚
成活率高达 85．7％，胚成活率显著高于其他处理。
2．2 灭菌时间对莲瓣兰胚培养过程中真菌污染控
制及胚成活情况的影响
如表 2 所示，莲瓣兰原生地萌发突破种皮后的
胚培养过程中， 灭菌时间越长胚受真菌污染率越
低， 但是灭菌时间过长对胚造成损伤程度增加，胚
成活率逐渐降低。灭菌时间在 10～15 min时，胚污染
率可以控制在 40.0％以内、胚成活率在 81．5％以上，
胚成活率显著高于其他灭菌时间。
2．3 超声波处理对莲瓣兰胚培养过程中真菌污染
控制及胚成活情况的影响
如表 3 所示，莲瓣兰原生地萌发突破种皮后的
胚培养过程中，超声波处理时间越长，胚受真菌污
染率越低， 超声波处理时间 8 min 以上时没有污染
现象发生， 但是超声波处理时间过长对胚造成损
伤，胚成活率显著降低。 超声波处理的理想时间是
4～6 min，在此条件下胚污染率可以控制在 15.0％以
内，胚成活率显著高于无处理的对照和超声波处理
超过 8 min的。
3 小结与讨论
莲瓣兰种子在原生地只有被共生萌发真菌浸
表 1 氯化汞浓度对莲瓣兰胚培养过程中真菌污染控制及
胚成活情况的影响
氯化汞浓度
//％
0．05
0．10
0．20
0．40（CK）
接种胚数
//个
100
100
100
100
污染胚数
//个
67
42
37
18
胚污染率
//%
67.0
42.0
37.0
18.0
胚成活数
//个
24
43
54
49
胚成活率
//%
72.7c
74.1b
85.7a
59.8c
注：同列不同小写字母表示差异显著。 表 2，表 3 同。
表 2 灭菌时间对莲瓣兰胚培养过程中真菌污染控制及
胚成活情况的影响
灭菌时间
//min
5
10
15
20
25（CK）
接种胚数
//个
100
100
100
100
100
污染胚数
//个
53
39
35
32
24
胚污染率
//%
53.0
39.0
35.0
32.0
24.0
胚成活数
//个
33
52
53
46
42
胚成活率
//%
70.2b
85.2a
81.5a
67.6c
55.3c
364
第 2 期
的半致死浓度均低于两种农药急性毒性时的半致
死浓度，表现为协同作用。 在农业生产中，如正确使
用以上两种杀虫剂对两栖类动物的生长发育影响
较小。 由于联合毒性作用大于急性毒性，应避免农
药使用不当给水体造成较大的污染，使水体中积累
的农药达到对两栖类产生危害的程度。
参考文献：
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急性毒性［J］．南昌大学学报，2005，29（5）：493－496．
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动物学杂志，1990，25（1）：32－34．
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1994，13（3）：269－271．
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国家环境保护局，1989．
表 3 超声波处理对莲瓣兰胚培养过程中真菌污染控制
及胚成活情况的影响
超声波处理时间
//min
0（CK）
2
4
6
8
接种胚数
//个
100
100
100
100
100
污染胚数
//个
43
27
13
12
0
胚污染率
//%
43.0
27.0
13.0
12.0
0.0
胚成活数
//个
46
61
76
76
71
胚成活率
//%
80.7c
83.6b
87.4a
86.4a
71.0c
染，通过共生真菌把胚和基质连接起来，共生真菌
为胚提供营养物质， 促进胚的发育及突破种皮萌
发。 以突破种皮后的胚作为外植体进行胚培养，因
为外植体不仅受外界真菌的污染，还受侵入种胚内
生真菌的污染，按照植物组织培养中传统的灭菌方
法进行灭菌处理外植体，很难控制胚培养过程中的
真菌污染，所以外植体的灭菌是莲瓣兰胚培养快速
繁殖成败的关键。 氯化汞是植物组织培养外植体灭
菌效果最好的灭菌剂 ［4］，但是氯化汞对外植体的损
伤程度较大，因此，在灭菌过程中要严格控制氯化
汞溶液的浓度和灭菌时间。 从本试验结果可知，氯
化汞浓度较低时胚污染率较高、 胚成活率较低；氯
化汞浓度较高时胚污染率降低，但是对胚的损伤较
强、胚成活率较低；灭菌时间较短时胚污染率高、胚
成活率较低，灭菌时间较长时胚污染率较低，但是
对胚的损伤较强、胚成活率较低。肖显华等［5］的研究
发现超声波处理苹果、月季和紫杉的枝条能降低组
织培养的污染率，与本试验结果相似，超声波处理
对胚污染率控制显著高于无处理（对照），超声波处
理时间越长胚污染率越低，超声波能使杀菌剂进入
细胞内，对内生真菌具有很好的杀菌作用，但是超
声波对细胞的损害作用也很大，对胚成活率的影响
极其显著，所以超声波处理时间要严格控制。
研究结果发现， 用 0．20％氯化汞溶液灭菌 10～
15 min及超声波处理 4～6 min 能有效控制莲瓣兰杂
交种子原生地共生萌发突破种皮后的胚培养过程
中的真菌污染，胚污染率可以控制在 15．0％以内、胚
成活率超过 80．0％。 接种在培养基中莲瓣兰杂交种
子原生地共生萌发突破种皮后的胚，胚污染主要发
生在两个阶段，培养 6～10 d 主要是胚表皮的外生真
菌污染， 培养 15 d 以后主要是胚内生真菌污染，没
有被污染或灭菌杀死的胚再经过 30～40 d 的培养，
胚能转绿成根状茎。 而对其他杀菌剂、培养基添加
抑菌剂等影响因子有待于进一步研究。
参考文献：
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（上接第 355页）
李海峰等：莲瓣兰原生地萌发胚培养真菌污染的控制 365