全 文 ：应用微卫星标记研究西藏野生二棱大麦的遗传
多样性及地理分化①
冯宗云②＊ ＊＊ ＊＊＊　张义正＊　张立立＊＊＊　凌宏清③＊＊
(＊四川大学生命科学学院分子生物学及生物技术重点实验室　成都 610065)
(＊＊中国科学院遗传与发育生物学研究所植物细胞与染色体工程国家重点实验室　北京 100101)
(＊＊＊四川农业大学农学院　雅安 625014)
摘　要　用来自大麦 7 个连锁群不同位置的 35个 SSR标记研究了西藏不同地区的 50
份野生二棱大麦(H .spontaneum)的遗传多样性及地理分化 。结果表明:SSR的多态性
高 ,其多态性 DNA片段比例达 97.44%;每个 SSR位点检测到 1 ～ 14个等位变异(4.04
个/位点);西藏山南地区的遗传多样性和等位变异数最高 ,分别为 0.4933和 3.35。变异
的 1.08%～ 37.54%(平均为 13.09%)是由于地区的差异引起 ,表现出一定程度的地理分
化。最后 ,讨论了 SSR引物的选择及 SSR标记的可靠性和西藏野生大麦的起源问题 。推
测西藏山南地区可能是西藏野生二棱大麦的起源中心 ,也是西藏野生大麦和中国栽培大
麦的起源中心。
关键词　西藏 ,野生大麦 ,微卫星标记 ,遗传多样性 ,起源 ,地理分化
0　引 言
大麦(Hordeum vulgare L .)是世界上最古老的
栽培作物之一 ,也是重要的经济作物和遗传学及生
理学研究的模式植物 。西藏素有“世界屋脊”之称 ,
为青藏高原的主体 ,是世界大麦重要的起源中心之
一[ 1] 。中国青藏高原几乎存在世界上已发现的包
括野生二棱大麦(H.spontaneum)在内的各种近缘
野生大麦[ 2] 。西藏大麦在栽培大麦的起源与进化
中的重要性问题一直受到国际大麦学术界的十分关
注[ 2 ～ 22] 。徐廷文(1982)综合前人研究结果提出 ,西
藏野生二棱大麦是中国栽培大麦的唯一祖先[ 2] 。
显然 ,研究其遗传多样性及地理分化问题 ,对于进一
步揭示西藏野生大麦及中国栽培大
麦的起源与进化 ,保护遗传资源及
指导大麦育种均具有重要的意义 。
在过去的几十年中 ,许多学者
对西藏野生二棱大麦的分布 、遗传
变异表示出了极大的关注 。徐廷文
(1982)[ 2] 、邵启全(1982)[ 10] 及马得泉等(1987)[ 13]
认为 ,西藏野生二棱大麦具有分布地区广泛 、变种多
为重叠分布 、变异类型多样和主要遗传性状的显性
基因频率高等特点 。Zhang 等(1994)利用酯酶同工
酶和核糖体 DNA(rDNA)标记分析了西藏野生二棱
大麦 、野生六棱大麦(H .agriocri thon)和栽培大麦
(H .vulgare)的遗传多态性 ,认为野生二棱大麦存
在广泛的遗传变异 ,在 4 个酯酶位点(Est1 , Est2 ,
Est 3和 Est4)和 2个 rDNA位点(Rrn 1和 Rrn 2)上
的遗传多样性均高于野生六棱大麦及栽培大麦[ 19] 。
但对于西藏野生二棱大麦在西藏各地区的遗传多样
性及地理分化却不清楚 。
微卫星(microsatellites)亦称简单序列重复
(simple sequence repeats ,SSR),广泛分布于整个基
因组 ,数量丰富 ,具有较多等位性变异和高度的个体
特异性 ,容易检测 ,为共显性标记 ,PCR扩增结果重
现性高 ,又经济等特点 ,被认为是研究群体遗传变异
最好的标记方法[ 23] ,已被广泛应用于分子遗传图谱
的构建 、遗传多样性研究 、种质鉴定 、主要性状基因
—46—
高技术通讯　2003.10
①
②
③ 联系人。
(收稿日期:2003-07-23)
男 , 1963年生 , 博士生 ,副教授;研究方向:分子遗传学及基因工程;麦类分子生物学及生物技术育种。
中国科学院“百人计划”资助项目。
的定位及分子标记辅助选择育种等方面[ 24 ,25] 。 I-
vandic等(2002)用 SSR标记研究了来自以色列 、土
耳其及伊朗的野生二棱大麦的遗传多样性[ 26] 。但
用SSR标记技术研究西藏野生二棱大麦的遗传多
样性及地理分化问题尚被人所忽视。为此 ,我们从
大麦 7 个 SSR连锁图的每个连锁群的不同位置上
选取了 5个共计 35个SSR标记对西藏野生二棱大
麦进行了研究 ,目的在于了解西藏不同地区的野生
二棱大麦等位基因分布状况 ,评价其遗传多样性及
地理分化。
1　材料与方法
1.1　植物材料
　　50份野生二棱大麦来自西藏的 7 个地区(市)
(那曲地区除外),由中国农业科学院作物品种资源
研究所马得泉研究员馈赠(见表 1),均取自中国国
家种质资源库(北京)。每份材料取 5粒种子播于盆
钵 ,在温室中培养幼苗 。
表 1　50份中国野生二棱大麦及其在西藏的来源地
材料来源地 全国统一编号 海拔高度(m)
拉萨市尼木 ZYM0027 , ZYM0983 3 750 ～ 4 200
拉萨市堆龙德庆 ZYM1491 , ZYM1492 3 700 ～ 3 970
山南地区加查 ZYM0048 , ZYM0050 , ZYM0055 3 300 ～ 3 900
山南地区隆子 ZYM0061 , ZYM0078 , ZYM0081 3 570 ～ 4 000
山南地区错那 ZYM0101 , ZYM0104 , ZYM0874 3 630 ～ 4 350
山南地区措美 ZYM0135 3 600 ～ 4 200
山南地区洛扎 ZYM0141 3 300 ～ 3 930
山南地区典松 ZYM0183 3 820 ～ 4 200
山南地区桑日 ZYM0192 , ZYM0193 3 830 ～ 3 870
山南地区乃东 ZYM0194 3 500 ～ 3 800
山南地区穷结 ZYM0198 , ZYM0200 , ZYM0209 3 500 ～ 3 900
山南地区扎囊 ZYM1811 , ZYM1813 3 650
江孜地区江孜 ZYM0211 4 040
日喀则地区定日 ZYM0212 , ZYM0958 , ZYM0959 , ZYM1006 3 800 ～ 4 300
日喀则地区南木林 ZYM0957 3 950
昌都地区察雅 ZYM0002 , ZYM1448 3 100 ～ 3 300
昌都地区昌都 ZYM0001 , ZYM1440 3 170 ～ 3 200
昌都地区贡觉 ZYM0003 , ZYM1442 2 840 ～ 3 660
昌都地区八宿 ZYM0004 3 080 ～ 4 100
昌都地区左贡 ZYM0005 , ZYM0010 3 300 ～ 3 980
昌都地区芒康 ZYM0011 , ZYM0046 3 000 ～ 3 800
阿里地区札达 ZYM0226 , ZYM0235 3 550
阿里地区普兰 ZYM0241 , ZYM1839 3 710 ～ 3 830
林芝地区工布江达 ZYM0022 3 300 ～ 3 804
林芝地区郎县 ZYM0032 , ZYM0035 3 200 ～ 3 720
林芝地区米林 ZYM1455 , ZYM1458 2 970 ～ 3 450
1.2　方法
1.2.1　基因组 DNA提取
每份材料取 3 周龄幼叶约 300mg 按 Stein 等
(2001)描述的 CTAB 法提取 DNA[ 27] 。用 0.8%的
Agarose凝胶检测 DNA 质量 ,用紫外分光光度计
(UV-2201)测定 DNA浓度 ,并用超纯净水稀释成工
作浓度(20ng/μl)。
1.2.2　SSR实验程序
1)SSR引物
从 Liu等(1996)[ 28] 发表的大麦每个连锁群两
个臂的不同位置上的 SSR标记序列中选取 5对共
35对 SSR引物(见表 2)用于 PCR ,这些引物均由北
京奥科生物技术公司合成。
—47—
冯宗云等:应用微卫星标记研究西藏野生二棱大麦的遗传多样性及地理分化
表 2　用于本实验的大麦 SSR标记 、引物序列 、染色体位置和重复数及 PCR反应条件
SSR 引物序列(5′※3′) Chr. 重复 PCR＊
HVM49
CTCTATAGGCACGAAAA
ATTCC
TTGCACATATCTCTCTCT
GTCACA
1H (CA)12 (1)
HVCMA
GCCTCGGTTTGGACATA
TAAAG
GTAAAGCAAATGTTGAG
CAACG
1H (AT)9 (4)
HVM5 AACGACGTCGCCACACAC
AGGAACGAAGGGAGTATTA
AGCAG
1H (GT)6 ,(AT)16 (3)
HVM4
AGAGCAACTACCAGTCCA
ATGGCA
GTCGAAGGAGAAGCGG
CCCTGGTA
1H (AT)9 (3)
HVM51
TCTAAATTACCTTCCC
AGCCA
AAGCAGACATGTAGG
AGGTCA
1H (GA)3(GGGA)3 ,(GA)8 (1)
HVCSG
CACTTGCCTACCTCGATAT
AGTTTGC
GTGGATTCCATGCATGCAA
TATGTGG
2H (CA)4 ,(C)7 (4)
HVBKASI
ATTGGCGTGACCGATATTT
ATGTTCA
CAAAACTGCAGCTAAGCA
GGGGAACA
2H (C)10 ,(A)11 (4)
HVM23
TCGGTGAAGAAATACG
AGGC
TCTTTGTGACCTACCGG
TCC
2H (GA)9 (2)
HVM26
GGCTATCACATTTGGTA
CCATC
GCATGTGTAGGTGT
TGGTGG
2H (CA)11 (2)
HVM36
TCCAGCCGAACAATTTC
TTG
AGTACTCCGACACCAC
GTCC
2H (GA)13 (1)
HVM33
ATATTAAAAAAGGTGGA
AAGCC
CACGCCCTCTCCCTA
GAT
3H (CA)7 (1)
HVM27 GGTCGGTTCCCGGTAGTG TCCTGATCCAGAGCCACC 3H (GA)14 (1)
HVM60 CAATGATGCGGTGAACTTTG CCTCGGATCTATGGGTCCTT 3H (AG)11 ,(GA)14 (1)
HVM62 TCGCGACCAGACGAGAAG AGCTAGCCGACGACGCAC 3H (GA)11 (1)
HVM44 AAATCTCAGGTTCGTGGGCA CCACGGAGACCACCTCACTT 3H (GA)8 (1)
HVM40 CGATTCCCCTTTTCCCAC ATTCTCCGCCGTCCACTC 4H (GA)6(GA)4(GA)7 (1)
HVM3
ACACCTTCCCAGGACAATCC
ATTG
AGCACGCAGAGCACCGAA
AAAGTC
4H (AT)29 (3)
HVM68 AGGACCGGATGTTCATAACG CAAATCTTCCAGCGAGGCT 4H (GA)22 (1)
HVM67 GTCGGGCTCCATTGCTCT CCGGTACCCAGTGACGAC 4H (GA)11 (1)
WMS6
CGTATCACCTCCTAGCTA
AACTAG
AGCCTTATCATGACCCTA
CCTT
4H (GA)40 (5)
HVM20 CTCCACGAATCTCTGCACAA CACCGCCTCCTCTTTCAC 5H (AG)19 (1)
HVM43 GGATTTTCTCAAGAACACTT GCGTGAGTGCATAACATT 5H (CA)9 (1)
HVM70 CCGCCGATGACCTTCTC ACCCACGACCTATGGCAC 5H (CA)8 (3)
HVM63 CGCGCAAGCATGAATACTC ACTCACAAGTGGCGCGTAC 5H (GA)9 (1)
HVM64 GATGTGAAGGCTGCCTG ACACGCCCTATTACCCAGTG 5H
(GA)4(GT)7(CT)2
(GT)4(GA)8 (1)
HVM14
CGATCAAGGACATTTGG
GTAAT
AACTCTTCGGGTTCAAC
CAATA
6H (CA)11 (1)
HVM34 ACCATGTTGCGTGTTGCTT CGGTTCGAAATCGAGTGG 6H (GA)10 (2)
HVM65 AGACATCCAAAAAATGAACCA TGGTAACTTGTCCCCCAAAG 6H (GA)10 (1)
HVM22 TTTTGGGGGATGCCTACATA TTTCAAATGGTTGGATTGGA 6H (AC)13 (1)
HVM74 AGGAAGTCATTGCGTGAG TGATCAAGAATGATAACATGG 6H (GA)13 (3)
HVDHN7 TTAGGGCTACGGTTCAGATGTT ACGTTGTTCTTCGCTGCTG 7H (AAC)5 (4)
HVDHN9
CATGGACAAGATCAAGGAG
AAG
CCCATTATTTATCTGTAGG
AACGC
7H (AC)6 (4)
HVLEU TTGGAAGTGTACAGCAATGGAG TGAAAGGCCCCACAAGATAG 7H (ATTT)4 (4)
HVM6 CATGAATGAATGATTGGTTTTG CGCATCCGTATGTATGAGTAA 7H (GA)9 (1)
HVM30 AGTGGGGAATGAGAGAATGG TGCTTGTGGGTCATCACAC 7H (CA)8 (2)
　　＊　括号中的数字代表本研究用的 5种 PCR反应条件(详见材料与方法)。
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高技术通讯　2003.10
2)PCR扩增
PCR 在 T1 Thermocycler 扩增仪(Whatman
Biometra)上进行 。总反应体系为 15μl , 其中包括
DNA模板(20ng/μl)2μl , 10×PCR buf fer(含 Mg2+)
1.5μl ,dNTP(2.5mmol/ L)1.5μl , rTaqDNA 聚合酶
(5 units/μl)0.1μl , SSR 引物对(2μmol/ L)1μl。依
SSR引物对的不同采用以下 5 种 PCR 程序:(1)
94℃1min , 64℃30s 72℃1min ,18个循环 ,其中每
2个循环复性温度降低 1℃,即从 64℃下降到 55℃;
94℃1min , 55℃ 1min , 72℃ 1min , 30个循环;72℃
5min。(2)94℃1min , 69℃30s ,72℃1min ,18个循
环 ,其中每 2个循环复性温度降低 1℃,即从 69℃下
降到 60℃;94℃1min , 60℃ 1min , 72℃ 1min , 20 个
循环;72℃5min。(3)94℃ 3min , 55℃ 2min , 72℃
1.5min;94℃1min , 55℃ 2min , 72℃1.5min , 30 个
循环 。(4)95℃ 5min;92℃ 1min , 60℃ 1min , 72℃
1min ,42个循环;72℃10min。(5)96℃ 1min , 60℃
1min ,72℃2min , 35个循环;72℃, 10min。
3)电泳及银染
用6%聚丙烯酰胺变性凝胶进行电泳 , 用 1×
TBE电泳液恒功率(60W)电泳 1h。用 50bp marker
DNA(MBI Fermentas)作为标准 DNA 。银染按照
Bassam等(1991)[ 29]的方法进行。
1.2.3　统计分析
数码相机照相。每个 SSR 标记按 Rickwood
(1982)[ 30]的方法利用 Qbasic 语言编程根据电泳迁
移率计算不同扩增片段的分子量。SSR产物银染色
结果 ,有带记为“ 1” ,无带记为“0” 。遗传多样性按
Nei(1973)[ 31]的公式 H =1 -∑P2i 计算 , P i 为某
位点第 i 个等位基因的频率 。地理分化(GST)按
Nei(1973)[ 31] 的公式 H T = HS +DS T 计算 , 式中
HT为总样本的多样性 , HS为亚区内的遗传多态性 ,
DST为亚区间的遗传距离 。
2　结 果
2.1　SSR的多态性
　　在本研究选择的 35 对 SSR引物中 ,有 4 对
(HVM4 , HVM20 、HVM23 和 HVM74)没有扩增
出 DNA 片段 , 31对能扩增出较清晰的谱带 ,并且具
有很好的重复性 , 占 88.57%;2 对(HVM14 和
HVM26)未能扩增出多态性 DNA 片段 , 29 对能扩
增出多态性片段 ,占 93.55%。在这 29对引物中 ,
共扩增出 DNA 片段 117 条 ,其中共有带 3 条 ,多态
性片段 114条 ,多态性片段比例达 97.44%。
2.2　遗传多样性
按材料的地区来源分成 6组(因江孜地区仅有
1份材料 ,将其归入拉萨组),每个组的材料视作一
个群体 。其遗传多样性值列于表 3 。由表 3 可以看
出 ,除山南地区的遗传多样性在 0(HVM44 和
HVM70)～ 0.99(HVM64)外 ,其余 5个组均在 0 ～
1 之 间 , 而总 样本 的遗传 多样 性在 0.0072
(HVM70)～ 0.9834(HVM64)之间 。平均而言 ,来
自山南地区的野生二棱大麦的遗传多样性最高(0.
4933),其余依次为昌都(0.4874)、日喀则(0.4538)、
拉萨(0.4351)、林芝(0.4179)和阿里(0.3621),均低
于总样本(0.5097)。
2.3　等位变异数目
由表 3可知 ,在总样本中 , 29 对引物共扩增出
117个等位变异 ,平均每个位点检测到 4.04 个等位
变异 , 最低 1 个(HVCSG , HVBKASI , HVM3 、
HVM27 、 HVM34 、 HVM68 、 HVDHN7 和
HVLEU),最高 14个(HVDHN9)。以山南地区检
测到的等位变异数最多 ,平均 3.35个/位点 ,其余依
次为昌都(2.97)、阿里(2.21)、林芝(2.00)、日喀则
(1.76)、拉萨(1.59)。在山南地区 , HVCSG 、
HVBK AS I 、HVM3 、HVM27 、HVM34 、HVM44 、
HVM68 、HVDHN7 和HVLEU 仅检测到 1个等位
变异 ,而 HVDHN9 检测到 10个等位变异;在昌都
地区 , HVM64 未能检测到等位变异 ,而 HVDHN9
检测到 13个等位变异 。
2.4　地理分化及等位变异频率分布
对总样本的遗传多样性(H T)剖分后表明 ,总变
异的 1.08 ～ 37.54%是由于地区间的分化(GST)引
起的(表 3), HVM40 的 GST 最低(1.08%), 而
HVDHN9 最高(37.54%),平均为 13.09%。GST低
于 5%的有 7个 SSR位点 ,占 24.13%;而高于 10%
的有 13个 ,占 44.83%。平均 86.91%的变异存在
于群体内。表现出一定程度的地理分化。从每条染
色体的平均值来看 , 6H 引起的地理分化最高(19.
42%),其余依次为 3H(16.20%)、7H(14.45%)、1H
(12.39%)、5H(11.98%)、4H(11.39%), 2H 最低
(4.59%)。
对各位点的等位变异频率分布进行χ2测验(表
3)表明 ,绝大多数的 SSR位点(占 75.86%)的等位
变异频率在地区间的分布不显著 ,只有 HVM34 、
HVM44 、HVM64 、HVM67 和 HVDHN9 达到 5%
的显著性水平 , HVM63 和 HVM65 达到 1%的显
—49—
冯宗云等:应用微卫星标记研究西藏野生二棱大麦的遗传多样性及地理分化
著性水平 。
表 3　西藏野生二棱大麦各 SSR位点的遗传多样性/等位变异数 、地理分化及等位变异频率分布检验(χ2)
染色体 座位 等位变异大小(bp) 拉　萨 昌　都 山　南 日喀则 阿　里 林　芝 总样本(HT) GST(%) χ
2
1H
HVM49 127-223 0.8000/ 2 0.8344/ 6 0.9250/ 6 0.8400/ 4 0.4375/ 1 0.8400/ 4 0.9280/ 9 9.85 50.34
HVCMA 240-271 0.4800/ 2 0.7356/ 2 0.5150/ 2 0.4800/ 2 0.3750/ 2 0.9600/ 2 0.6812/ 2 13.42 10.60
HVM5 185-481 0.6800/ 2 0.8923/ 2 0.8975/ 2 0.9200/ 2 0.9375/ 1 0.9600/ 1 0.9032/ 2 1.87 3.83
HVM51 123-287 0.0000/ 1 0.0000/ 1 0.0650/ 3 0.0000/ 1 0.0000/ 1 0.0000/ 1 0.0344/ 3 24.42 2.00
2H
HVCSG 147 0.6400/ 1 0.4710/ 1 0.6400/ 1 0.6400/ 1 0.4375/ 1 0.0000/ 1 0.5376/ 1 2.79 1.10
HVBKASI 136 0.000/ 1 0.4710/ 1 0.3600/ 1 0.0000/ 1 0.0000/ 1 0.0000/ 1 0.2604/ 1 4.91 1.14
HVM36 126-335 0.4800/ 5 0.5454/ 5 0.6275/ 6 0.2800/ 3 0.5000/ 6 0.2400/ 5 0.5440/ 7 6.07 38.58
3H
HVM33 124-272 0.8800/ 3 0.8430/ 5 0.8475/ 7 0.7200/ 4 0.8750/ 2 0.9200/ 2 0.9024/ 10 6.19 47.49
HVM27 182 0.0000/ 1 0.7933/ 1 0.3600/ 1 0.3600/ 1 0.0000/ 1 0.0000/ 1 0.3916/ 1 9.47 2.38
HVM60 150-293 0.3200/ 2 0.1570/ 3 0.1350/ 5 0.3200/ 2 0.1250/ 3 0.6000/ 2 0.2808/ 5 20.76 23.27
HVM62 131-363 0.2800/ 3 0.1239/ 4 0.0575/ 6 0.3600/ 1 0.3750/ 2 0.0800/ 4 0.1908/ 6 20.18 23.18
HVM44 191-286 0.0000/ 2 0.1141/ 2 0.0000/ 1 0.0000/ 1 0.0000/ 1 0.0000/ 1 0.0332/ 2 24.40 14.25＊
4H
HVM40 126-181 0.9600/ 1 0.9835/ 2 0.9750/ 4 0.9200/ 2 0.9375/ 1 1.0000/ 0 0.9800/ 4 1.08 8.53
HVM3 237 0.3600/ 1 0.9256/ 1 0.3600/ 1 0.6400/ 1 0.9375/ 1 0.3600/ 1 0.6156/ 1 9.26 4.59
HVM68 285 0.8400/ 1 0.9670/ 1 0.6400/ 1 0.9600/ 1 0.9375/ 1 0.8400/ 1 0.8400/ 1 3.84 4.03
HVM67 184-219 0.0000/ 3 0.0248/ 3 0.0825/ 4 0.0000/ 2 0.0000/ 3 0.1600/ 2 0.0852/ 4 36.03 26.80＊
WMS6 159-447 0.8400/ 1 0.7191/ 5 0.9525/ 5 0.6000/ 4 0.3750/ 4 1.0000/ 0 0.8720/ 5 6.74 21.15
5H
HVM43 181-300 0.0000/ 1 0.0348/ 2 0.0450/ 4 0.0000/ 1 0.0000/ 3 0.0000/ 1 0.0292/ 4 19.52 22.51
HVM70 145-272 0.0000/ 2 0.0268/ 2 0.0000/ 2 0.0000/ 1 0.0000/ 2 0.0000/ 1 0.0072/ 2 18.06 6.02
HVM63 111-351 1.0000/ 0 0.9504/ 3 0.9600/ 5 0.9600/ 1 0.1250/ 6 1.0000/ 0 0.9548/ 9 5.83 79.66＊＊
HVM64 100-257 1.0000/ 0 1.0000/ 0 0.9900/ 4 1.0000/ 0 0.6250/ 3 0.7200/ 4 0.9824/ 5 4.52 36.13＊
6H
HVM34 105 1.0000/ 0 0.4710/ 1 0.9100/ 1 1.0000/ 0 1.0000/ 0 1.0000/ 0 0.9216/ 1 8.03 13.21＊
HVM65 224-431 0.0000/ 1 0.1074/ 6 0.3024/ 6 0.0400/ 3 0.0625/ 8 0.0800/ 5 0.2148/ 9 24.77 100.92＊＊
HVM22 235-250 0.0000/ 1 0.1735/ 2 0.1175/ 2 0.0000/ 2 0.1875/ 2 0.0000/ 1 0.1344/ 2 25.45 7.52
7H
HVDHN7 284 0.3600/ 1 0.7024/ 1 0.4375/ 1 0.0000/ 1 0.0000/ 1 0.6400/ 1 0.4524/ 1 5.06 1.54
HVDHN9 140-228 0.8800/ 3 0.1240/ 13 0.1900/ 10 0.8000/ 5 0.3750/ 2 0.0800/ 11 0.4952/ 14 37.54 82.84＊
HVLEU 200 0.0000/ 1 0.0000/ 1 0.1900/ 1 0.0000/ 1 0.0000/ 1 0.0000/ 1 0.0784/ 1 3.06 0.16
HVM6 180-300 0.4800/ 2 0.3801/ 3 0.8100/ 3 0.3600/ 1 0.3750/ 2 0.2000/ 2 0.6312/ 3 14.19 16.45
HVM30 150-288 0.3200/ 2 0.5619/ 2 0.9125/ 2 0.9600/ 2 0.5000/ 2 0.4400/ 2 0.8000/ 2 12.42 14.69
平均值 0.4345/ 1.59 0.4874/ 2.79 0.4933/ 3.35 0.4538/ 1.76 0.3621/2.21 0.4179/ 2.00 0.5097/ 4.04 13.09
标准误 0.3851/ 1.09 0.3632/ 2.56 0.3620/ 2.35 0.3933/ 1.24 0.3549/1.80 0.4136/ 2.24 0.3506/ 3.41 10.12
注:＊, ＊＊分别示 0.05和 0.01显著性水平
3　讨 论
3.1　SSR引物的选择与标记的可靠性
　　从表 3看出 ,有的SSR引物揭示的地区遗传多
样性为山南>昌都>林芝>阿里>日喀则>拉萨 ,
如 HVM65等;有的则为阿里>日喀则>拉萨>昌
都>林芝 >山南 ,如 HVM62 等 。就单条染色体
SSR引物的平均值(从表 3可间接知道)而言 ,1H 为
阿里>林芝>昌都>山南>日喀则>拉萨;2H 则为
山南>昌都>拉萨>阿里>日喀则>林芝 。同样 ,
等位变异数及地理分化(GST)也呈现类似的情形 。
这些结果表明 ,不同的SSR引物以及不同染色体的
SSR引物所揭示的结果是不一样的 ,甚至是相反的
结论 。 Ivandic等(2002)[ 26]用来自大麦 7 个染色体
的 33对 SSR引物研究了以色列 、伊朗和土耳其的
39份野生二棱大麦的遗传多样性 ,也得出类似的结
论 。显然 ,SSR引物的选择严重影响着试验结果。
Huang 等(2002)[ 32] 对小麦种质资源的遗传多
样性研究表明 ,每位点的等位变异数呈现出着丝粒
区较非着丝粒区的遗传变异小 ,等位变异数与该位
点距离着丝点的相对距离呈显著的正相关(r =
0.48 , P <0.05);等位变异数与微卫星的基序和重
复数有关 ,等位变异数与主等位变异的重复数之间
呈显著的正相关(r=0.49 , P <0.05);遗传多样性
与等位变异数之间呈极显著的正相关(r=0.73 , P
<0.01)。冯宗云等(2002)[ 25]认为 ,将 SSR用于研
究遗传多样性确定亲缘关系时 ,由于 SSR在整个基
—50—
高技术通讯　2003.10
因组分布的随机性 ,应从大麦每个连锁群的两个臂
上选择至少 2个多态性信息量较高的 SSR标记用
于此类问题的研究 ,才能得出比较准确的结论 。本
试验中 ,我们从大麦每个连锁群的两个臂的不同位
置上各自选择了 5 对共 35 对 SSR引物 ,这些引物
在 Liu等(1996)[ 28]所用的 4个作图群体中的 4 对
亲本之间是有多态性的 ,在供试材料中除不能扩增
的 4对引物和 2对不能扩增出多态性 DNA 片段的
引物外 ,其余 29对中来自每个连锁群的两个臂不同
位置上的至少也有 3 对引物(2H 和 6H),扩增出多
态性 DNA片段的比例为 97.44%。这充分体现了
SSR标记高多态性的特点 。我们用有多态性的 30
对SSR引物研究了西藏野生二棱大麦 、野生瓶形大
麦(H .lagunculi forme Bakh)和野生六棱大麦的分
子进化 ,其结果(待发表)同前人从形态学[ 2] 、细胞
学[ 9 ,17] 、同工酶[ 9 , 11 ,14 , 16 ,19] 、rDNA[ 19] 及 RAPD[ 20]
等方面系统研究西藏野生大麦起源与进化所得结果
一致 。这无疑说明我们对 SSR引物选择的合理性
及实验结果的可靠性 ,也有力地表明了 SSR标记的
可靠性。
3.2　遗传多样性与西藏野生大麦的起源
1848年 Koch发现的野生二棱大麦(H .spon-
taneum Koch)被认为是栽培大麦的祖先 ,近东地区
即所谓“新月沃地”是栽培大麦的起源地(Vavilov ,
1926)[ 1] 。1938年 berg 从我国四川省道孚县获得
了野生六棱大麦[ 3] , Friesleben(1943)[ 4] 和 Schie-
mann(1951)[ 33]也相继在西藏发现过野生六棱大麦
和野生中间型大麦。他们提出了野生六棱大麦是栽
培六棱大麦和二棱大麦的始祖 ,二棱大麦是由六棱
大麦侧小穗退化而来 ,并认为中国西藏高原是栽培
大麦的起源地 ,即所谓栽培大麦的“二元”起源学说 。
中国科学院先后对青藏高原的野生大麦进行了考
察 ,中国青藏高原几乎存在世界已发现的各种近缘
野生大麦 ,包括野生二棱大麦 、野生瓶形大麦和野生
六棱大麦几种主要类型和变种 ,这些类型在西藏分
布十分广泛[ 7 ,8] 。徐廷文(1982)综合前人在分布 、
生态 、形态 、考古 、同工酶及遗传等方面的研究结果
论述了在中国青藏高原发现的野生二棱大麦与栽培
大麦的进化关系 ,证明其与中东的野生二棱大麦有
明显的区别 ,而与中国栽培大麦很近似 ,中国野生大
麦和栽培大麦是独立于近东野生大麦和东欧栽培大
麦而存在的 ,它们自成一个进化系统 ,它是中国栽培
大麦的唯一祖先 ,野生六棱大麦是从野生二棱大麦
向栽培大麦进化过程中的过渡形式[ 2] 。
我们知道 ,遗传多样性水平的高低可以度量遗
传变异量的大小 ,它依赖于基因的频率及其分布状
况 。Zhang 等(1994)[ 19]和 Kahler等(1981)[ 34] 研究
结果比较表明 ,西藏野生二棱大麦和近东野生二棱
大麦在 4个酯酶同工酶位点的遗传多样性无明显差
异 ,但前者的等位变异数(20个)低于后者 。本研究
表明 ,西藏野生二棱大麦的遗传多样性(0.5097)和
平均每位点的等位变异数(4.04)均同 Saghai Ma-
roof等(1994)[ 24] 和 Ivandic等(2002)[ 26]用 SSR研
究近东野生二棱大麦所得的遗传多样性(分别为
0.73和 0.79)和平均每位点的等位变异数(分别为
15.3和 12.9)存在明显的差异。Zhang 等(1994)用
酯酶同工酶和 rDNA标记研究指出 ,西藏的野生二
棱大麦的遗传多样性高于野生六棱大麦[ 19] 。冯宗
云等人未发表的 SSR研究结果还表明 ,西藏野生二
棱大麦的遗传多样性高于野生六棱大麦 ,野生瓶形
大麦是野生二棱大麦向野生六棱大麦进化过程中的
中间形式 。这些结果无疑是“西藏是野生大麦的起
源中心之一 ,西藏野生二棱大麦是中国栽培大麦的
唯一祖先”观点[ 2 , 13]的有力的证据。
本研究结果(表 3)表明 ,山南地区的野生二棱
大麦的遗传多样性及平均等位变异数在西藏的几个
地区中均是最高的 ,其顺序分别为:山南>昌都>日
喀则>拉萨>林芝>阿里及山南>昌都>阿里>林
芝>日喀则>拉萨 。从表 3还可看出 ,各 SSR位点
的地理分化(GST)变幅大 , 总变异的 1.08% ～
37.54%是由于地理分化引起的 ,平均为 13.09%,
表明西藏野生二棱大麦存在一定程度的地理分化。
χ2测验表明 ,大多数 SSR位点的等位变异频率在
各地区间的分布差异不显著 , 只有来自 3H 的
HVM44 、4H 的 HVM67 、5H 的 HVM64 、6H 的
HVM34 和 7H 的 HVDHN9 差异显著(P<0.05),
而 5H 的 HVM63 和 6H 的 HVM65 呈极显著差异
(表 3)。综上所述 ,我们可以推测 ,山南地区可能是
西藏野生二棱大麦的起源中心。
西藏同胞普遍传说青稞是公元 6世纪以后 ,文
成公主进藏时引入的。20 世纪 70 年代中期 ,轰动
了世界的西藏东部的昌都地区卡诺遗址[ 35]是距今
约 3500年的新石器时代遗址 ,该地区至今地上主栽
作物为青稞 ,而地下挖出来的考古遗存却为类似于
我国黄河中下游地区曾大量出土的“粟” 。西藏拉萨
市北郊距今约 3700年的“曲贡遗址”的重要发现与
发掘仍未能在青藏高原上找到史前青稞的遗迹[ 36] 。
1976年 ,西藏农牧科学院李长森等曾在西藏山南地
—51—
冯宗云等:应用微卫星标记研究西藏野生二棱大麦的遗传多样性及地理分化
区的错那县觉拉公社距耕地约数百米的荒坡上 ,发
现过一小片野生大麦群落[ 2] 。傅大雄等(2000)[ 21]
在地处雅鲁藏布江中部流域的西藏山南地区贡嘎县
昌果乡“昌果沟遗址”发现的古青稞炭化粒被认为是
整个青藏高原上发现的迄今最古老的青稞考古遗
存。这一发现表明 ,距今约 3500年的商代前期 ,居
住在西藏高原腹地雅鲁藏布江中部流域的藏族先民
已经从事于熟练的青稞农耕。山南地区是西藏开发
最早的地区 , 大麦资源极为丰富 。徐廷文等
(1984)[ 12]考察了收集的大麦样本指出 ,山南地区大
麦具有变异类型的多样性和主要遗传性状的显性基
因频率高等特点。Vavilov(1926)[ 1]认为“作物类型
最多的地方 ,往往是它们的原产地”和“生长在起源
中心的变种 ,一般含有大量的遗传显性基因” 。这使
人确信 ,西藏野生二棱大麦可能是以山南地区为起
源地 ,然后向藏东 、藏北 、藏西和藏南方向传播的。
致谢　四川农业大学徐廷文教授对本文提出了宝贵的
意见 , 在试验中还得到了周文娟女士的热情帮助 , 特此表示
衷心的感谢。
参考文献
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Genetic Diversity and Geographical Differentiation of Hordeum
vulgare ssp.spontaneum in Tibet Using Microsatellite Markers
Feng Zongyun＊＊＊＊＊＊ , Zhang Yizheng＊ , Zhang Lili＊＊＊ , Ling Hongqing＊＊
(＊Key Laboratory of Molecular Biolog y &Biotechnology , College of Life Sciences , Sichuan University ,
Chengdu 610065)
(＊＊The State Key Labo ratory of Plant Cell &Chromosome Engineering , Inst itute of Genetics &
Developmental Biology , Chinese Academy of Sciences , Beijing 100101)
(＊＊＊College of Ag ronomy , Sichuan Ag ricultural University , Yaan 625014)
Abstract
This paper studied genet ic diversity and geographical differentiation of 50 accessions of the tw o-rowed w ild
—52—
高技术通讯　2003.10
barley H .spontaneum from different regions of T ibet using 35 SSR markers f rom dif ferent locations of 7 barley
linkage g roups.The results showed that SSRs had high polymorphism , 1 ～ 14 alleles of each SSR locus were de-
tected w ith an average of 4.04 alleles/locus;The highest averages of both genetic diversi ty and alleles(0.4933
and 3.35 , respectively)were all occurred in Shannan region of Tibet.1.08%～ 37.54% of total variation w ith
the average 13.09% was produced by geog raphical differentiation.Finally , the issues on selection of SSR
primers and reliability of SSR markers as well as origin of Tibetan w ild barley w as discussed.Shannan region in
Tibet could be inferred to be a center of o rigin on Tibetan two-row ed wild barley , and also on Tibetan w ild bar-
lay , and on cultivated barley in China.
Keywords:Tibet , Wild barley , Simple sequence repeats , Genetic diversity , Origin , Geog raphical differen-
tiat ion
我国完成首例远程机器人定向神经外科手术
近日由北京航空航天大学机器人研究所 、中国人民解放军海军总医院神经外科中心与沈阳医
学院附属中心医院联合完成了一例远程遥控机器人立体定向神经外科手术 。海军总医院的神经外
科专家在北京通过计算机网络 ,遥控远在 600公里以外的医疗外科机器人系统 ,为沈阳一名 52岁
脑出血患者成功施行了手术。整个遥控手术持续了 50分钟 ,手术后 1个小时 ,患者右腿可以伸曲 ,
语言功能也恢复了。这是中国第一例由具有完全知识产权的机器人参与的外科手术 。
这次异地手术中的关键设备是北京航空航天大学机器人研究所研制的 5自由度医疗外科机器
人及其远程遥操作控制系统 ,该系统的研制得到了国家 863计划机器人技术主题的资助。早在
1997年 ,北京航空航天大学机器人研究所率先在国内开展了机器人辅助立体定向神经外科手术的
研究 ,先后开发了三代医疗外科机器人系统 ,并在海军总医院成功进行了 500多例手术。本次用于
异地远程遥控机器人立体定向神经外科手术的机器人属于第四代主动式医疗外科机器人 。
远程医疗外科机器人系统由计算机规划和导引软件 、五自由度机器人系统 、网络通讯 、基于立
体视觉的标定模块等几部分组成。手术时首先将标记点固定在病人头上 ,然后进行 CT 扫描。CT
扫描结果及现场所有的影像 、声音都通过 ADSL 传回北京。利用立体视觉得到机器人操作空间到
图像空间的映射变换关系后 ,医学专家进行手术规划以确定手术穿刺的位置 、角度和深度 ,规划好
的路径显示在重建的三维模型上 ,并传回手术现场 ,控制机器人移动其末端的手术探针到达指定的
穿刺位置和姿态 ,医生以固定在机械臂末端的工具作为手术器械的固定支架 ,进行各种手术操作。
我国正在逐步成为医疗器械的生产和使用大国 ,发展我国自己的医用机器人和数字化医疗设
备产业 ,对于提高人民生活质量 、促进医疗体制改革具有重要现实意义 。同时 ,对于信息 、新材料 、
自动化和机器人等交叉学科的前沿高技术发展 、高层次人才培养 、标准专利战略实施也都具有积极
的促进作用 。
(北京航空航天大学机器人研究所　丑武胜)
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冯宗云等:应用微卫星标记研究西藏野生二棱大麦的遗传多样性及地理分化