全 文 ：药物分析杂志 h Ci nJPh ar m A nl a2 008 , 2 8 ( 2 )
R P 一 H P L C 同时测定菠莫药材 中总棚皮素和 山奈酚含量
颜彦 ’ , 李文霞 2 , 叶晓川 ’ *
( 1
. 华中科技大学生命科学与技术学院药物研究所 , 武汉 4 3 0 074 ;2 . 华中科技大学化学系 , 武汉 4 3007 4)
摘要 目的 : 建立同时测定藉葵药材中懈皮素和山奈酚含量的反相高效液相色谱法 。 方法 : 色谱柱 : iL ch or sP h er C . 8柱 ( 250 m m
x 4
.
6 m m
,
5 协m ) , 流动相 : 甲醇 一 0 . 5% 磷酸水溶液 ( 5 5 : 45 ) , 流速 : 1 . o m L · m in 一 ’ , 检测波长 : 365 n m 。 结果 :棚皮素在 2 . 97 -
29
.
7 卜g · m L 一 ’浓度范围内线性关系 良好 ( ; = 0 . 9 99 ) , 山奈酚在 3 . 01 一 30 . 1 畔 · m L 一 ’ 浓度范围内线性关系良好 ( : 二
0
.
9 9 )
, 方法回收率分别为 98 . 9% 和 9 . 7% 。 结论 : 本方法简便 、准确 , 灵敏度高 , 重复性好 , 可为评价被莫药材质量提供依
据 。
关键词 :菠莫 ;榭皮素 ;山奈酚 ; R P 一 H P L C
中图分类号 : R g 1 7 文献标识码 : A 文章编号 : 0 2 54 一 179 3 ( 2 00 8 )0 2 一 02 8 8 一 03
R P 一 H P L C s im u l t a n e o u s d e t e r m i n a t i o n o f q u e r c e it n
S舰 ial x c h in a L .
2 , Y E x i a o 一 e h u a n l `a
.
m
.
xla n d k a e m P fe r o l
Y A N Y
a n l
,
L l W
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( 1
.
C
o
l l e g e o f l
一
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e i e n ( e a n d T
e e h n
o
l
o舒 , H u a zh o n g U n i v e sr i t y o f S e j e n e e a n d 『l ’ e 〔 h n o l o群 , W u h a n 4 3 0 0 7 4 , Ch i ,l a ;
2
.
D e l , a , l f n e r , t o f C h e
; n
i
、 *:了 , H u a z }1〔 ,n g U n i v e o i t y o f Se i e n o e a n d T e e h n o l o爵 , W u h a n 43 0 0 7 4 , Ch i n a )
A b s t r a e t o bj e e t iv e
: T o e s t a b l i s h a n R P 一 H P LC m e th o d fo r th e d e t e r m i n a ti o n o f q u e r e e t i n a n d k a e m p fe r o l e o n t e n t
in s m i l a x e h i n a L
·
M
e t h o d s : T h
e
C
,: e o l u m n ( 2 5 0 m
, n x 4
.
6 m m
,
5 林m ) w a s u s e d fo r a n a l y s i s , m e t h a n o l 一 0 . 5%
H 3 P o
、
( 5 5 : 4 5 ) 。 、 m o b i l。 p h a s e w i t h d e * e e t io n w a v e le n g th 3 6 5 n m
,
1
.
0 m L
·
m i n
一 ’ o f fl o w r a te a n d e o l u m n te m p e r
-
a t u er a t r o o m 一e m P e r a t u r e . R e s ul t s : Qu e r e e ti n a n d k a e m P fe r o l s h o w e d a g o o d l i n e a r e u vr e i n th e ar n g e o f 2
.
9 7 -
2 9
.
7 协g · m L 一 ’ ( r = 0 . 9 9 9 9 ) a n d 3 . 0 1 一 3 0 . 1 协g · m L 一 ’ ( r = 0 . 9 9 9 9 ) , er s p e e t i v e l y
.
hT
e , e o v e r i e s o f q u e r e e ti n
a n d k a e m p介 or l w e r e 9 8 . 9% a n d 9 9 . 7% . C o n e l u s i o n : T h i s s im p l e a n d r e p or d u e i b l e H P LC a n a l y s i s p r o v i d e d r e fe r -
e n e e ro e s t i m a te th e q u a li t y o f Sm i lax
e h i n a L
.
Th e a n a l y t i e a l er s u l t s w e r e r e li a b l e a n d a e e u r a te
.
K e y w o r d s
:
Sm i l a x e h i n a L
.
: q u e r e e ti n ; ka e m p fe or l : R P 一 H P LC
中药菠莫为百合科植物筱莫 s m ial 二 。 ih n。 L. 的
干燥根茎 ,又称金刚藤 , 具有祛风利湿 、 解毒散癖的
功效 〔 ’ 」 ,临床上主要用于附件炎 、 附件炎性包块及
妇科多种疾病的治疗 , 有较好疗效 。 目前筱莫药材
及制剂的质量控制主要 以薯祯皂 首元的含量为指
标 ,而近期报道菠莫中含有具较强生理活性作用 的
懈皮素 、 山奈酚及其昔等黄酮类化合物 { 2 一 ` 一 。 为了
更好地控制被葵药材的质量 , 有必要进一步建立黄
酮类成分的含量测定方法 。 文献报道 H PL C 法测定
被莫中棚皮素 、 山奈酚含量 的方法 LS」 , 是以被莫中
提取出的乙酸乙酷提取物为研究对象 ,而非药材中
2 种物质的含量测定方法 。 而且其所用流动相体系
复杂 ,分离度有限 ,直接用于被莫药材中 2 种物质含
量测定时 ,不能和相邻峰达到基线分离 。 本文摸索
了筱莫样品提取和水解最佳条件 ,采用简单的流动
相体系 ,使目标物质得到了良好的分离 ,并进行了方
法学验证 。 试验结果表明 , 该方法简便 、快速 、准确 ,
为被葵药材的质量控制建立 了合理的分析方法 。
1 仪器与试药
A ig le
n t 1 1 0 0 高效液相色谱仪 (美国安捷伦公
司 ) : G 1 3 l l A 四元泵 , G 13 13 A 自动进样器 , G 13 14 A
紫外检测器 , 1G 3 16 A 柱温箱 , A isl en t 色谱工作站 。
乙睛为色 i普纯 ,用于液相甲醇为色谱纯 ,水为超纯
水 , 其余试剂均为分析纯 ;榔皮素和山奈酚对照品 (含
* 通讯作者 T e l : ( 0 2 7 ) 87 7 9 2 14 7 ; E 一 m a i l : yo e e @ s o h u . C o m
DOI : 10. 16155 /j . 0254 -1793. 2008. 02. 013
药物分析杂志 h Cin J ph r am A n al 2 0 0 5, 2 8 ( 2 )
量测定用 ,购自中国药品生物制品检定所 ) ; or 种不同
产地的获莫药材分别由湖北中医学院及湖北福人药业
股份有限公司提供 ,经本所叶晓川研究员鉴定为百合
科筱葵属植物筱莫 S im lo hc ina L 的干燥根茎 。
2 色谱条件及测定条件
色谱柱为 iL hc or s p he r C l 、柱 (江苏汉邦科技有限
公司 , 2 5 0 m m x 4 . 6 m m , 5 卜m ) ;流动相为甲醇 -
0
.
5% 磷酸水溶液 ( 5 5 : 4 5 ) ;流速 x . 0 m r · m in 一 ’ ;检
测波长为 3 65 n m ;柱温为室温 。 在此色谱条件下榭
皮素 、 山奈酚与其他组分分离完全 ,棚皮素 、 山奈酚
的保留时间分别为 10 . 7 m in , 18 . 6 m in ,理论塔板数
以棚皮素 、 山奈酚计分别为 6 243 和 9 439 。 见图 1。
「一一一一 一丁一一一一一 一「一一一一一 丁一 一一一 「一一一一
0 以〕 2 0
2 0 t /m i n
图 l 对照品 ( A ) 和样品 ( B )色谱图
F
: 9 1 C h ,。 m爪 o g r a m s o f l、 fe r o n e e 、 u bo ta : l e e 。 ( A ) a r、 d 、 a n平 Ie ( B )
1
. 棚皮素 ( 。l u e l℃ e t i n ) 2 . r上l奈 酚 ( k a e m p丘 r o l )
3 溶液的制备
3
.
1 对照品溶液 分别取棚皮素 、 山奈酚对照品适
量 ,精密称定 , 用 甲醇溶解制成每 1 m L 含棚皮素
0
.
03 m g
、 山奈酚 0 . 03 m g 的溶液作为对照品溶液 。
3
.
2 供试品溶液 取被莫粉末 (过三号筛 ) 2 9 ,精
密称定 ,加人甲醇 50 m L , 回流提取 Z h , 过滤 , 收集
滤液 。 滤渣加 3 0 m L 甲醇继续回流 l h , 过滤 , 洗涤
残渣 , 合并滤液 ,定容至 10 0 m L 量瓶 。 从中精密吸
取提取液 25 m L ,加入 25 % 盐酸 2 . s m L , 85 ℃水解
4 h
, 水解液蒸干 ,残渣用 25 m L 饱和氯化钠溶液分
次转移至分液漏斗中 ,用 乙酸乙醋萃取 4 次 ( 25 , 25 ,
2 0
,
2 0 m L )
。 合并萃取液 ,蒸干 。 残渣用甲醇溶解
并转移至 10 m L 量瓶中 , 甲醇稀释至刻度 ,摇匀 , 以
0
.
45 林m 微孔滤膜滤过 ,取续滤液 ,即得 。
4 方法与结果
4
.
1 线性关系考察 精密吸取上述对照 品溶液
1
.
0
,
2
.
0
,
3
.
0
,
4
.
0
,
6
.
0
,
8
.
0
,
10
.
0 m L
,分别置 10 m L
量瓶中 ,加甲醇稀释至刻度 ,摇匀 , 滤过 ,取续滤液进
行 H PL c 测定 。 以所得峰面积为纵坐标 , 棚皮素和
山奈酚的浓度为横坐标进行线性回归 ,结果棚皮素 、
山奈酚的标准曲线分别为 :
Y = 4 0 83 x 10
4
X 一 2
.
4 5 O r = 0
.
9 9 9 9
Y = 3
.
7 7 2 x I O
4X 一 5
.
5 6 9 r = 0
.
9 9 9 9
表明懈皮素 、 山奈酚浓度分别在 .2 97 一 29 · 7 林g ·
m L
一 ’及 3 . 01 一 3 0 . 1 林g · m L 一 ’ 范围内时 , 与峰面积
呈 良好的线性关系 。
4
.
2 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液 , 同日
内重复进样 6 次 ,计算 日内精密度 ,求得棚皮素和山
奈酚峰 面 积 的 R SD ( n 二 6 ) 分 别为 0 . 09 % 和
0
.
10 %
。 将同一对照品溶液在室温下考察 s d ,结果
棚皮素和山奈酚峰面积的 日间 RS D ( n 二 5) 分别为
2
.
6% 和 1 . 0% , 显示精密度良好 。
4
.
3 稳定性试验 取同一供试品溶液 ,分别于 O ,
2
,
4
,
6
,
8
,
10 h 进样测定 。 结果懈皮素 、 山奈酚含量
的日内 RS D ( n = 6 )分别为 2 . 8% , 1 . 4% 。 将同一供
试品溶液在室温下考察 s d ,结果榭皮素 、 山奈酚含
量的 日间 R SD ( 3 d) 分别为 3 . 5% 和 2 . 7% 。 表明供
试品溶液在 3 d 内稳定 。
4
.
4 重复性试验 取同一批被葵粉末 5 份 ,按照供
试品溶液的制备项下方法操作 , 制得 5 份供试 品溶
液 ,测定并计算各份供试品溶液中棚皮素和山奈酚
的含量 ,其 R S D ( n 二 5) 分别为 1 . 7% 和 3 . 0% 。
4
.
5 回收率测定 采用加样回收法 ,精密称取已知
含量的同批获莫粉末 (懈皮素含量 0 . 0 2 3 8% , 山奈
酚含量 。 . 0 65 % ) 6 份 ,每份约 2 9 ,分别精密加人棚
皮素 、 山奈酚对照 品溶液 (懈皮素含量相当于 0 . 1
m g
·
m L
一 ` , 山奈酚含量相当于 0 . 02 m g · m L 一 ` )5
m L
,按上述样品溶液的制备方法及色谱条件 , 进行
平行测定 。 结果棚皮素和山奈酚的平均回收率分别
为 98 , 9 % 和 9 9 7 % , RS D 分别为 0 . 6% 和 3 . 0 % 。
4
.
6 样品测定 按上述方法操作 ,测定 10 种来自
不同产地的样品 ,外标法计算含量 ,结果见表 l 。
一 29 0一 药物分析杂志 C hi n JP ha r mA n al 2 8 0 0, 2 8 ( 2 )
T a b l
表 1 不同产地筱羹药材中棚皮素和山奈酚的含量测定结果 ( % , n = 2)
n a n d k a e m P fe r o l e o n t e n t o f s m i耘比 e h in a L . e ol l e e te d fr o m id fe r e n t h a b i at t s 《% , n 二 2 )
编 号
( N
o
.
)
产地
( 1
1
ab
l t、 )
棚皮素
( q
u e r 〔 e ti , 1)
山奈酚
( k
a e ,l o p fe , 0 1 )
气z勺`怪」9飞é了000
0 1
02
0 3
汉
0 5
0 6
湖北通城 C A P 种植基地 ( lT l e G A p ( u ]it 、 a r io ,, l, a s e , oT :19讨 l e , 1` , H u b e i )
安徽坟天山 ( F e , 1 [i a 们 H I l l , A n h u i )
福建仙游 ( X i a n y o u F u ji a : , )
湖北安陆 ( A n l u , H u l , e i )
广西宾阳 ( B i n y a , 19 , C t , a n群 i )
重庆马脚令 LI一( M aJ 以 o li rl g H i ] I , C l l o n g一i :19 )
江西九江蔡岭镇 ( C o i l i , 19 C u o n一y , J i uj la n g . Ji a n邵i )
浙讹J二温州上塘镇 ( S h a ,:哥a . 1笔 C o u fl r y ,傲r l z h。 ,u , Z h灼 i a n g )
湖南字I` J旧黎家坪镇 ( l 』 ij i a p rl g C . )、」: lt y . Qi y an g , H u n a 。 )
广东省从化县江浦镇 ( J j a , 1` p u C、川 n t y , C o , lg h L,a , G u a n g d。 , 19 )
0
.
0 2 10 0
.
0 18 1
0 0 26 6
0 28 3
0 23 8
0 0 2 5 8
0
.
0 18 6 0
.
00 5 8
07
0 8
0
.
0 ] 3 2
0
.
00() 3
0
0 9
l 0 0
.
0 0 ] 5
注 ( r, o t e ) : “ z洲 ” 代友末检出 ( “ / ’ ` r叮 , er 、 e . l l ,】o 一。 lo L。 。 l e d )
5 讨论
5
.
1 流动相的选择 最初曾选用文献报道 的水 -
乙睛 一 磷酸 一 三 乙胺 ( 6 5 : 3 5 : 0 . 2 7 : 0 . 45 )系统作为
流动相 ,但分离状况不佳 ,进而对其比例不断进行调
整 ,但主成分峰始终未能得到较好的分离 。 改用 甲
醇 一 水 一磷酸系统后 , 主峰与杂质峰的分离得到改
善 ,通过进一步调整各组分比例 ,最终确定流动相组
成为甲醇 一 0 . 5% 磷酸水溶液 ( 5 5 : 45 ) ,在此条件下
目标物质与其他杂质峰得到了 良好的分离 , 且保留
时间合适 ,峰形 良好 (图 ! 一 B ) 。
5
.
2 提取溶剂的选择 对甲醇 、 乙醇 、 乙酸乙醋 3
种不同提取溶剂的提取效果进行了 比较 , 结果显示
甲醇回流提取所得含量最大 ,故选择甲醇作为提取
溶剂 。
5
.
3 提取时间考察 比较了 l 次回流提取 ( 0 5 , l ,
2
,
3
,
4 h )和 2 次提取 ( Z h , l h ; Z h , Z h ; Z h , 3 h )所
得含量的差异 。 发现提取时间延长则含量也随之上
升 , 而相同提取时间 , 2 次提取所得含量大于 1 次提
取 。 所考察的 3 种 2 次提取方式所得含量相差不显
著 , 从节约时间 的角度考虑 , 选择 2 次提取 ( Z h , 1
h )
。
5
.
4 盐酸加入量对水解的影响 因本法测定盐酸
水解后游离懈皮素和山奈酚的含量 , 故对盐酸加人
量也进行了考察 。 取同一样品 ,加人不同量的 25 %
盐酸 ( 2 . 5 , 5 . 0 , 10 , 巧 m )L 进行水解 ,其他试验条件
均同本文方法 。 结果发现不同酸量所得山奈酚含量
之间相差不显著 , 但 2 . 5 m L 酸所得棚皮素含量略
高 , 故选择最佳酸量为 25 % 盐酸 2 . 5 m L 。
5
.
5 不同水解时间的考察 确定盐酸用量后 ,对水
解时间也进行了考察 。 相同样品分别水解 1 , 2 , 3 ,
4
,
s h
。 结果表明从 l h 到 4 h ,随着水解时间延长 ,
测得含量呈上升趋势 ,水解 s h 所得含量与水解 4 h
含量无显著差异 ,故选择 4 h 作为水解时间 。
5
.
6 懈皮素和山奈酚在被莫药材中的主要存在形
式 在研究中发现 , 未水解的样品中棚皮素和 山奈
酚的含量极低 ,水解后含量显著上升 ,提示这 2 种物
质在被莫中主要以昔的形式存在 。
5
.
7 影响药材含量的因素 从上述测定的结果可
知 , 不同产地被莫中懈皮素和山奈酚的含量有 明显
差别 ,说明生态环境 、采收时间及年限等差异可能对
棚皮素和山奈酚的含量造成影响。
参考文献
一 C h P (中国药典 ) . 2 00 5 . Vo l l (一部 ) : 2 16
2 R u A N Ji n 一 lan (阮金 兰 ) , z O U J ian (邹健 ) , C A I Y a 一 110 9 (蔡亚
玲 ) . S t u di e , ` ) n e h e n , i o al e o n s r i zu e n一s e f sm i lax 认 i n 。 (孩莫的化学
成分研究 ) . J Ch i n M e d M e : e r ( ,书药材 ) , 2 0() 5 , 2 8 ( l ) : 24
3 X U J i n g (许靖 ) , L I X ian (李铣 ) , ZH AN C p e n g (张鹏 ) , e t a l . C h e n 卜
i c
a
l c o n
s ti t u e n l s o f fl a
v a n o id s ofr m mS ilt
l 」 bo c ki i w a r b (金刚藤的黄
酮类化学成分 ) . J S he 月ay gn hP a rm lU ivt (沈阳药科大学学报 ) ,
20() 4
,
2 1 ( 6 ) : 4 2 4
4 F E N G F e n g ( 冯峰 ) , LI U W e n 一 y u an (柳文媛 ) , C H E N Y o u 一 、 h即 g
(陈优生 ) , ` t a l . f ’ l a v o n o id s a n d s t slb e n e s ofr m S , n i l a x cl} i n a (菠契中
黄酮和茂类成分的研究 ) . J hC i、 外 a mr nU i: (中国药科大学学
报 ) , 2 0 3 , 3 4 ( 2 ) : 1一9
5 S H U X i a。 一 S h u n (舒孝顺 ) , G A 0 z h o n g 一 h o n g (高中洪 ) , Y AN G
X i
a n g 一 l i a n g (杨祥良 ) D e t e rm i n a l i o n o f k a e m p fe ol l a n d q u e cr e Li n i n
S n
, i lax hc i n a b y RP 一 H p L C ( R P
一 H p L C it[J 时测定菠莫中山奈酚
和檄皮素的含量 ) . hC in hP a n ] (中国药学杂志 ) , 2 0 06 , 41 ( 6 ) :
4 5 4
(本文于 20 0 6 年 1 1 月 13 日收到 )