全 文 ：收稿日期:2008-05-26
基金项目:贵州省自然科学基金(2005)2020号。
作者简介:朱国胜(1971-),男 ,助理研究员 ,硕士 ,主要从事药用植物
菌根菌及药用真菌研究;E-mail:zgsah@yahoo.com.cn。
通讯作者:刘作易 , E-mail:liuzuoyi@yahoo.com.cn。
云南独蒜兰菌根菌研究
朱国胜 1, 2 , 　桂　阳 1, 3 , 　刘作易 1
(1.贵州省农业生物技术重点实验室 , 　贵阳 550006;　2.贵州省生物技术研究所 , 　贵阳 550006;
3.贵州省果树科学研究所 , 　贵州 罗甸 550100)
摘要:主要报道了云南独蒜兰菌根菌的种类 ,在根中的分布及其动态变化特点 ,根据其特点提出了云南独蒜兰菌根菌的
应用思路 ,并对兰科植物菌根菌单菌丝团分离方法提出了改进措施。
关键词:　云南独蒜兰;菌根菌;菌丝团;角菌根菌;瘤菌根菌
中图分类号:　S682.31　　　文献标志码:　A　　　文章编号:　1001-4705(2008)10-0035-07
StudyonMycorrhizalFungiofPleioneyunnanensis
ZHUGuo-sheng1, 2 , GUIYang1, 3 , LIUZuo-yi1
(1.GuizhouKeyLaboratoryofAgriculturalBiotechnology, Guiyang550006, China;
2.InstituteofBiotechnology, GuizhouAcademyofAgriculturalScience, Guiyang550006, China;
3.InstituteofFruit, GuizhouAcademyofAgriculturalScience, Luodian550100, China)
Abstract:Thespecies, distributionanddynamicchangesofmycorhizalfungifromPleioneyunnanensiswere
reported.Theapplicationofthesemycorhizalfungiwereputforwardaccordingtothesecharacteristics.Some
improvingmeasuresweregiventoisolateorchidmycorrhizalfungifromasinglepeloton.
Keywords:　Pleioneyunnanensis;mycorrhizalfungi;peloton;Ceratorhiza;Epulorhiza
　　云南独蒜兰 (Pleioneyunnanensis(Rolfe)Rolfe)
为兰科独蒜兰属植物 ,以假鳞茎入药 ,习称冰球子 ,和
独蒜兰 、杜鹃兰的假鳞茎统称为山慈姑 ,味辛 、甘 ,性
寒 ,主产于贵州 ,销吉林 、辽宁 、内蒙古 、北京 、河北 、浙
江 、湖北等省 [ 1] 。为《中国药典》收载品种 ,贵州苗族 、
侗族药 ,具有清热解毒 、止咳化痰 ,止血生肌。主治肺
结核 ,百日咳 ,气管炎 ,痈肿 , 消化道出血 , 外伤出血
等 [ 2] 。近年来 ,由于其含有的秋水仙碱具有抗肿瘤的
活性 ,山慈姑市场需求量不断增加。但其种子小 ,自然
状态下很难成功萌发及生长 ,同时其生长周期长 ,生长
环境独特 ,这使其栽培难成功 ,市场上的山慈姑主要来
源于野生资源 ,致使野生资源破坏严重 。云南独蒜兰
已列入 《濒危动植物种国际贸易公约(CITES)》[ 4] 。近
100年来的研究表明 ,兰科植物种子萌发和植株生长
与其共生菌根真菌存在密切关系。对云南独蒜兰的菌
根菌进行研究 ,了解云南独蒜兰菌根真菌的多样性 ,对
筛选出种子萌发菌及幼苗促生菌 ,并实现云南独蒜兰
的人工栽培具有重要的作用。
1　材料与方法
1.1　材　料
云南独蒜兰:采自贵州雷公山野生云南独蒜兰 。
1.2　培养基
1.2.1　双抗 PDA培养基:20g马铃薯全粉 , 20g葡萄
糖 , 13g琼脂粉(强度 1 300g/cm3),加蒸馏水至 1 000
ml, 121℃灭菌 20min,冷却倒平板前 ,加入青霉素和
链霉素 ,其浓度均为 150μg/ml。
1.2.2　PDA培养基:20g马铃薯全粉 , 20g葡萄糖 , 13
g琼脂粉(强度 1 300g/cm3),加蒸馏水至 1 000ml, 121
℃灭菌 20min。
1.2.3　水琼脂培养基:6 g琼脂粉 (强度 1 300 g/
cm3), 1 000ml水 , 121℃灭菌 20min。
1.2.4　BDDifcoPDA培养基:39 gBDDifcoPDA粉
末 , 1 000ml蒸馏水 , 121℃灭菌 15min。
1.2.5　BDDifcoCMA培养基:17gBDDifcoCMA粉
末 , 1 000ml蒸馏水 , 121℃灭菌 15min。
1.2.6　染色纤维素 [ 5] :10g微晶纤维素悬浮于 50℃
蒸馏水中 , 加入 100 ml0.7%活性鲜蓝 R(Remazol
BriliantBlueR, RBBR),剧烈搅动约 35min,期间少量
多次加入 20gNa2SO4 ,加入 10mgNa3PO4 , pH值调至
·35·
研究报告　　朱国胜 等:云南独蒜兰菌根菌研究
DOI :10.16590/j.cnki.1001-4705.2008.10.046
12左右 ,使 RBBR固定于纤维素上。悬浮物再搅拌 1
h,过滤 ,用 60℃蒸馏水清洗至水无色 。再用丙酮和乙
醚漂洗至漂洗液无色 , 45℃烘干。
1.2.7　纤维素酶活测定培养基 [ 6] :先配制冻存管下
层 ModifiedPeterssonmedium,纤维素 10g, NH4H2PO4
2.0g, KH2PO4 0.6g, K2HPO4 0.4g, MgSO4· 7H2O0.5
g,柠檬酸铁 10mg, ZnSO4 · 7H2O4.4mg, MnSO4· 4
H2O5.0mg, CaCl2 55mg, CoCl2· 6H2O1.0mg,维生
素 B1 100μg,酵母提取物 1g,琼脂粉 7.5g, 1 000ml
dH2O,混均后分装入 1.8ml冻存管 , 121℃灭菌 15min
后 ,冷却备用 。然后配制 2%染色纤维素 ,配制 A液
2 /3V水配制得 ModifiedPeterssonmedium(不含琼脂
粉),再配制 B液 1/3V水与足量的染色纤维素混合 ,
A、B液分别 121℃灭菌 15min,然后趁热混合 ,移 0.5
ml装入有固体 ModifiedPeterssonmedium培养基的冻
存管中 , 4℃保存备用。
1.2.8　多酚氧化酶测定培养基 [ 7] :A液:5g单宁酸 ,
200mldH2O121℃灭菌 15min;B液:15gdifco麦芽浸
膏 , 20 gdifco琼脂 , 800 mldH2O121℃灭菌 15min。
灭菌后趁热将 A液和 B液混合 ,然后分装入 1.8ml冻
存管 ,每管 1ml, 4℃保存备用 。
1.3　其他试剂
荧光染色液 (20 ml):Tris30 mg, EDTA7.5 mg,
NaCl20mg, 5-Bromo-2′-Deoxyuridine6μg, Phenylendia-
mine20mg, Hoechest33258 18 μg,甘油 12ml,蒸馏水
8ml。
1.4　方　法
1.4.1　菌根菌单菌丝团分离法 [ 3] :选取健康云南独
蒜兰的健康根 ,自来水冲洗去除表面的泥土 、杂质及其
他附着物 ,对于去不掉的附着物 ,用解剖针轻轻刮除 ,
显微镜检 ,选择有菌丝团的根 ,用大量无菌水冲洗 ,然
后利用解剖针在无菌水中进一步刮根表面 ,使菌丝团
释放入蒸馏水 ,由老根制备的菌丝团 18℃静置诱导其
萌发 ,然后将由老根制备并萌发的菌丝团或由幼根制
备的菌丝团 ,通过移液枪转接到小块双抗 PDA培养
基 ,并于 18℃培养 ,再显微镜检并将开始生长的菌丝
团 ,利用手术刀切取并转接双抗 PDA培养基或水琼脂
培养基 ,并在 18 ℃进行纯化培养 , 纯化的菌株转接
PDA培养基 24℃培养 ,最后分离的菌株保存于 4 ℃
冰箱。
1.4.2　菌根菌细胞核染色观察:利用 60cm的 PDA
平板培养菌根菌 ,当菌根菌生长至菌落直径 2 ～ 3cm
时 ,利用直径 1cm的打孔器 ,打取 1cm的菌片 ,转接
至 90cm无菌培养皿底(有菌丝面贴培养皿),反转培
养皿 ,并向皿盖内加入无菌水保湿 ,并于 24℃培养 ,当
菌丝从菌片处生长至 2 ～ 3cm时 ,取培养皿并向菌丝
滴加荧光染料 ,盖上盖玻片 ,于 OLYMPUSBX51荧光
显微镜下观察细胞核数 ,利用 DP70成像系统照相。
1.4.3　BDDifco标准 PDA和 CMA培养基培养及观
察:培养方法同菌根菌细胞核染色观察 ,观察时 ,先在
OLYMPUSBX51显微镜低倍镜下找到念珠状细胞和
菌丝 ,然后滴蒸馏水 ,高倍镜观察并利用 DP70成像系
统照相及测量念珠状细胞及菌丝大小 。
1.4.4　纤维素酶活测定方法[ 6] :直径 60cmPDA平板
培养菌根菌 ,待菌落长至直径 2 ～ 3cm时 ,用直径 0.4
cm的打孔器打取菌片 2片接入纤维素酶活测定培养
基的上层液中 , 25 ℃培养 30d,观察下层培养基颜色
的变化情况 ,变蓝的为纤维素酶活阳性 ,不变色的为纤
维素酶活阴性。
1.4.5　多酚氧化酶酶活测定方法[ 7] :直径 60cmPDA
平板培养菌根菌 ,待菌落长至直径 2 ～ 3cm时 ,用直径
1cm的打孔器打取菌片 1片接入多酚氧化酶酶活测
定培养基 ,菌片无菌丝面与培养基接触 , 25 ℃培养 30
d,观察多酚氧化酶培养基颜色的变化情况 ,接种点变
褐为多酚氧化酶酶活阳性 ,不变色为多酚氧化酶酶活
阴性。
1.4.6　菌丝生长速率测定方法:打取直径 0.4 cm的
PDA培养基培养的菌片接种直径 60cm标准培养基平
板 ,经过平板的背面接种菌片的正中心画线 ,共画 4条
线 ,形成由中心向外的八个方向的线 。从接种的第 2
天开始 ,每天观察菌丝生长情况 ,如开始生长 ,则记录
由接种至开始生长的时间 ,同时在八个方向的线上菌
丝生长点画线 ,记录时间 ,连续画 3 ～ 5次 ,对于生长慢
的要画 5 ～ 10次。选择中间稳定生长的 3 ～ 4次画线
间的距离 ,计算生长时间 ,然后用距离除时间 ,算出八
个方向生长速度 ,确定生长速度范围及平均值 。
2　结果分析
2.1　云南独蒜兰新生根中菌根菌种类
2.1.1　CeratorhizaspGZAAS0007(图 1):BDPDA培
养基培养早期菌丝贴培养基生长 ,菌落边缘整齐 ,厚薄
均匀 ,后期产生大量白色气生菌丝 ,菌丝平均生长速度
0.132mm/h,菌丝平均直径 3.92 ～ 5.23μm,细胞平均
长 76.19 ～ 102.12 μm,念珠状细胞球形或阔椭圆形 ,
平均大小(14.13 ～ 14.84)μm×(13.12 ～ 13.57)μm,
念珠状细胞链长度一般 5个细胞内 ,分枝第 1隔与分
枝点的距离为 2.54 ～ 4.23μm;BDCMA培养菌丝贴培
养基生长 ,不形成气生菌丝 ,难形成念珠状细胞 ,平均
生长速度 0.206 ～ 0.215 mm/h,菌丝直径 1.48 ～ 3.27
·36·
第 27卷　第 10期　2008年 10月　　　　　　 　　　　　种　子　(Seed)　　　 　　　　　　　Vol.27　No.10　Oct.　2008
μm,细胞长 49.45 ～ 60.26μm,分枝第 1隔与分枝点的
距离为 3.73 ～ 5.98μm;主杆菌丝和分枝直 ,向外放射
状生长 ,分枝较长 ,分枝与主杆菌丝呈锐角 ,分枝稍缢
缩或不明显 ,纤维素酶活阳性 ,多酚氧化酶活阴性 ,菌
丝自融合 ,菌丝圈较松散 ,中间空。
图 1　 CeratorhizaspGZAAS0007菌落及显微结构特征
　　注:1-1.BDPDA培养基培养菌落;1-2.BDCMA培养基培养菌落;
1-3.念珠状细胞形态;1-4.细胞核荧光染色观察显示为双核;1-5.菌丝
自融合 ,箭头所指显示菌丝融合点;1-6.菌丝分枝及菌丝圈标尺长度:
200μm。
2.1.2　CeratorhizaspGZAAS0006(图 2):BDPDA培
养基培养 ,菌丝贴培养基和侵入培养基生长 ,不形成气
生菌丝 ,菌落表面浅米黄色 ,粉状 ,菌落中间厚边缘薄 ,
边缘不整齐 , 侵入培养基生长 , 菌丝平均生长速度
0.123 ～ 0.133mm/h,菌丝直径 3.62 ～ 4.45 μm,细胞
长 89.20 ～ 137.49 μm,念珠状细胞球形或阔椭圆形 ,
平均大小 15.68μm×13.12μm,念珠状细胞链一般 5
个细胞内 ,分枝第 1隔与分枝点的距离为 2.03 ～ 3.35
μm;BDCMA培养菌丝贴培养基生长 ,不形成气生菌
丝 ,平均生长速度 0.196 ～ 0.203mm/h,菌丝直径 7.81
～ 8.35μm,细胞长 107.71 ～ 268.44μm,分枝第 1隔与
分枝点的距离为 4.58 ～ 6.05μm;主杆菌丝和分枝直 ,
向外放射状生长 ,分枝短 ,分枝与主杆菌丝呈锐角 ,分
枝缢缩明显 ,纤维素酶活阳性 ,多酚氧化酶活阴性 ,菌
丝自融合 ,菌丝圈较松散 ,中间有稀疏菌丝 。
2.1.3　CeratorhizaspGZAAS0016(图 3):BDPDA培
养基培养早期菌丝贴培养基和侵入培养基生长 ,菌落
表面呈白色粉末状 ,菌落中间厚 ,边缘薄 ,边缘不整齐 ,
侵入培养基生长 ,后期产生少量白色柔毛状气生菌丝 ,
菌丝平均生长速度 0.05 2 ～ 0.061 mm/h, 菌丝直径
3.51 ～ 3.69μm,细胞长 78.27 ～ 81.07μm,念珠状细
胞长椭圆形或长卵形 ,平均大小 20.56 μm×10.57
μm,念珠状细胞链常超过 5个细胞 ,分枝第 1隔与分
枝点的平均距离为 3.63 ～ 4.17μm;BDCMA培养菌丝
贴培养基生长 ,不形成气生菌丝 ,平均生长速度 0.154
～ 0.162 mm/h, 菌丝直径 2.08 ～ 6.85 μm, 细胞长
43.85 ～ 50.23μm,念珠状细胞长卵形或长椭圆形 ,分
枝第 1隔与分枝点的平均距离为 2.67 ～ 4.45 μm;主
杆菌丝直 ,向外放射状生长 ,分枝短而弯曲 ,分枝稍缢
缩或不明显 ,纤维素酶活阳性 ,多酚氧化酶活阴性 ,菌
丝自融合 ,菌丝圈较松散 ,中间空。
图 2　 CeratorhizaspGZAAS0006菌落及显微结构特征
　　注:2-1.BDPDA培养基培养菌落;2-2.BDCMA培养基培养菌落;
2-3.念珠状细胞形态;2-4.细胞核荧光染色观察显示为双核;2-5.菌丝
自融合 ,箭头所指显示菌丝融合点;2-6.菌丝分枝及菌丝圈标尺长度:
200μm。
2.1.4　EpulorhizaspGZAAS0005(图 4):BDPDA培
养基培养菌丝贴培养基生长 ,形成米黄略带红色菌落 ,
菌落边缘整齐 ,厚薄均匀 ,不形成气生菌丝 ,菌丝平均
生长速度 0.039 ～ 0.045 mm/h,菌丝直径 1.64 ～ 1.69
μm,细胞长 7.59 ～ 23.57μm,念珠状细胞近球形 ,径向
直径常大于纵向直径。细胞表面常出现不光滑现象 ,
念珠状细胞常聚积成团 ,平均大小 (5.08 ～ 6.59)μm
·37·
研究报告　　朱国胜 等:云南独蒜兰菌根菌研究
×(5.11 ～ 5.42)μm;BDCMA培养菌丝贴培养基生
长 ,形成水浸状圆形菌落 ,不形成气生菌丝 ,平均生长
速度0.052mm/h,主杆菌丝和分枝弯曲 ,短小分枝少 ,
分枝缢缩不明显 ,纤维素酶活弱阳性 ,多酚氧化酶活阳
性 ,菌丝自融合 ,菌丝圈较紧密 ,中间空。
图 3　CeratorhizaspGZAAS0016菌落及显微结构特征
　　注:3-1.BDPDA培养基培养菌落;3-2.BDCMA培养基培养菌落;
3-3.念珠状细胞形态;3-4.细胞核荧光染色观察显示为双核;3-5.菌
丝自融合 ,箭头所指显示菌丝融合点;3-6.菌丝分枝及菌丝圈标尺长
度:200μm。
2.2　新生根中菌根菌的分布特点
通过单菌丝团分离法从同一根的不同根段分离获
得的菌株如下表所示 ,由表 1可知 ,由根尖向根基部 ,
菌根菌分离的数量和种类都有一定的变化特点 。首
先 ,从分离数量的变化上看 ,呈钟形曲线变化 ,由根尖
向根基部逐渐增加 ,到第 3段根时 ,分离数达到最大 ,
占分离数的 46.7%,随后分离数减少 ,根尖及伸长区
菌根菌分离数少 ,成熟区分离数高 ,但在成熟区 ,菌根
菌分离数由近根尖端向近根基部递减;其次 ,从分离种
类的变化上看 , Ceratorhiza属菌根菌种类较多 ,共有 3
种 ,第 3段根中 Ceratorhiza属菌根菌种类和数量都最
多 , 有 18 株 , 3 种 , 而向根尖及根基部都减少 ,
Epulorhiza属菌根菌种类单一 ,只有 1种 , 但为优势
菌 ,点总分离数的 51.7%,而且在各根段都有分布 ,但
其分布由根尖向成熟区逐渐增加。再次 , Ceratorhiza
属菌根菌和 Epulorhiza属菌根菌的分布有一定的相关
性 ,在一定的范围内 ,随着 Epulorhiza属菌根菌的增
加 , Ceratorhiza属菌根菌也增加 ,如第 3段根中 ,两者
量都比较高 ,当 Epulorhiza属菌根菌进一步增加时 ,
Ceratorhiza属菌根菌反而减少 , 如第 4 段根中
Epulorhiza属菌根菌明显多于 Ceratorhiza属菌根菌 ,
这表明 Epulorhiza属菌根菌对 Ceratorhiza属菌根菌起
着双重作用 ,少时有助于 Ceratorhiza属菌根菌定殖和
扩展 ,多时 ,对 Ceratorhiza属菌根菌的扩展产生抑制 。
图 4　 CeratorhizaspGZAAS0005菌落及显微结构特征
　　注:4-1.BDPDA培养基培养菌落;4-2.BDCMA培养基培养菌落;
4-3.念珠状细胞形态;4-4.细胞核荧光染色观察显示为双核;4-5.菌丝
自融合 ,箭头所指显示菌丝融合点;4-6.菌丝分枝及菌丝圈标尺长度:
200μm
2.3　新生根菌丝团不同处理方法对菌根菌分离的
影响
　　利用单菌丝团分离菌根菌的研究表明 [ 3] ,由根制
备的菌丝团液进行适当时间的静置 ,有助于菌丝团的
萌发 ,提高分离效率 ,对老根尤其有效 。本研究对同一
段新生根进行了静置和不静置的处理 ,来进行菌丝团
的分离 ,以比较静置对新生根菌丝团分离的影响 ,结果
见表 2和表 3。由表可知 ,通过两种方法分离的菌根
菌的数量变化都遵循钟形曲线变化规律。但两种方法
分离的菌株的数量和种类都有所不同 ,从数量上看 ,新
生根制备的菌丝团不静置分离的菌株数明显多于静置
分离的菌株数。从种类上看 ,静置处理后 ,各种菌的分
离数量都减少 ,产生气生菌丝的 CeratorhizaspGZAAS
0007未分离到。
·38·
第 27卷　第 10期　2008年 10月　　　　　　 　　　　　种　子　(Seed)　　　 　　　　　　　Vol.27　No.10　Oct.　2008
表 1　同一根中不同根段中菌根菌的多样性
菌种类 第 1段根 第 2段根 第 3段根　　 第 4段根　　 各类菌株数及所占比例
Ceratorhizasp
GZAAS0007
YDSL111
YDLS113
YDSL3115、YDSL312 4
6.7%
Ceratorhizasp
GZAAS0006
YDSL222 YDSL315、YDSL333
YDSL316、YDSL3110
YDSL334
YDSL434
YDSL431 8
13.3%
Ceratorhizasp
GZAAS0016
YDSL112 YDSL313、YDSL319
YDSL331、YDSL332
YDSL3111、YDSL3112
YDSL311、YDSL321
YDSL314、YDSL318
YDSL3113
YDSL412
YDSL421
YDSL4114
YDSL435
YDSL4115
17
28.3%
Epulorhizasp
GZAAS0005
YDSL114
YDSL121
YDSL213
YDSL214
YDSL215
YDSL216
YDSL221
YDSL317、YDSL3114
YDSL3116、YDSL3117
YDSL3118、YDSL3119
YDSL322、YDSL323
YDSL324、YDSL325
YDSL413、YDSL414
YDSL416、YDSL417
YDSL418、YDSL419
YDSL4110、YDSL4111
YDSL4112、YDSL4113
YDSL4115 、YDSL422
YDSL432、YDSL433
31
51.7%
各段菌株数
及所占比例
5
8.3%
6
10%
28
46.7%
21
35%
根段所属区
根冠 、分
生区及部
分伸长区
伸长区和
部分成熟
区
成熟区 成熟区
　　　注:根长度 5cm,等分为 4段 ,第 1根段是根尖向基部 1 /4的长度 ,第 2根段是紧接第 1根段的 1/4长度 ,第 3、4根段依次类推。下同。
表 2　菌丝团不经无菌水静置浸泡菌株分离情况
菌种类 第 1段根 第 2段根 第 3段根　　 第 4段根　　 各类菌株数
Ceratorhizasp
GZAAS0007
YDSL111
YDLS113
YDSL3115、 YDSL312 4
Ceratorhizasp
GZAAS0006
YDSL315、YDSL316、
YDSL3110
3
Ceratorhizasp
GZAAS0016
YDSL112 YDSL313、YDSL319
YDSL3111、YDSL3112
YDSL311、YDSL314、
YDSL318、YDSL3113
YDSL412、YDSL4114
YDSL4115
12
Epulorhizasp
GZAAS0005
YDSL114 YDSL213
YDSL214
YDSL215
YDSL216
YDSL317、YDSL3114
YDSL3116、YDSL3117
YDSL3118、YDSL3119
YDSL413、YDSL414
YDSL416、YDSL417
YDSL418、YDSL419
YDSL4110、YDSL4111
YDSL4112、YDSL4113
YDSL4115
22
各段菌株数 4 4 19 14
表 3　菌丝团无菌水静置浸泡后分离菌株情况
菌种类 第 1段根 第 2段根 第 3段根　　 第 4段根　　 各类菌株数
Ceratorhizasp
GZAAS0007 0
Ceratorhizasp
GZAAS0006 YDSL222 YDSL333、YDSL334 YDSL434、YDSL431 5
Ceratorhizasp
GZAAS0016
YDSL331、YDSL332
YDSL321
YDSL435、YDSL421 5
Epulorhizasp
GZAAS0005
YDSL121 YDSL221 YDSL322、YDSL323
YDSL324、YDSL325
YDSL422、YDSL432
YDSL433 9
各段菌株数 1 2 9 7
·39·
研究报告　　朱国胜 等:云南独蒜兰菌根菌研究
2.4　不同新生根中菌根菌的种类
我们的研究结果表明 ,同一种兰科植物新生根和
老根中的菌根菌的种类存在较大的差异 ,本研究针对
不同根龄的新生根进行了菌根菌的分离 ,以比较不同
根龄的新生根中菌根菌的种类 ,探讨菌根菌的侵染特
点 ,结果见表 4。由表可知 ,根龄短的第 2条新生根菌
株的分离数和种类明显减少 , 总共只分离到 7株 , 2
种 ,而根龄较长的第 1条根 ,共分离到 60株 , 4种。值
得注意的是未在第 2条根中分离到第 1条根中的优势
种 EpulorhizaspGZAAS0005。
表 4　不同根菌根菌分离情况
菌种类 第 1条根(5cm) 第 2条根(2cm)
CeratorhizaspGZAAS0007 4 2
CeratorhizaspGZAAS0006 8 0
CeratorhizaspGZAAS0016 17 5
EpulorhizaspGZAAS0005 31 0
　　注:第 1条根即为表 1所采用的根。
2.5　单菌丝团中菌根菌的多样性
分子生物学方法研究[ 8]表明 ,兰科植物根的菌丝
团中常含有多种菌根菌 ,但还未见从一个菌丝团中分
离到多种菌根菌 ,显微观察表明 ,本研究分离株 YDSL
4115含有两种菌 , 通过进一步纯化从分离株 YDSL
4115分出两种菌 , 即 CeratorhizaspGZAAS0016和
EpulorhizaspGZAAS0005, 这表明云南独蒜兰的
CeratorhizaspGZAAS0016和 EpulorhizaspGZAAS
0005两种菌根菌主要独立形成菌丝团 ,也有少数可以
共同形成一个菌丝团 ,但不是主要的 。
3　讨　论
3.1　云南独蒜兰根中菌根菌的侵染 、动态变化及其
应用
　　本研究表明兰科植物菌根菌是通过伸长区和成熟
区表皮细胞侵入 ,关于菌根菌侵入途径的报道很多 ,多
数认为兰科植物菌根菌是通过根毛侵染进入根的表皮
细胞 , 再穿过表皮细胞进入皮层细胞 , 本研究
CeratorhizaspGZAAS0007从第 1段根和第 3段根中
分离获得 ,第 2段根中未分离到 ,这表明 , Ceratorhiza
spGZAAS0007有两个侵入点 ,也表明 Ceratorhizasp
GZAAS0007既可以从伸长区 ,也可以从成熟区侵入。
伸长区细胞中没有根毛 ,成熟区具有根毛 ,这表明菌根
菌可以直接通过表皮细胞侵入 ,也可以通过根毛细胞
侵入 ,但经观察发现 ,成熟区菌根菌是从根毛基部的根
毛细胞侵入 ,而不是从根毛侵入 ,根毛中的菌丝是从根
毛细胞向根毛中扩展而形成。
菌根菌侵入后向皮层扩散 ,不同的菌株在扩散的
过程中 ,优势地位发生变化 ,起先是 Ceratorhiza属菌
根菌扩散占有优势地位 ,随着时间的延长 , Epulorhiza
属菌根菌逐渐代替 Ceratorhiza属菌根菌 , 占优势地
位 。本研究中 , 第 1 条根离根尖近的 3 段根中
Ceratorhiza属菌根菌占有明显的优势 ,而第 3段根中
Epulorhiza属菌根菌占有明显的优势 ,占本段根分离
数 66.7%。这与两类菌根菌的纤维素酶活和多酚氧
化酶活性有关 , Ceratorhiza属菌根菌纤维素酶活明显
强于 Epulorhiza属菌根菌 ,这表明 Ceratorhiza属菌根
菌比 Epulorhiza属菌根菌具有较强的侵染力 ,这就决
定了早期根中以 Ceratorhiza属菌根菌为主;研究报道
表明[ 9] ,兰科植物可以产生兰酚 ,兰酚对菌根菌具有
抑制作用 ,本研究表明 , Epulorhiza属菌根菌具有多酚
氧化酶活性 ,而 Ceratorhiza属菌根菌无多酚氧化酶活
性 ,在早期 ,根内菌根菌较少 , Epulorhiza属菌根菌产
生的多酚氧化酶可以分解兰酚 ,使根对 Ceratorhiza属
菌根菌的抑制减弱 ,有助于 Ceratorhiza属菌根菌的扩
散;但到了后期 ,根内都占满了菌根菌 ,此时 ,两类菌发
生竞争 ,而 Epulorhiza属菌根菌不受兰酚抑制 ,具有较
强的竞争力 ,使其在后期占优势 。
利用云南独蒜兰菌根菌的侵染和动态变化特点 ,
可以建立云南独蒜兰菌根菌的应用方法 ,首先应用 3
种 Ceratorhiza属菌根菌进行混合侵染 ,利用其产生的
纤维素酶活强的特点 ,在根的表面形成侵染通道 ,然后
利用 Epulorhiza属菌根菌侵染 ,由于其纤维素酶活弱 ,
侵染力较差 ,但可以借助 Ceratorhiza属菌根菌形成的
侵染通道侵入 ,侵入以后利用 Epulorhiza属菌根菌形
成的多酚氧化酶抑制根中的兰酚对菌根菌的毒力 ,使
菌根菌能在根中稳定定殖 ,这样好气性的 Ceratorhiza
属菌根菌可以将外界环境与根联系起来 ,而对氧要求
不高的 Epulorhiza属菌根菌促进 Ceratorhiza属菌根菌
稳定地定殖在根中 ,这样就形成了一个稳定的菌根菌
网络 ,持续稳定地发挥菌根菌的作用 ,促进云南独蒜兰
的生长及发育。
3.2　菌丝团的无菌水浸泡处理对菌根菌的影响
及应用
　　研究报道表明[ 3]无菌水浸泡菌丝团 ,可以诱导菌
丝团萌发 ,很容易从大量菌丝团中轻易筛选出有活性
的菌丝团。但本研究也表明 ,产生气生菌丝的菌根菌 ,
无菌水静置浸泡明显降低了其分离率 ,经研究发现 ,新
生根早期侵染的菌根菌及老根外皮层中的的菌根菌多
数为产生气生菌丝的菌根菌。
(下转第 43页)
·40·
第 27卷　第 10期　2008年 10月　　　　　　 　　　　　种　子　(Seed)　　　 　　　　　　　Vol.27　No.10　Oct.　2008
(上接第 40页)
　　本研究还表明 ,侵入培养基生长的一些菌株 ,无菌
水浸泡对其分离率也产生影响 ,但分离的菌根菌的种
类无变化 ,这主要是由于细菌的污染引起的 ,可以采用
添加抗生素的方法解决。通过本研究 ,提出兰科植物
菌根菌单菌丝团分离的改进措施 。首先 ,对新生根近
根尖端的菌丝团和老根的近根尖的外皮层细胞中的菌
丝团可以直接分离 ,这些菌丝团一般为疏松菌丝团 ,活
力较高 ,产生气生菌丝的菌丝团多数处于此部位 ,这样
可以最大限度地分离出产生气生菌丝的兰科菌根菌 ,
如 Ceratorhiza属菌根菌;其次 ,对于新生根近基部的
菌丝团和老根内皮层的菌丝团 ,以不易形成气生菌丝
的菌根菌为主 ,而且多数处于消化阶段 ,死亡的菌丝团
较多 ,如果直接挑单菌丝团分离 ,就如大海捞针 ,效率
很低 ,可以采用菌丝团溶液静置诱导其萌发生长 ,然后
有针对性地挑取萌发的菌丝团进行培养 ,这样就大大
提高了分离的效率。
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图 1　不同葫芦科作物不同部位 RT-PCR产物 1%
琼脂糖凝胶电泳图
注:M:DNA标准(100bp, 250bp, 500bp, 750bp, 1 000bp, 2 000bp)。
3　讨　论
3.1　建立了直接从葫芦种子中提取 RNA的方法
本研究对干燥葫芦种子及双蒸水浸泡后的葫芦种
子的种皮 、种仁进行了 RNA提取的实验。葫芦科种子
中含有较多的多糖及次生代谢物质 ,提取总 RNA往往
比较困难。实验中 ,使用 TRIzol试剂对不同处理 、不
同数量的样品直接提取总 RNA,并进行 RT-PCR检测 ,
结果证明 ,用该方法提取的 RNA纯度及完整性均可满
足后续的分子生物学研究 。
3.2　建立了直接从葫芦种子中检测 CGMMV的技术
方法
　　目前质检系统中对送检的种子样品 ,往往先播种
种子 ,待长出幼苗后 ,再检测幼苗叶片 。此检测程序费
时费力 ,还容易受季节及温室条件的限制 。并且 ,有的
带毒种子并不一定形成带毒幼苗 ,因此出现假阴性的
几率增加。实验中直接采用种子进行种传病毒的检
测 ,其效果比较理想。 DAS-ELISA和 RT-PCR检测结
果比较表明 ,后者要比前者的灵敏度高 ,可检测到单粒
种子的一半种皮或一半种仁。本研究建立了直接从葫
芦种子中检测 CGMMV的技术方法 ,该方法的建立对
于其他种传病毒的种子检测也具有借鉴意义。
3.3　明确了葫芦科 3种不同作物的带毒部位
对干燥葫芦种子的种皮 、种仁 ,双蒸水浸泡葫芦种
子的液体样品 ,浸泡后葫芦种子的种皮 、种仁;对西瓜
的叶片 、瓜皮 、瓜瓤 、种皮 、种仁 、瓜苗 、瓜蔓;对甜瓜的
叶片 、瓜瓤 、瓜皮进行了全部的酶联检测和部分的 RT-
PCR检测(见表 1),结果显示受侵染葫芦种子的种皮 、
种仁可带毒;受侵染西瓜的瓜叶 、瓜皮 、瓜瓤 、种皮 、种
仁 、瓜蔓均可带毒;受侵染甜瓜的叶片可带毒。该结果
对采样或抽样时样品部位的选择具有指导意义 。
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研究报告　　张永江 等:3种葫芦科作物种质资源中黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测