全 文 ：第 ３８ 卷第 ６ 期河北 农 业 大 学 学 报Ｖｏ ｌ ．３ ８Ｎｏ ．６
２０ １ ５年１ １月 ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＨＥＢＥ ＩＮｏｖ ．２０１ ５
文章编号 ： １ ０ ００－１ ５ ７３ （２ ０ １ ５ ） ０ ６ － ００ ０ １－ ０ ６ＤＯＩ ：１ ０． １ ３３ ２０／ｊ ． ｃｎｋｉ ． ｊ ａｕｈ ． ２０ １ ５ ．０ １ ２ ６
白粉病菌诱导的卵穗 山羊草叶片 ｃＤＮＡ
文库构建和分析
王亚 娟 ， 张 宏 ， 陈 雪 燕 ， 付 颖 ， 王长 有 ， 刘 新伦 ， 吉 万全
（西北农林科技大学 农学院 ／旱 区作物逆境生物学 国家重点实验室 ，陕西 杨凌 ７ １ ２ １ ０ ０ ）
摘要 ： 为了 获得卵穗山 羊草 （Ａｅ抑吵 Ｌｏ ｓｓ ）与 白粉病抗性相关的 基因 ，本试验构建 了 白粉菌生理小
种 Ｅ０９ 诱导后的 卵 穗山 羊草 １ ２ ， ２４ ， ３ ６ ， ４８ 和 ９６ ｈ 的苗期 叶片混合 ｃＤＮＡ 文库 。 从 文库 中 随机挑取 阳性克隆
经 ＰＣＲ 检测 ，测序后利用 ＤＮＡＳ ｔａｒ 软件对所获 ＥＳＴ 序列进行 聚类 拼接 ， 得到 ４ ０９ 个 ＥＳＴ 序列 ， 在聚类结果
中 ， ＥＳＴ 序列 的片段大小在 ２０ ５￣１５ ７４ｂｐ 之间 ， 平均为 ５ ３ ６ｂｐ ； ４０ ９ 条 ＥＳＴ 序列 中 ， ４ ４ （ １ ０ ．７ ６％ ）条未找到 同源
性 的蛋 白序列 ， ３ ６５ （ ８９ ．４ ４％ ） 条找到 同源性较高 的蛋 白 序列 ， 其 中 ３０７ 条 已 知蛋 白功 能 ； 对 已 知功能 的序列运
用 Ｐａ ｔｈｗａｙ 软件进行功能分类 ，主要涉及细胞进 程 ３４ 条 （ ８ ．３ １％ ） 、环境信息 ５５ 条 （ １ ３ ． ４ ５％ ） 、抗病 防御 ４６ 条
（ １ １ ．２５％ ） 、 遗传信息 ３ ３ 条 （ ８ ． ０７ ％ ） 、新 陈代谢 １ ２７ 条 （ ３ １ ．０５％ ） 、 生物有机体 １ ２ 条 （ ２ ． ９３％ ）和假定蛋 白 ５８ 条
（ １ ４ ．１ ８％ ） 。 这些 ＥＳＴ 序列为 卵穗 山 羊草 白粉病抗性相关基因 的获得和抗病机制的研究奠定了 基础 。
关 键 词 ： 卵穗 山羊草 ； 白粉病菌 ｉ ｃＤＮＡ 文库
中 图分类号 ： Ｓ５ １ ９文献标志码 ： Ａ
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄａｎａ ｌｙｓｅｏｆｃＤＮＡｌ ｉｂｒａｒｙｏｆＡｅｇｉｌｏｐｓｇｅｎｉｃｕｌａ ｔａＬｏｓｓ
ｌｅａｆｉｎｏｃｕｌａｔｅｄｗ ｉｔｈＢｌｕｍｅｒｉａｇｒａｍ ｉｎｓｆ．ｓｐ ．Ｔｒｉｔｉｃｉ
ＷＡＮＧＹａ－ｊｕａｎ ，ＺＨＡＮＧＨｏｎｇ ，ＣＨＥＮＸｕｅ－ｙａｎ ，ＦＵＹ ｉｎｇ ，
ＷＡＮＧＣｈａｎｇ－ｙｏｕ ，ＬＩＵＸ ｉｎ－ｌｕｎ ，ＪｌＷａｎ－ｑｕａｎ
（ Ｃｏｌ ｌｅｇ ｅｏｆＡｇ ｒｏｎｏｍ ｙ ，Ｎ ｏｒ ｔｈｗｅｓ ｔＡｇ ｒｉｃｕ ｌｔｕ ｒｅａｎｄＦｏ ｒｅｓ ｔＵｎ ｉｖｅｒｓｉｔ ｙ／Ｓ ｔａ ｔｅＫｅｙ
Ｌａｂｏｒ ａ ｔｏｒｙｏｆＣ ｒｏｐＳｔｒｅｓ ｓＢｉｏ ｌｏｇ ｙｉｎ Ａ ｒｉｄＡｒｅａｓ ，Ｙａｎｇ ｌｉｎｇ ７ １ ２ １ ００ ，Ｃｈ ｉｎａ ）
Ａ ｂｓ ｔｒａｃｔ ；Ｔｏｔ ａ ｌＲＮＡｗａｓｅｘ ｔｒａｃｔ ｅｄｆｒｏｍ ｉｎｏｃ ｕｌ ａ ｔ ｅｄｗ ｉ ｔｈＢｇｔａ ｔ１ ２ ，２４ ｆ３ ６ ，４８ａｎｄ９６ｈｏｆ
Ａｅｇｉｌｏｐｓｇｅｎ ｉｃｕ ｌａ ｔａＬｏｓ ｓｌｅａｖ ｅ ｓ ，ｅｑ ｕａ ｌｃ ｏｎｃ ｅｎ ｔ ｒａ ｔ ｉｏｎｏｆａｍｏｕｎ ｔｏｆｗｈ ｉ ｃｈｔｈｅｎｗｅ ｒｅｍｉ ｘｅｄａ ｓ
ｒｅｖｅｒｓ ｅｔ ｒａｎｓｃ ｒｉｐｔ ｉｏｎｔｅｍｐ ｌａ ｔｅ ，ｒｅ ｓｐ ｅｃ ｔｉｖｅ ｌｙ．Ｔｈ ｅｃＤＮＡｌ ｉｂｒａｒｙｗａｓｃｏｎｓｔ ｒｕｃ ｔ ｅｄ．Ａ ｆｔｅｒ
ｓｃｒ ｅｅｎｉｎｇｒ ｅｐ ｅａｔ ｅｄａｎｄｒｅｄｕｎｄａ ｎｃｙｓｅｑｕ ｅｎｃｅ ｓ ，４０９ｕｎ ｉｇｅｎｅｓｗｅ ｒｅｏｂ ｔａ ｉｎｅｄ ．Ｂ ｌａ ｓｔＸａｌ ｉｇｎｍｅｎ ｔ
ｉｎｎｒ－ｐｒｏ ｔｅ ｉｎｄａ ｔａｂａｓｅ ｒｅｖ ｅａｌ ｅｄ ｔｈａ ｔ ３６５ （ ８ ９ ．４４％ ）ｕｎ ｉｇｅｎｅｓｐｒｅｄ ｉｃ ｔｅｄｇｅｎｅ ｓｗｅ ｒｅ ｈｉｇｈ ｌｙｓｉｍ ｉ ？
ｌａｒｉ ｔｙｔｏｋｎｏｗｎｐｒｏｔｅｉ ｎｓ ．Ｕ ｓｉｎｇ Ｐａｔｈｗ ａｙｓｏｆ ｔｗ ａｒｅ３０７ｕｎ ｉｇｅｎｅ ｓｗ ｉｔｈ ｋｎｏｗｎ ｆｕｎｃｔ ｉｏ ｎｉｎｖｏｌｖｅｄ
ｉｎｃｅｌ ｌｕ ｌａ ｒｐｒｏ ｃｅ ｓｓ ｅｓ （ ８ ．３ １％ ） ， ｅｎｖｉｒｏ ｎｍ ｅｎｔ ａ ｌ ｉｎｆｏｒｍａ ｔ ｉｏｎｐｒｏｃ ｅｓ ｓｉｎｇ （ １ ３ ．４５ ％ ） ， ｇｅｎｅ ｔ ｉｃ ｉｎ ｆｏｒ －
ｍａｔ ｉｏｎｐ ｒｏｃｅ ｓｓ ｉｎｇ （ ｌ ｌ ．２５％ ） ， ｄｅｆｅｎｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅ （ ８ ．０７％ ） ， ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（ ３１ ． ０５％ ） ， ｏｒｇａｎｉｓｍａ ｌ
收稿 日期 ： ２０ １ ５－ ０ ６ － ３０
基金项 目 ： 国 家 自 然科学基金 （ ３ １ ４ ７ １４ ８ １ ） ； 陕西 省 自然 科学基金 （ ２０ １５ ＪＱ３０ ７８ ） ； 西北农林科 技 大学基本 科研业 务 费
（ ２０ １ ４丫６０ ８０ ， ２４ ５２０ １ ５ ２６８ ） ； 西北农林科技大学博 士启 动经费 （２ ０ １ ３３３ ＞｜ １１ ０５ ６ ） ．
作者简介 ： 王亚娟 （ １ ９ ７ ６ － ） ，女 ， 陕西省扶风人 ，博士 ，助理研究员 ，主要从事小麦种质资 源研究与利用 ．
Ｅ－ｍａ ｉ ｌ ：ｗ ａｎｇｙｊ ７ ６０４＠ １ ６３ ． ｃｏｍ
通讯作者 ： 吉 万全 （ １ ９ ６３ － ） ，男 ， 陕西省合 阳人 ，博士 ，主要从事小 麦遗传育种工作 ． Ｅ－ｍａ ｉ ｌ ：ｊ ｉｗａｎｑ ｕａｎ２０ ０ ３＠ １ ２ ６ ． ｃｏｍ
２

河北农 业 大 学 学 报

第 ３８ 卷
ｓｙｓｔｅｍｓ （ ２ ．９ ３％ ） ，ｈｙｐｏｔｈｅｔｉ ｃａ ｌｐｒｏｔ ｅｉｎ （ １ ４ ．１８％ ） ，ｎｏｓｉｇｎｉ ｆｉｃａｎｔｓｉｍ ｉ ｌａｒｉ ｔｙｆｏｕｎｄ （ １０ ．７６％ ） ．
ＴｈｅｓｅＥＳＴ ｌａｙｔｈｅｆｏｕｎｄａ ｔ ｉｏｎｆｏｒｌａｔｅ ｒｒｅｓ ｉ ｓｔ ａｎｃ ｅｒｅ ｌａｔ ｅｄｇｅｎｅｉｄｅｎ ｔ ｉｆ ｉ ｃａｔ ｉｏ ｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ ：Ａ ｅｇ ｉｌｏｐｓｇｅｎ ｉｃｕｌａｔａＬｏｓ ｓ ； Ｂｌｕｍｅｒｉ ａｇｒａｍ ｉｎ ｓｆ．ｓ ｐ ．７Ｖ＂ ｉｃｆ； ｃＤＮＡ ｌ ｉｂｒａｒｙ
小麦 白 粉病是世界小麦产区均有发生的重要病得 ９４ 条 ＥＳＴ 序列 ， 反交文 库中 获得 ５ ９ 条 ＥＳＴ 序
害 ，病害流行时 ，可致受害小麦减产 ３０ ％ 以 上 ，甚至列 ，这些序列 的功能进行分析 ，主要包 括能量代谢 、
绝收 ，且还导致小 麦 品种质量 的 下降 。 小麦病害 的初级代谢 、 、 蛋 白 质合 成加 工与储藏 、转 运 、 细胞结
防治主要通过化学 手段 和种植抗病品 种 ， 将小麦近构 、转 录信号转导 、及抗病 防御 ［ １ ° ］ 。 与 已 有的 构建
缘种属 中的优异基因导人普通小麦是增加小麦的遗白粉病文库研究相 比 ， 本研究的材料来源于卵穗 山
传多样性 、拓宽小麦育种遗传基础 和改 良 小麦品种羊草 ，与其他的研究材料不同 ，其中可能还有不 同于
的重要途径 。 目 前在小麦的近缘种属 中发现了多个它们新的抗病相关基因 ，有很重要 的研究价值 。
抗白粉病基因 ，来 自 小麦近缘属的有 １ ５ 个基因 ［Ｈ２ ］ ；本研究 利用 １ 份 抗 白 粉 病 卵 穗 山 羊 草 （Ａ ｅ ．
来 自 于小麦近缘种 的有 １ ９ 个基 因 ［３ ］ 。 卵 穗山羊草 在不 同 接种 时间 的 叶 片 ＲＮＡ 混合样
（Ａ切 Ｌｏｓ ｓ）是山羊草属 中的一个异品 ，利用 Ｔ ａｋａ ｒａ 的试剂盒构建 白 粉病菌 Ｅ０ ９ 诱导
源四 倍体种 （ ２ｎ＝ ４ ｘ ＝ ２８ ） ， 染 色体构 型为 卵穗 山羊草 ｃＤＮＡ 文库 ，在转 录水平上对卵穗 山羊
Ｍｇ ｒＡ私 ，其含 有 丰 富 的抗病基 因 ［ ４＿５ ］ 。 Ｋｕ ｒａｐ ａｒｔｈｙ草抗 白 粉病机理进行分析 ， 以期获得卵穗 山羊草与
等在卵 穗山羊草中 同时获得抗条锈 病基因 Ｙｒ４０ 和自 目 。
抗叶锈病基 因 Ｌｒ５７ｗ ； Ｐｍ ２９ 是 现在 唯一发现与 卵、°
穗 山羊草有关的抗 白粉病基因 ［？ 。１ 材料 与 方法
ｃＤＮＡ 文库代表一定时期正 在表达 的 １ ５ ％左丨 ｉ 试验材料
右的翻 ，是真核生物 ｍＲＮＡ 集群 的 ＤＮＡ 拷贝 集
．
＿山羊草 （Ａｅ ． 讲―ｔｏ ） ＳＹ １ ５ ６ 种子 由 中
国农科院作科醉立会博士和杨欣 明老师提供 ，播其 ｃＤＮＡ 克隆 的复杂程度 比直接从基 因组克 隆帛 种于直径 １ 〇 啦 的小花盆中 ，罩 以透明 的卷成筒状
士＝ ， 因此在基 因 投影胶片 ，顶端用 ３一 ４ 层纱布封 口 ， 防止空气 中 其
驗菌落人 ，放置于 ２５以工培养箱培养 （ 光照 １ ６组特定表达状态和鉴定基 因 功能表达方面具有特殊   
优势 ， 因此 ｃＤＮＡ 文库的构建和筛选 是基 因克隆 的＝ ＞°
重要手段之－ ，耐 ，也錄撕細麵縣财 力供试菌种 。 細娜法接种 ’用 陕优 ２２ ５
’扩繁
的 Ｅ０９ 菌种髙密度抖落于第 ２ 片 叶完全展开的供
陈秀珍构建了含有 Ｐｍｌ ６ 的近等細系 白粉病 獅料 灯 １ ５６ 叶片上 。 菌种 Ｅ〇 ９ 由 中 国农业科学
菌诱导的 ｃＤＮＡ 文库 ，获得 了 ２ １ ６紐量好 的 ｃＤ－ 院植物保护研究所段霞瑜研究员 提供 ，本 实验室繁
ＮＡ 序列 ，通过功能分析 ，这些序列包括小 Ｇ 蛋 白 类胃＃＃ 。
基 因 、起识别病原 菌作用 的 Ｒ 基因 、参与信号传导 １ ２
的激酶 、离子通道成分 、过敏反应诱导产生 的蛋 白 、试验共设 ７ 个时 丨司 点 ， 接种 白 粉菌 Ｅ０９ 后 ， 在
调节基因表达的转录 因子 、参与细胞壁代谢的蛋 白 、 １２ ， ２４ ， ３６ ， ４８ ， ７２ 和 ９ ６ｈ 采集 ＳＹ １ ５ ９ 叶片 ，放人锡
参与防卫反应的蛋 白 、非寄主抗性有关 的蛋 白 和与 箔纸中 ， 液氮速冻后转移到 一８ （ＴＣ超低温冰箱保存
基础 防御 ［７ ］ 。 陈雅 平构建含有 Ｐ？ｉ２ １ 的 小麦 ／簇毛备用 。 采用 Ｔ ｒｉｚｏＫＩｎｖｉ ｔｒｏｇｅｎ） 试剂提取总 ＲＮＡ ，
麦 ６ＶＳ／ ６ＡＬ 易位系 白粉菌诱导的 叶片 ＳＳＨ 文库 ， 经核酸蛋 白 仪检测 纯度和浓度 ， 用 １ ．〇％琼脂糖凝
获得 ５００ 个 阳性克隆 ， 对其 中部分克隆测序 ，并 与胶电泳检测总 ＲＮＡ 的 完整 性 。 用 Ｔａｋａｒａ 的试剂
ＧｅｎＢａｎｋ中 的序列进行ＢＬＡＳＴ分析 ，获得１２个与盒 （ｃＤＮＡＬ ｉｂｒａｒｙＣｏｎｓ ｔｒ ｕｃ ｔｉｏｎＫ ｉ ｔ ，编号 Ｄ６ １ ３５ ）构
抗病相关的 ＥＳＴ 序 列？ 。 吴金华构建 了来 自 于黑建 ｃＤＮＡ 文库 。 包括 ｃＤＮＡ 第 １ 链和第 ２ 链 的合成
麦的 Ｎ９４ ３６－１ 的 ＳＳＨ－ｃＤＮＡ 文库 ， 正交文库获ＡｄａｐｔｏｒＬｉｇａｔｉｏｎ 限制酶 ＮｏｆＩ 酶切反应 使用 Ｓｐｉｎ
第 ６ 期

王亚娟等 ： 白 粉病菌诱导 的 卵穗 山羊草叶片 ｃＤＮＡ 文库构建和分析

３
＾
Ｃｏｌｕｍｎ 除去短链 ｃＤＮＡＶｅｃ ｔｏｒＬｉｇａ ｔ ｉ ｏｎ 质粒转化 。 获得的第 ２ 链 ｃＤＮＡ 用 １ ％的琼脂糖检测 （ 图 ２Ａ ） ，
１ ． ３ｃＤＮＡ 与 载体的 连接转化 及菌落 ＰＣＲ 鉴定 ２ ５０ｂ ｐ 以 上呈弥散状 ，并且 ２５ ０ ￣５０ ０ｂ ｐ 之 间 条带
将 电 击 转 化 的 菌 液 转 移 至 培 养 用 Ｔｕｂ ｅ 中较亮 ，对短链除去后 的 ｃＤＮＡ 用 １ ％ 的琼脂糖检测
（ＦＡＬＣＯＮＴｕ ｂｅ 等 ） ， ３ ７ ？（： （使用 １ｍＬ 的 ＳＯＣ 培（ 图 ２Ｂ ） ，继续呈弥散状 ，在 ５ ００￣ １３００ｂｐ 之间条带较
养基 ） 振荡培养 １ｈ 。 取部分培养液 １ｙＬ 和 １ ０ ｆｉＬ亮 ，说明 ｃＤＮＡ 合成效果较好 。 可以进行后续试验 。
涂布于 ＬＢ ／Ａｍ ｐ 琼脂平板培养基上培 养 ， ３ ７＇Ｃ过 ２ ｃｏｏｂＰ
夜培养 ， 剩 余 的 培 养液 于 ４°Ｃ 保 存 。 第 ２ 天 计数ｉ ＾ｏ＾ｐ
ＬＢ／Ａｍｐ培养基上鋪数 ，获得ｃＤＮＡＰＨｍ ａ ｒｙ－Ｌｉ － 翌成
ｂｒ ａｒｙ效 率 。 使 用Ｔ ７引 物 （ ５ ’ －ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴ －ｄ
ＣＡＣＴＡＴＡＧＧ０３ ’ ） 及Ｔ ３引 物 （ ５ ’ －ＡＴＴＡＡＣ－ Ｍ１２３４５Ｍ６Ｍ
Ｍ ：ＤＬ２ ０ ００ ； １ ： １２ｈ ；２ ： ２ ４ｈ ；３ ： ３ ６ｈ ；４ ： ４８ ｈ ；ＣＣＴ ＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＣＧ￣３ ’ ） （ 载体ｐＡＰ ３ｎｅｏ ） 进行＾５ ： ９ ６ ｈ ； ６ ： 混合总ＲＮＡ
单克隆 ＰＣＲ 反应 ， 确认本 ｃＤＮＡ 文库分布情况 。图 １ 琼脂糖凝胶 电泳检测 时间 点总 ＲＮＡ 和 混合 总 ＲＮＡ
１ ．４ｃＤＮＡ文库 原始文库滴度 测疋 Ｆ ｉｇ．１Ａｇａｒｏｓｅｇｅ ｌｅ 丨ｅ ｅ ｔ ｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆ ｔｏｔａ ｌＲＮＡ
计算公式 ：总克隆数 ＣＦＵ ＝ 平板上的克隆数 Ｘ
稀释倍数Ｘ １ ０ ３ ｍ Ｌ 。２ 〇ｏ〇 ｈ Ｐ＾＾＾＾Ｈ
１ ． ５ 插入服？组韩全长關游分析
对挑取 的
｜
５日 性文 库克 隆 ，臓 体上 的 引 物 Ｔ ７５：：ＨＩ及 Ｔ ３ 引物为测序 引 物 ， 如果扩增 片段小 于 ８０ ０ｂｐ２５〇 ｉ ＞ ｐ＾９＾Ｂ ｉｉ ［；！ ；２ ５０ ｂＰ用 Ｔ ７ 引 物 测 序 ， 如 果扩增 片 段大于 ８ ００ｂｐ 用 Ｔ ７ ｉ〇〇 ｂ ｐ＾＾＾｜ ｉ ｏ〇 ｈ＾
和 Ｔ ３ 引 物双 向 测序 ， 测 得的 序列拼接后与数 据 库 ＡＢ
数据进行比对 。 对所获序列进行引物 、 接头 、载体序Ａ ：ｃＤＮＡ 第 ２ 链 ； Ｂ ： 除去短链 ｃＤＮＡ 第 ２ 链
列 去除后 ， 利 用 ＣＡＰ ３ 及 ＤＮＡｓ ｔａ ｒ７ ．１ ０ 软件 去 除 图 ２ｃＤＮＡ 第 ２ 链 １ ％琼脂 糖检测
冗余序列 、载体序列 和重复序列 以及低于２ ００ｂｐ的Ｆｉｇ ．２Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌ ｅｃ ｔｒｏｐ ｈｏ ｒｅｓ ｉｓ ｏｆｔｈ ｅｓｅｃｏｎｄｃＤＮＡｃｈ ａｉｎ
序列 ， 将高质量的 ＥＳＴｓ 序列 聚类成 Ｃｏ ｎｔ ｉ ｇｓ 和 Ｓ ｉｎ －２．２ｃＤＮＡ 文库 的质量鉴定
ｇ ｌ ｅ ｔｓ ，最 后将 ＥＳＴ 提 交 ＧｅｎＢ ａｎｋ 数 据 库 。 利 用从转化后细菌原液 （ １ｍＬ ） 中分别取 出 １Ｍ Ｌ 和
ＮＣＢＩ 的 ＢＬＡＳＴ 序列 比对工具在 Ｇ ｅｎＢａｎｋ 的非冗１ 〇ｙＬ ，稀释到 ３００ＭＬ 后各取 １０ｐＬ 均匀 的涂 布在
余蛋 白质数据库进行 ＥＳＴ ｓ 的 Ｂ ｌａ ｓ ｔ ｘ 比对分析和 在加有氨节的平板培养基上 ，第 ２ 天计数培养基上 的
ｄｂＥＳＴ 核酸数据库 中 进行 ＥＳＴ ｓ 的 Ｂ ｌ ａ ｓ ｔ ｎ 同源性菌落数 ， １ｙＬ 的 平板 中单克 隆数为 ６ ８ 个 （ 图 ３Ａ ） ，
检索分 析 。 按 照 Ｕ ［ｕ］ 的 方 法 筛选 Ｂ ｌａ ｓ ｔ 比对 结１ 〇 ｆｘＬ 平板上单克隆数为 ５ ０ ９ 个 （ 图 ３Ｂ ） ，计算其原
果显著 的序 列 ， 按 照 Ｂｅｖａｎｓ ［ １２ ］ 的方 法 对 ＥＳＴ 功始文库滴度为 １ ． ７ ８４ Ｘ １ ０ ６ ，在平板上挑取 ２ ４ 个单克
能进行分类 。隆 ，对插人片段 ＰＣＲ 扩增结果显示插人片段的平均
２＜ 果 与 为 析
（ 图 ４ ） 。 说明 构建的 ｃＤＮＡ 文库质 量较好 ， 可 以进
２ ．１ 总 ＲＮＡ 的提取及质量检测行后续试验 。
用 Ｔ ｒ ｉｚｏ ｌ 方法提 取 白 粉菌 Ｅ０ ９ 诱 导不 同 时 间
叶片的 总 ＲＮＡ ，用核 酸蛋 白仪 检 测 构建 ｃＤＮＡ 文
库的 小麦 叶 片 总 ＲＮＡ 的 结果为 ， Ａ２ ６０／Ａ２ ８０ 值在
１ ． ８ ￣ ２ ． ０之间 ， Ａ２ ６ ０ ／Ａ ２ ３ ０值大于２ ．０ 。 根据检测
浓度 ，把各时 间段等 浓度等量 的 ＲＮＡ 混合成总 Ｋ
ＲＮＡ ， 以 １ ％琼脂糖凝胶检测 总 ＲＮＡ 。 总 ＲＮＡ 的
２８Ｓ 和 １ ８Ｓ 条 带完 整 ， 二者浓 度 比 约 为 ２ ： １ ， 说 明图 ３ 涂板检 测初级文库克 隆数
ＲＮＡ完整性好 （ 图 １ ） ， 可 以满足后续试验要求 。 将Ｆ ｉｇ ．３Ｐ ｌａ ｔ ｉｎｇｔ ｅｓ ｔｏｆｔｈ ｅｃ ｌｏｎｅｓｏｆ ｐ ｒｉｍａｒｙｌ ｉ ｂｒａｒｙ
河北 农 业 大 学 学 报

第 ３ ８ 卷
■ Ｃｏ Ｕ ｕ Ｉ ．ｖ Ｐｋｘ ｏｓｓｏ ｓ
， ＜ｘ ）〇 ＾
，ｓｐ＾ａ 〇７％Ｍ
，
１２３４５６７８９ １０ １ １ １２ １３１ ４１ ５１ ６ １ ７ １ ８１ ９２０２１ ２２ ２３２４ Ｍ ２２Ｊ３＾ｔ＾■ Ｍｅ ｔ ａｂｏ ｌ ｉｓｍ
ＤＬ １ ０００ ； 卜 ２４ ：ＰＣＲ产物 ． ． Ｏｒ ｇ ｏｎ ，＾ ． Ｓｙ ｓｔｅｍ ｓ
图 ４ 挑取初 级文 库 中 ２ ４ 个 单克 隆进行 ＰＣＲ
并用 琼脂酿雜 Ｍ關３咖 ＇ ｈ ｖ＿ ＇＿ｍ
Ｆｉ ｇ ．４ＰＣＲｐ ｒｏｄｕｃｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒａ ｎｄｏｍ ｌ ｙｓ ｅ ｌｅｃ ｔｅｄ２ ４ｃ ｌｏｎｅｓ ｏｆ ■ ｎ〇  ｓ ｉｇｎ ｉｆｉ ｃ ａｎ ｔ ｓ ｉｍ ｉ ｌａ ｒ ｉｔ ｙ  ｆｏ ｕｎ ｄ
ｐｒ ｉｍ ａｒｙｌ ｉ ｂｒａｒｙｗｅ ｒｅｄｅ ｔ ｅｃ ｔｅｄ ｂｙｇｅ ｌｅ ｌｅ ｃｔ ｒｏｐ ｈｏ ｒｅ ｓｉｓ图５Ｂ ｌ ａｓ ｔｘ比对结 果 的Ｅ ＳＴｓ 分类及其所 占 比例
２ ．３ｃＤＮＡ文库ＥＳＴ序列 的 比对分析Ｆｉ ｇ ．５Ｔｈ ｅｐ ｉ ｅｃｈ ａ ｒｔ ｓｈ ｏｗｓ ｔｈｅｐ ｒ ｏｐｏ ｒｔ ｉｏ ｎｏｆｐ ｒｅｄ ｉｃ ｔ ｅｄ
从文库 中 随机挑取的 阳性克隆经 ＰＣＲ 检测 ，筛ｇｅｎ ｅｓｗ ｉ ｔｈａｓ ｓｉｇｎ ｅｄｃｅ ｌ ｌ ｕｌ ａｒｒｏ ｌｅｓ
选到 ６ ５〇 个阳 性克隆 ，有 ４ ５ 个片段大于 ８ 〇〇ｂｐ ， 经３讨论测序后获得 ５ ３６ 条 ＥＳＴ ｓ 序 列 。 利 用 ＤＮＡＳ ｔａｒ 软
件对所获 ＥＳＴ 序列进行聚类 拼接 ，得到 ３ ５ １ 个重叠３． １ｃＤＮＡ 文 库质量的 评价分析
群 （Ｃ ｏｎｔ ｉｇ ｓ） （ 由 ２ ￣ ７ 条 ＥＳＴ 组成 ） 的 ４０９ 个 ＥＳＴｓ—般植物 ｍＲＮＡ 的 片段大小主 要介于 ０ ？５￣
序列 。 在聚类结果中 ， ＥＳＴ 序 列 的片段大小在 ４００￣３ ． ０ｋｂ ， 通常 以 ｍＲＮＡ 为 模版 反转 录合成 的 全长
１５ ７４ｂ ｐ 之间 ， 片段平均大小为 ５ ３ ６ｂ ｐ 。ｃＤＮＡ 也是分布在 ０ ．５￣ ３ ．０ｋｂ ，这样才能保证构建
在非冗余蛋 白 质数据库 同源性 比对结果表 明 ， 的 ｃＤＮＡ 文 库包含 ｃＤＮＡ 全 长 的几 率更 高 ［ １ ３？ ］ 。
４０９ 条 ＥＳＴ 序列 中 ， 没有找 到 同 源性的蛋 白 序列 ４４本 次试验 中 ， 将第 ２ 链 ｃＤＮＡ ｌ％ 琼脂糖凝胶 电 泳
条 ， 占 １０ ．７ ６ ％ ， 找 到 同 源性较 高 的 蛋 白 有 ３ ６ ５ 条后 ， 通过试剂盒使用 Ｓｐ ｉｎＣｏ ｌｕｍｎ 除去短链 ｃＤＮＡ ，
ＥＳＴ （ ８９ ．４４ ％ ） ，其 中 已 知蛋 白 功能 的 ＥＳＴ 序列 ３ ０ ７电泳效果如 图 ２Ｂ 所示 ，第 ２ 链 ｃＤＮＡ 条带主要集
条 （ 图 ５ ） 。 对 已知 功能的序列运用 Ｐａ ｔ ｈｗａｙ 软件进中 在 〇 ？５￣１ ．３ｋｂ 区域 ，条带呈均匀弥散状 、 亮度较
行功能分类 ， 主要涉及 细 胞进程 ３４ 条 （ ８ ．３ １ ％ ） 、环高 ，说明得到 了较高 质量的第 ２ 链 ｃＤＮＡ ， 可 以进行
境信息 ５ ５ 条 （ １３ ．４５ ％ ） 、抗病防御 ４６ 条 （ １ １ ．２５ ％ ） 、遗后续试验 ；评价构 建的一个 ｃＤＮＡ 文 库是否有实用
传信息 ３ ３ 条 （ ８ ．０７％ ） 、新陈代谢 １ ２ ７ 条 （ ３ １ ． ０５ ％ ） 、生价值主要 在于该 文库 的代表 性和 重组 ｃＤＮＡ 片 段
物有机体 １ ２ 条 （ ２ ．９ ３％ ） 、假定蛋 白 ５ ８ 条 （ １４ ．１８％ ） 。完 整性 ， 主要通过滴度 大小 、 插人片段大小 、长 片段
在这 ６ 个大类 中 又分成不 同 的亚类 ，在 ３ ４ 条细所 占 比重及 重组率等指标来判定 ［ １ ５＇ １ Ｓ ］ ， 还有 ， 所构
胞进程中 ， 又包括细胞生长 和死亡 （ Ｃｅｌ ｌｇ ｒｏｗ ｔ ｈａｎｄ建的 文库中 必须有 足够多 的克隆数 ， 才能 确保 基 因
ｄｅａ ｔｈ ） 的 ２ ２ 条 ，转录 和分解代谢 的 １ ２ 条 ； 环境信息组 ｃＤＮＡ 中 的每 一 个序 列 至少有一个拷 贝 存 在于
分类 中包括两类 ，一类是膜运输功 能 ， 有 ２ １ 条 ，信号重组文库 中 ， 为达 到这个标准 ， 文 库 的滴 度 大小应
转导功能 ３ ４ 条 。 在遗传信息分类 中有折叠 、排序和不小于 １ ． ７ Ｘ １０ ５Ｗ 。 本试验 构建的 ｃＤＮＡ 文 库滴
退化的有 １ １ 条 ， 有 排序 和 降解功 能 的有 ３ 条 ， 有翻度 １ ． ７ ８４ Ｘ １０ ６ ，筛选 到 ６ ５０ 个 阳性克 隆 ， 有 ４５ 个片
译和转录功能的 １ ９ 条 。 在新陈代谢中 ，有氨基酸代段大于 ８００ｂ ｐ ， 在 聚类结果 中 ， ＥＳＴ 序 列 的 片 段大
谢 ５ 条 ，有次生代 谢物质 ８ 条 ，碳水 化合物 代谢 ３ ７小在 ４ ００￣ １５ ７ ４ｂｐ 之间 ， 片段平均大小为 ５ ３ ６ｂｐ 。
条 ，能量代谢 ６ ４ 条 ， 多糖生物合成和代谢 ４ 条 ，脂类说明构 建 的 白 粉病菌诱导 的 卵穗 山 羊 草 ｃＤＮＡ 文
代谢 １ 条 ，辅助 因 子和 维生素代谢 １ 条 ，其他氨基酸库质量较好 。
代谢 ３ 条 ，类化合物和多酮类化合 物代谢 １ 条 ，核苷３ ． ２ｃＤＮＡ 文库 ＥＳＴ 序列 的 比对分析
酸代谢 １ 条 ， 外源性 物质降 解 和代谢 ２ 条 。 在抗病本研究通过对 ｃＤＮＡ 文库 的测 序得到 ３ ５ １ 个重
防御 和 免疫中 有免疫病菌类 １ ８ 条 ，有 防御病 菌 ２ ８叠群 （Ｃｏｎ ｔ ｉ ｇｓ ） （ 由 ２ 条到 ７ 条 ＥＳＴ 组成 ） 的 ４０ ９ 个
条 。 生物有机体有关的可 以 分为 ，发育有关 １ 条 ， 消ＥＳＴ ｓ 序列 。 在 聚 类结果 中 ， ＥＳＴ 序 列 的片段 大小
化有关 １ 条 ， 分泌系 统 ３ 条 ， 环境适 应性有关 的 ４在 ２０５ ￣１５ ７ ４ｂ ｐ 之间 ， 片 段平均 大小 为 ５ ３ ６ｂｐ 。
条 ，排泄系 统 １ 条 ，神经系统 ２ 条 。对所测 ＥＳＴ ｓ 及 ＥＳＴ ｓ 经过 聚 类后所 得到 的 Ｕｎｉ －
第 ６ 期

王亚娟等 ： 白粉病菌诱导的 卵穗 山羊草叶片 ｃＤＮＡ 文库构建和分析

Ｇｅｎｅ 分别进行分析 ，使得对所测序列的 分析更加全ｉｎｔ ｅｒ ｆｅｒｏｎｉｎｄｕｃｉｂ ｌｅｌｙｓ ｏｓｏｍａ ｌｔｈｉｏｌｒｅｄｕ ｃ ｔａ ｓｅｆａｍ ｉ －
面化 ，但在ＥＳＴｓ的 比对研究 中 ，仍然有少量ＥＳＴ ｓ ｌｙｐｒｏ ｔ ｅｉｎ和ＲＮＡ ｉｎ ｔｅ ｒｆｅｒｅｎｃｅａｎｄｓｉ ｌｅｎｃ ｉｎｇｐｒ ｏ－
不能在 Ｇ ｅｎｂａｎｋ 中找到 同源序 列 ， 其可能原 因是 ：ｔ ｅ ｉ ｎ （ Ｑｄｅ２ ）等干扰 、胁迫反应蛋 白等 的存在 ，说明生
有些 ＥＳＴ ｓ 可能本身就是 白 粉菌诱导下卵穗山 羊草物体某些机制在应对各种胁迫时是相通的 。 另外在
所特异表达 的 。细胞抗病反应过程 中 一些含有 ＬＲＲ 结构 的蛋 白也
对 ＥＳＴｓ 的分析结果表 明 ， 经过 白 粉菌侵染后发挥着 重要 的作用 ， ＬＲＲ 也可 能还参与 了 信号传
所表达的 ＥＳＴ ｓ 大多与 来源于小麦 、水 稻 、 玉米 、短导 ，可促进抗病基因 的产物与抗病信号传导 中 的相
柄二冰草 、苜蓿等作物在生物与非生物胁迫 （包括病关蛋白 的互作 ［ ２ ５＿２６ ］ 。
菌侵染 ， 低温处理 、 冷处理 、 激素处理 、 干旱胁迫等 ）本研究发现了 编码多种信号传导途径的成分的
下的 ＥＳＴｓ 有较高的 同源性 ，且这些 ＥｓＴｓ 涉及氨基基因 ， 比如 ＥＡＬｄｏｍａ ｉｎｐｒｏ ｔｅ ｉｎ ，Ｅ３ｕ ｂｉｑｕ ｉ ｔ ｉｎ－ｐｒｏ －
酸 、碳碟酸盐 、水化合物 、脂质 、蛋白 质和核酸等多种 ｔｅｉｎｌ ｉｇａｓｅ 、 ＮＡＤＨ－ｐ ｌａｓｔｏｑｕｉｎｏ ｎｅｏ ｘｉｄｏ ｒｅｄｕ ｃｔａ ｓｅ
物质的代谢过程说明 ： （ １ ）在不 同逆境条件下可诱导 ｓｕｂｕｎ ｉ ｔＫ （ ｃ ｈｌ〇ｒ〇ｐ ｌａ ｓ ｔ ） ，憐酸丙糖转运蛋 白 、抗坏血
出相 同或相似的逆境蛋 白 ，该现象说明 植物对逆境酸氧化酶等 ，表明 在病原菌的侵染过程中 寄 主可能
的适应可能存在某些共同 机制 ： 一种抗性基 因可能启动了 ＩＰ３ 蛋 白磷酸化途径 、 乙烯信号传导途径 、信
参与不 同逆境 的胁迫反应 ； （ ２ ）在分子水平上小麦对号转导途径等多种信号传导途径来抵抗病原菌的侵
白 粉 菌 侵 染 所 做 出 的 反 应 是 全 方 位 多 方染 ，其 中特定 的信号传导机制 以及各途径间相互作
面的 ［ ７？ ’ １ ７ ］ ，用需进一步研究验证 。
本研究从 白 粉病菌诱导 的 卵穗 山羊草 ｃＤＮＡ
文库中随机挑取单克隆测序 ， 得到 了一些可 能与 抗参考文献 ：
病反应相关的 ＥＳＴ 序列 ，试图分析这些序列 相关表 ［ １］ＬｕｏＰＧ ，ＬｕｏＨＹ ，Ｃｈａｎｇ ＺＪ ，ｅ ｔａ ｌ ．Ｃｈａｒａｃ ｔ ｅｒｉｚ ａ －
达的基 因 ，来解释它们在卵 穗 山羊草与 白粉病菌互ｔ ｉｏｎａｎｄｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｌｏ ｃａｔ ｉｏ ｎｏｆＰｗ４〇ｉｎ ｃｏｍｍｏｎ
作中 的作用 。 在序列分析中 出现一定频率的 锌指蛋ｗｈｅａ ｔ ： ａｎｅｗｇｅｎｅｆｏｒｒ ｅｓ ｉｓ ｔａｎｃｅｔｏｐｏｗｄ ｅ ｒｙｍ ｉ ｌ ｄｅｗ
白 、谷胱甘肽转移酶 ，几 丁质酶和Ｃｈａｐｅ ｒｏｎｅｐｒｏｔｅ ｉｎ ｄ ｅｒ ｉｖｅｄｆｒ ｏｍＥｌｙｔｒｉｇｉａｉｎ ｔｅｒｍｅｄ ｉｕｍ＾ ．ＴｈｅｏｒＡｐｐ ｌ
ＤｎａＪ 伴护蛋 白 的 基因 。 锌指蛋 白 在基 因的细胞分Ｇｌｅｎｅｔ ’２００ ９ ’１ １ ８ ： １ ０５ ９ －１ ０ ６４‘
化 、胚胎发育 、 表达调控 等生命过程 中 发挥 重要作 Ｈ ｅ Ｒ ’ ｅｈａｎｇ Ｚ ’Ｙａｎｇ Ｚ ’ ｅｔ ａ １’Ｉｎｈｅｒｉ ｔａＭｅ ａｎｄ ｍａ ｌ＂
ｐ ｉｎｇｏ ｆｐ ｏｗｄ ｅ ｒｙｍ ｉ ｌｄ ｅｗｒｅ ｓｉｓ ｔａｎｃｅｇｅｎｅＰｍ４ ３ｉ ｎｔｒ ｏ－用？ 。 Ｃ３Ｈ 基 因 来 自 拟南芥 的 ＨｖＲ ａｒ ｌ 和 ＲＡＲＩ ， ｆ ．ｇ ｒｅｓｓｅｄｉｒｏｍ Ｉ ｎ ｔ ｎ ｏｐｙｒｕｍ ｉ ｎｔｅｒｍ ｅｄ ｉ ｕｍ ｉｎｔ ｏｗｈ ｅａｔ锌指类蛋 白 基因 ， 已 经被证明 是抗病基因 比较密＊［Ｊ ］ ，Ｔｈｅ〇ｒ Ａｐｐ ｌＧｅｎｅ ｔ ，２０ ０９ ，１ １ ８  ＝ １ １ ７ ３－ １ １ ８０ ．
的部位 ［＿ ］ 。 黄越敏等在 水稻中 分离 了一 个新 的 ［ ３ ］Ｍｏｈ ｌｅｒ Ｖ ，Ｂａｕｅ ｒＣ ，Ｓｃｈｗｅ ｉｚｅｒＧ ， ｅ ｔａ ｌ ．Ｐｍ５ ０ ：ａ
能被逆境胁迫和 ＡＢＡ 诱导 的锌指蛋 白 基 因 ， 表 明 ｎｅｗｐｏｗｄ ｅｒｙｍｉ ｌｄ ｅｗｒｅｓ ｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅ ｉｎｃｏｍｍｏｎ
其可能在水稻对逆境胁迫应答反应中发挥作用 。ｗｈｅ ａ ｔｄｅｒｉ ｖｅｄｆｒｏｍｃｕ ｌｔ ｉ ｖａｔｅｄｅｍｍｅｒ［ Ｊ］ ．ＪＡｐ ｐｌ Ｇｅ－
张玉秀 ［ ２ ２ ］等从 Ｈ ｇＣ ｌ ２ 胁迫下 的菜显叶 片 ｃＤＮＡ 库ｎ ｅｔ ｉｃｓ ，２〇 １３ ，５４ ： ２５ ９＿２ ６ ３ ．
中筛选 出来ＰｖＳＲ６ （ Ｐｈａｓｅ〇 ｌｕ ｓｖｕｌｇａｒｉｓｓ ｔｒ ｅｓ ｓ－ ｒｅｌａ ｔ －［ ４］Ｋ ｕｒａｐ ａｒｔｈ ｙＶ ，ＳｏｏｄＳ ，Ｃｈｈｕｎｅｊ ａＰ ， ｅ ｔａ ｌ ．Ａｃ ｒｙｐ ｔｉ ｃ
ｅｄ ） ｃＤＮＡ克隆 ，它 编码 的ＤｎａＪ－ ｌ ｉｋｅ蛋 白 分子量很ｗ ｈｅａ ｔ－Ａｅｇｉｔｅ以ｔｒａｎｓ ｌｏ ｃａｔ ｉｏｎｗ ｉ ｔｈｌ ｅａｆ
小 ，是ＨＳＰ７〇的 辅 助 伴 侣 蛋 白 （ ｃｏ－ ｃｈ ａｐｅ ｒｏｎｅ） ， ｒ ｕｓ ｔｒ ｅｓ ｉｓ ｔａｎｃｅｇｅｎｅＬ ｒ５ ８ ［ Ｊ ］ ，Ｃｒｏ ｐＳｃ ｉｅｎｃｅ ，２ ００ ７ ，
ＨＳＰ７０ 参与细胞内新生蛋 白 的 装配 、折叠和跨膜运（４ ７ ＞ ： １ ９９ ５－ ２００ ３ ‘
输等过程 ，并能介导逆境 消退后聚集蛋 白 的溶解 复 ＤｈａＵｗａ ｌ Ｈ Ｓ ’ ＆ｇ ｈ Ｐｉ ’Ｗ ｌ ｌ ｉ ａｍ Ｍ ＿Ｔ＞ａｎ ｓｆＭ Ｑ ｆ ＴＵＳ ｔ
． ． ，一，、 ｒｅｓ ｉｓ ｔａｎｃ ｅｆｒｏｍＡｅｓ ｉＬｏｐ ｓｏｖａ ｔａ ｉｎ ｔｏｂ ｒｅａｄｗｈｅａｔ性和 在 逆 境 胁 迫 条 件 下 防 止未 折叠 的 蛋 白 变ａ ． ． ，，，，，Ｌ
Ｃｉ ｎｔ ｉｃｕｍａｅｓｔ ｉ ｖｕｍＬ． ；ａｎｄｍｏ ｌｅｃｕ ｌａｒ ｃｈ ａｒ ａｃｔｅｒｉ ｓａ ｔ ｉ －
性 ［叫 ，推测 ＤｎａＪ－Ｋｋ ｅ 蛋 白 在提高植物的抗逆性及〇ｎｏｆ■加ｔ ｄｅ ｒｉｖａ ｔ ｉｖｅｓＥｕ ｐ ｈｙ ｔ ｉｃａ ，歷 ， １２ ６
保护酶蛋 白 和细胞膜 的 结构和 功能方 面有 重要作
用 。 在本分析研究 中 ，还发现不少非 生物 因 素胁迫［ ６］Ｚｅ ｌ ｌｅｒＦ ＬＫｏｎｇＬ ， Ｈ ａｒｔ ｌＬ ， ｅ ｔａ ｌ ．Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ ｌ１〇 ＿
相关蛋 白 如ｖ ｉ ｒａ ｌＩＡＰ －ａｓ ｓ〇 ｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒｈｏ ｔｎｏｌｏｇ 、ｃａ ｔ ｉｏｎ ｏ ｆｇｅｎｅ ｓｆｏｒｒｅ ｓ ｉｓ ｔａｎ ｃｅｔｏｐｏｗｄｅｒ ｙｍ ｉ ｌｄ ｅｗｉ ｎ
ｔｕｍｏｒｓｕ ｐｐ ｒｅ ｓｓｏ ｒｐ５ ３－ ｂｉｎｄ ｉｎｇｐｒｏ ｔｅ ｉｎ１ 、 Ｇ ａｍｍａ ｃｏｍｍｏｎｗｈｅａ ｔ｛ Ｔ ｒｉ ｔ ｉｃｕｍａ ｅｓｔ ｉｖｕｍＬ．ｅｍＴｈｅ ｌ ｌ ． ） ．
＿＿
６

河 北 农 业 大 学 学 报

第 ３ ８卷
７ ．ＧｅｎｅＰｍ２ ９ｉ ｎｌｉ ｎｅＰｏ ｖａ ［Ｊ ］ ．Ｅ ｕｐｈｙｔ ｉｃａ ，２００ ２ ，［１ ７］ 张宁 ， 陆鸣 ， 宋凤景 ， 等 ． 人工合成小麦 对 白 粉病 的
１ ２３ ： １１ ８ ７－ １ ９４ ．抗性评价 ［ Ｊ ］ ？ 河北农业 大学 学报 ， ２ ０１ ３ ，３ ６ （ １ ） ： ６
［ ７ ］ 陈秀珍 ． 小麦抗 白粉病近等 基因 系 ｃＤＮＡ 文库构建－ １ ０ ．
及抗病相关基因 的 全长ｃＤＮＡ克 隆 ［ Ｄ］ ？ 北 京 ： 中 国［１ ８ ］Ｌａ ｉ ｙｙ ＪＨ ，Ｌｅ ｅＢＭ ，ＷｒｉｇｈｔＰＥ ．Ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｐ ｒｏ－
农业科学 院 ， ２ ００ ４ ． ｔｅ ｉｎｓ ：ｎｅｗｉｎｓ ｉｇｈｔ ｓ ｉｎｔｏｓ ｔｒｕ ｃｔ ｕｒａ ｌａｎｄｆｕｎｃ ｔ ｉｏｎａｌｄ ｉ－
［ ８］ 姜宝杰 ， 陈华 ， 张冲 ， 等 ． 环境胁迫诱 导的 花生全长ｖｅｒｓ ｉ ｔｙ［ Ｊ ］ ．Ｃ ｕｒｒＯｐｉｎＳｔｒｕ ｃｔＢｉ ｏｌ ， ２００ １ ， １ １（ １ ） ： ３ ９
ｃＤＮＡ 文库的构建及序列分析 ［ Ｊ ］ ． 核农学报 ， ２０ １ ３ ， － ４ ６ ．
２ ７ （ ５ ） ： ５４ ５－ ５ ５ １ ．［ １ ９］Ｓｈ ｉｒａｓｕＫ ，Ｌ ａｈａｙｅＴ ，ＴａｎＭＷ ．Ａｎｏｖ ｅｌｃ ｌａｓ ｓｏ ｆ
［ ９ ］ 陈雅平 ． 簇毛麦 ｃＤＮＡ文库 构建 及小麦抗病相 关基ｅｕｋａ ｒｙｏ ｔ ｉｃ ｚ ｉｎｃｂ ｉｎｄ ｉｎｇｐ ｒｏ ｔｅ ｉｎｉ ｓｒ ｅｑ ｕ ｉｒｅｄ ｆｏｒｄ ｉｓｅａｓｅ
因 克隆 与功能分析 ［Ｄ］ ． 南京 ：南京农业大学 ， ２０ ０５ ． ｒｅｓｉ ｓ ｔａｎ ｃｅｓｉ ｇｎａ ｌ ｉ ｎｇ ｉｎｂａ ｒｌ ｅｙａｎｄｄｅｖ ｅｌ ｏｐｍｅｎｔｉｎＣ．
［ １ ０ ］ 吴 金华 ． 小麦一黑麦抗 白 粉病衍 生 系 遗传分析 及其职ｍ ［Ｊ ］ ．Ｃｅ ｌｌ ，１ ９９ ９ ，９９ ： ３５ ５－ ３６６ ．
相关基因差异表达与克隆 ［Ｄ］ ． 杨凌 ： 西北农林科技［２ ０］Ｍｕ ｓｋｅｔ ｔＰＲ ，ＫａｈｎＫ ，Ａｕｓ ｔ ｉｎＭ Ｊ ，ｅ ｔ ａｌ．Ａｒａｂｉ －
大学 ， ２０ ０８ ．ｄｏｐｏｓ ｉｓＲＡＲ１ｅｘｅｒｔｓｒａ ｔｅｌｉｍｉ ｔ ｉｎｇｃｏｎ ｔｒｏ ｌｏ ｆＲｇｅｎｅ－
［ １ １ ］ＬｉＲ ，Ｒｉｍｍｅｒ Ｒ ，Ｂｕ ｃ ｈｗａｌｄ ｔＬ ，ｅｔａ ｌ ．Ｉｎｔｅｒ ａｃ ｔｉ ｏｎｏｆｍｅｄｉ ａｔｅｄｄｅｆｅｎｓｅｓａｇａ ｉｎｓ ｔｍｕ ｌｔ ｉｐ ｌｅｐａｔｈｏｇｅｎｓ ［ Ｊ
Ｓｃ ｌｅｒｏｔｉｎ ｉａｓｃ ｌｅｒｏ ｔｉｏｒｕｍｗ ｉｔｈａ ｒｅｓ ｉｓｔａｎｔＢ ｒａｓｓｉ ｃａｎａ － ＴｈｅＰ ｌａｎ ｔＣｅ ｌｌ ，２０ ０ ２ ，１ ４ ： ９７９ － ９ ９ ２ ．
ｐｕｓ ｃｕ ｌ ｔ ｉｖａｒ ：ｅｘｐｒ ｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎ ｃｅｔａｇａｎａｌ ｙ ｓｉ ｓｉｄｅｎ ｔｉ －［ ２ １］黄越敏 ， 胡红红 ， 武从庆 ？ 一个逆境诱导表达的水稻
ｆ ｉｅｓｇｅｎｅｓａｓ ｓｏｃｉａ ｔｅｄｗ ｉｔｈｆｕｎｇ ａｌｐａｔｈｏｇｅｎｅｓ ｉｓ［ Ｊ ］ ．锌指蛋 白 基 因 的 分离 和鉴 定 ［ Ｊ］ ． 华 中 农业 大 学学
ＦｕｎｇａｌＧｅｎｅ ｔＢ ｉｏ ｌ ，２ ００４ ，４ １ （ ８ ） ： ７３ ５ － ７５ ３ ．报 ， ２ ００ ６ ， ２５ （ ６ ） ： ５ ８ １－５８ ５ ．
［ １ ２］Ｂｅｖ ａｎｓＭ ，Ｂａｎｃｒｏｆ ｔＩ ，ＢｅｎｔＥ ，ｅ ｔａ ｌ ．Ａｎａ ｌ ｙｓ ｉｓｏｆ１ ．９［２ ２］ 张玉 秀 ， 柴 团耀 ， 李军超 ， 赵文明 ． ＤｎａＪ－Ｚ认ｅ基 因在
Ｍ ｂｏｆ ｃｏ ｎｔｉｇｕ ｏｕ ｓｓｅｑｕｅｎｃｅｆｒｏｍ ｃｈｒｏｍｏ ｓｏｍｅ４ｏｆ 不同 环境胁迫下 的 表 达研 究 ［Ｊ ］ ． 西 北植物学 报 ，
Ａｒａ ｂｉｄｏｐｓ ｉｓ ｔｈａ ｌ ｉａ ｎａＮａ ｔｕ ｒｅ ，１ ９ ９ ８ ，３９ １ ：４ ８５２０００ ，２０ （ ２ ）？ １ ７１ －１ ７４ ．
－ ４８８ ． ［ ２３］ＭｃＣａｒ ｔｈｙＤ ，ＫｒａｍｅｒＧ ，Ｈａ ｒｄｅｓ ｔｙ Ｂ ．Ｒｅａｃ ｔｉｖａｔ ｉｏｎ ｏｆ
［ １ ３］ 许若丹 ， 钟理 ， 李继 刚 ， 等 ？ 赤子 爱胜蝴全长ｃＤＮＡｔｈｅｒｍａｌ ｌ ｙｉｎａｃｔｉｖ ａｔｅｄｐ ｒｅ－ｂ ｅ ｔａ－ｌ ａｃ ｔａｍａｓｅｂｙＤｎａＫ ．
文库的构建 及 初 步鉴 定 ［Ｊ ］ ． 河 北农业大 学学报 ， ＤｎａＪａｎｄＧｒｐＥ ［ Ｊ ］ ，Ｐｒｏｔｅ ｉｎＳｃ ｉ ， １ ９９８（ ７ ） ：１ １ ６ ４
２０ ０ ６ ，２ ９ （ ３ ） ： ７９ － ８２ ．－１ １ ７ １ ．
［ １ ４］ 段豪 ， 赵绪生 ， 钟 敏 ， 等 ． 苏俄苹果酵母双杂交ｃＤ－［ ２４］Ｋ ｅ ｌｌ ｅｙＷＬ ．Ｔｈ ｅ Ｊ－ｄｏｍａ ｉｎ ｆａｍｉｌｙａｎｄｔｈｅｒｅｃｒｕｉ ｔｍｅｎ ｔ
ＮＡ文库 的 构 建 与 评 价 ［ Ｊ ］ ． 河 北农业 大 学 学 报 ， ｏ ｆｃｈａｐ ｅｒｏｎｅｐ〇Ｗｅｒ［Ｊ ］ ．ＴＩＢＳ ， １ ９ ９８ （ ２ ３ ） ： ２ ２２ － ２２７ ．
２ ０ １ ４ ，３ ７ （ ｌ ） ； ６ ９－ ７３ ． ［２ ５］任 晓娣 ， 刘彦 慧 ， 李建嫄 ， 等 ． 小 麦 ＮＢＳ＾ＬＲＲ 类抗
［ １ ５］ 陈 云芳 ， 杨文 香 ， 刘 大群 ． 叶锈菌 诱导的 小麦 叶 片病基因 同源 ｃＤＮＡ 序列 的克隆与表达分析 ［Ｊ］ ． 河北
ｃＤＮＡ 文库的 构建及其质量评价 ［Ｊ ］ ． 分子植物育种 ， 农业大学学报 ， ２ ０ １ ３ ， ３ ６ （ ２ ） ： ６ ９ － ７４ ， ７ ９ ．
２ ００ ９ ，７ （ ４ ） ： ６９ ９－ ７０２ ．［２ ６］ 王海燕 ， 刘大群 ， 杨文香 ． 植物抗病基 因类似序列研
［ １６］ 卫晓静 ， 王华忠 ， 岳洁瑜 ． 白粉菌诱导小麦叶 片全长究进展及展望 ［Ｊ ］ ． 河 北农 业大 学 学报 ， ２０ ０ ２ ，２ ５
ｃＤＮＡ 文库的 构 建及质量评价 ［ Ｊ ］ ？ 江苏农业科学 ， （ Ｓｌ ） ： １ ６４ － ４６ ８ ．
２ ０ １ ５ ，４３ （２ ） ： ３ ８ － ４０ ．
（编辑 ： 梁 虹 ）