全 文 ：蝴蝶兰 ACC合成酶基因片段的克隆及其反义表达载体的构建
崔 波 1, 2 ,蒋素华 1 ,马 杰 2 ,张仙云 2 , 叶永忠 1＊
(1.河南农业大学生命科学学院 ,河南郑州 450002;2.郑州师范高等专科学校生物工程研究所 ,河南郑州 450044)
摘要　[目的 ]克隆蝴蝶兰 ACC合成酶cDNA片段 ,构建其反义表达载体。 [方法]根据已报道的蝴蝶兰 ACC合成酶的基因序列 , 设计
并合成了 1对引物 ,通过RT-PCR以蝴蝶兰总RNA中扩增出ACC合成酶的 cDNA片段 ,将其连接到 MD19-T质粒载体上进行测序。用
XbaⅠ和SacⅠ对重组质粒和pBI221酶切后连接 ,构建蝴蝶兰ACC合成酶的反义基因表达载体。 [结果]获得了蝴蝶兰ACC合成酶的cD-
NA片段 ,测序结果显示 ,该片段与参考的已报道序列具有 98.92%和 76.36%的同源性。通过引入XbaⅠ和 SacⅠ酶切位点 ,进行载体构
建 ,构建了蝴蝶兰ACC合成酶的反义基因表达载体。 [结论]成功构建了蝴蝶兰ACC合成酶的反义基因植物表达载体 ,为进一步研究
其对蝴蝶兰花期和生长的影响打下了基础。
关键词　蝴蝶兰;ACC合成酶;基因克隆;反义基因;植物表达载体构建
中图分类号　Q785;S682.31文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)34-16781-02
cDNACloningandConstructionofAntisenseExpressionVectorofPhalaenopsisACCSynthase
CUIBoetal　(ColegeofLifeScience, HenanAgriculturalUniversity, Zhengzhou, Henan450002)
Abstract　[ Objective] ThepurposeofthisreseachwastoclonethecDNAfragmentofACCsynthase(1-aminocyclopropane-1-carboxylatesyn-
thase, ACS)ofphalaenopsisandtoconstructitsantisenseexpressionvector.[ Method] Apairofspecificprimersweredesignedandsynthesized
accordingtothereportedcDNAsequencesofphalanopsisACCsynthasegene(GenBank:Z77854.1;AF004663.1).ThepartialcDNAofACS
wasobtainedfromtotalRNAofphalaenopsisbyRT-PCR.ThenthecDNAfragmentwaslinkedtoT-tailingpMD19-Tvectorforcloningandse-
quencing.AftertherecombinantplasmidandplantexpressionvectorpBI221bothbeingdigestedwithSacIandXbaI, thefragmentofACSwas
ligatedtotheCaMV35SpromoterdownstreamofpBI221inantisenseorientationtoconstructtheantisenseexpressionvector.[ Result] ThecD-
NAfragmentofphalaenopsisACSwascloned.Thesequencingresultsshowedthattheobtainedsequencewasmadeupof461 bpandtheho-
mologousratewas98.92% and76.36%comparedwithreportedsequences.Usingappropriatedsiteofrestrictionendonuclease, theantisense
expressionvectorofphalaenopsisACSwassuccessfullyconstructed.[ Conclusion] TheantisenseplantexpressionvectorofphalaenopsisACS
wasconstructed, whichlaidfoundationforfurtherstudyoftheefectsonfloresceneandgrowthofphalanopsis.
Keywords　Phalaenopsis;ACCsynthase;Genecloning;Antisensegene;Constructionofplantexpressionvector
基金项目　河南省科技攻关项目(092102110128)。
作者简介　崔波(1962-),男 ,河南泌阳人 ,研究员 ,从事生物技术研究
工作。 ＊通讯作者。
收稿日期　 2009-07-31
　　乙烯是植物激素之一 ,其主要生理作用是催熟 、促衰老
和促脱落。乙烯在植物体内的合成途径为 Met(蛋氨酸)※
SAM(S-腺苷蛋氨酸)※ ACC(1-氨基环丙烷羧酸)※乙烯 [ 1] 。
其中乙烯直接前体 ACC的合成及氧化为产生乙烯的限速环
节 ,催化 SAM向 ACC转化及 ACC转化成乙烯的酶分别是
ACC合 成 酶 (1-aminocyclopropane-1-carboxylatesynthase,
ACS)和 ACC氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylateoxi-
dase, ACO)[ 2] 。控制 ACC合成酶基因的表达可抑制乙烯在
植物体内的合成 。应用基因工程手段 ,将 ACC合成酶的反
义基因导入植物中以降低乙烯的生成 ,是有效延缓植物成熟
与衰老的手段之一。近年来 ,利用反义基因技术抑制乙烯的
合成 ,在番茄 、枣 、青花菜 、西瓜 、甜瓜等作物上已有成功的应
用 ,达到了延迟成熟 、保鲜和延长货架期的目的 [ 3-9] 。花朵
的成熟衰老同果实一样 ,也分为呼吸跃变型和非跃变型 2
种 [ 10] 。抑制乙烯的生成 ,也可以延缓一些花卉花朵的衰老
和凋谢 [ 11] 。笔者以蝴蝶兰的 RNA为模板反转录合成
cDNA,从中克隆 ACC合成酶的基因片段 ,经测序后以反方向
插入载体中 ,构建了 ACC合成酶反义基因的植物表达载体 ,
为进一步研究其对蝴蝶兰花期和生长的影响奠定了基础 。
1　材料与方法
1.1　材料 　蝴蝶兰 (Phalaenopsishybridcv.Han-Ben s
Girl),采自郑州师范高等专科学校温室。所用质粒 pMD19-
T、pBI221和大肠杆菌 DH5α由河南农业大学生命科学学院
实验室保存。限制性内切酶 、TaqDNA聚合酶 、T4DNA连接
酶等工具酶均为宝生物工程(大连)有限公司产品;RNAprep
pure植物总 RNA提取试剂盒 、质粒小提试剂盒 、普通琼脂糖
DNA回收试剂盒 、IPTG、X-gal、dNTP为天根生化科技(北京)
有限公司产品 。FirststrandcDNASynthesisKit是 Fermentas
LifeSciences的产品。
1.2　方法
1.2.1　总 RNA的提取。取授粉 12 h后的柱头为材料 ,液氮
研磨 ,参照 RNApreppure植物总 RNA提取试剂盒的使用说
明 ,提取总蝴蝶兰 RNA。
1.2.2　cDNA的合成及目的基因的 PCR扩增。参考已发表
的蝴蝶兰 ACC合成酶的基因序列 (GenBank:Z77854.1;
AF004663.1), 设计 PCR引物:P1为 5′-ACGAGCTCATG-
GAGAACAGGAGTCAAGATC-3′(下划线部分为 SacⅠ酶切位
点);P2为 5′-CATCTAGATCTGCACAGTAACATGAACTCC-3′
(下划线部分为 XbaⅠ酶切位点),由北京博尚生物技术公司
合成。
用 FermentasLifeSciences的 FirstStrandcDNASynthesis
Kit反转录合成 cDNA第 1链。以 Oligo(dT)18为引物 ,蝴蝶
兰总 RNA为模板 ,参照试剂盒说明书 ,在 42 ℃、60min条件
下合成 cDNA第 1链。以此 cDNA为模板 ,采用合成的 1对
引物进行 PCR反应。反应条件如下:94 ℃预变性 5 min;94
℃, 40 s;55℃, 40 s;72 ℃, 40 s;30轮循环;最后一轮 72 ℃,
延伸 5min。
1.2.3　目的基因片段的克隆及测序。将 PCR产物用 1.2%琼
脂糖电泳分离 ,并割胶回收纯化 ,与 pMD9-T载体连接 ,转化大
肠杆菌 DH5α感受态细胞 ,在 X-gal/IPTC培养基上 37℃、250
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2009, 37(34):16781-16782, 16785 责任编辑　李菲菲　责任校对　张士敏
r/min培养过夜 ,挑取白色菌落 ,通过菌落和质粒 PCR,将结果
为阳性的克隆送北京博尚生物技术公司测序。质粒的提取 、电
泳 、大肠杆菌感受态的制备 、转化等参照文献 [ 12] 。
1.2.4　含反义 ACS基因片段的植物表达载体的构建。将含
有 ACC合成酶基因片段的 pMD19-T经限制性内切酶 SacⅠ/
XbaⅠ双酶切后 ,回收 、纯化小片段 。pBI221经 SacⅠ/XbaⅠ双
酶切后得到链状 pBI221,与目的基因片段以 T4DNA连接酶
连接 ,构建成反义植物重组表达载体(图 1)。连接反应参照
T4连接酶说明书 。
图 1　构建 ACS反义植物表达载体流程
Fig.1　TheprocessofconstructingACSantiseneseplant
expressionvector
2　结果与分析
2.1　PCR产物的克隆及筛选　利用合成的 1对引物 ,对总
RNA进行反转录 PCR。电泳结果显示 ,在 500 bp附近有一
亮带 ,与预期的 461 bp的目的基因片段相符(图 2)。将目的
基因片段与 pMD9-T载体连接 ,转化大肠杆菌 DH5α感受态
细胞 ,经蓝白菌落筛选后 ,菌液和质粒 PCR鉴定 ,均有目标
条带出现 ,证明挑选的菌斑为阳性。含有 ACC合成酶基因
片段 pMD19-T经 XbaⅠ和 SacⅠ双酶切 ,得到 2个片段 ,分别
为 461和 2 692 bp(图 3)。酶切的检测结果显示 ,目的基因
片段与 PMD19-T载体已连接。
2.2　目的基因片段序列分析　将酶切检测为阳性的克隆测
序 ,测序结果表明 ,克隆到的基因片段全长 461 bp,与参考的
2个已知 cDNA序列的片段基本相符 ,与它们的同源性分别
达 98.92%(456/461)和 76.36%(352/461)。
2.3　植物重组表达载体的构建和鉴定　将经测序的含有
ACC合成酶基因片段的pMD19-T和 pBI221经 SacⅠ/XbaⅠ双
酶切后 ,回收 461bp片段和 pBI221酶切后的 3 767 bp大片
段 ,连接后转化大肠杆菌感受态细胞 ,将在含 Amp的 LB培
养基上生长的菌落培养 ,提取质粒 ,以 F1 和 F2引物进行
PCR,扩增出 1条 461 bp的目的条带 ,证明目的基因已插入 。
该质粒用 SacⅠ/XbaⅠ双酶切也得到了 1条约 461bp的目的
基因和 1条 3 767 bp的 pBI221载体片段(图 4),与预期的大
图 2　ACC合成酶片段的 PCR扩增
Fig.2　PCRampliticatiomofACSfragment
图 3　SacⅠ/XbaⅠ酶切重组质粒
Fig.3　RecombinantplasmiddigestedwithSacⅠ/XbaⅠ
小相符 ,表明蝴蝶兰 ACC合成酶基因反义载体构建成功。
图 4　SacⅠ/XbaⅠ酶切植物重组表达载体
Fig.4　AntisenseplantexpressionvectordigestedwithSacⅠ/XbaⅠ
3　讨论
反义基因技术已在植物学研究的很多领域得到应用 ,如
调节果实成熟和软化控制 ,改良作物品质 ,获得作物雄性不
育系 ,增强植物的抗病性 ,改变植物的花色和延长切花的花
期等 ,但尚未见有应用于蝴蝶兰的报道。蝴蝶兰属于乙烯致
衰植物 ,授粉后与乙烯合成相关的基因很快就开始表达 ,一
般情况下蝴蝶兰授粉后十几个小时花瓣就开始枯萎 。该试
验选授粉 12 h后的柱头为材料 ,为 ACC合成酶的 mRNA比
较丰富的时段和部位 ,提高了反转录得到 ACC合成酶 cDNA
的几率 。
植物的 ACC合成酶(ACS)基因是一个大的基因家族 ,
多数植物都有多个 ACS基因 ,他们的编码区内 DNA序列都
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16782 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年
　　表 3为延边黄牛 DECR1基因不同基因型各氨基酸性状
均值差异显著性检验结果 ,由表 3可知 ,在氨基酸组成上只
有组氨酸与赖氨酸在各基因型之间有显著差异 ,即基因型
BB显著低于基因型 AB(P<0.05),同时也低于基因型 AA
(P>0.05),这说明基因型 BB对组氨酸与赖氨酸有一定的
负面影响。
3　讨论
有关牛的 DECR1基因与肉质相关分析的研究报道较
少 ,该研究在肉质性状的分析中发现不同基因型在 pH1 、pH24
性状上都有差异 ,说明 pH值可能与 DECR1酶活性有关 ,这
与黄生强等 [ 6]的报道相符。在蒸煮损失性状中不同基因型
之间也有差异 ,说明 DECR1基因也可以作为影响肉质性状
的标记 ,但是由于国内外对于 DECR1的研究较少 ,没有发现
类似报道 ,因此其标记的准确及可靠性还需要进一步验证。
脂肪酸是猪肉风味的重要前体物质 ,脂肪酸通过氧化降
解所产生的一系列化学物质是形成猪肉风味的重要化学基
础 ,特别是与猪肉烹饪过后产生的香味有密切联系 [ 4] 。另
外 ,脂肪酸还与肉的嫩度 、多汁性等肉质性能有很大关系 。
DECR1是进行不饱和脂肪酸 β氧化的关键酶 ,参与了所有
的双键不饱和脂肪酸的代谢 [ 5-6] ,特别是亚油酸的代谢 ,进
而影响肌肉的 IMF、pH值 、肉色等。 Wang等研究发现猪的
DECR1基因中第 2外显子 、第 5外显子分别存在 G-C突变 ,
且分别引起氨基酸的改变 Val-Leu、Ser-Thr,可能影响 DECR1
的酶活性 [ 7] 。该研究在 DECR1基因第 5内含子中发现了
g.23263A>G和 g.23473A>G突变 ,同时在亚麻酸 、硬脂酸
含量上 BB基因型显著高于其他基因型 ,在肉豆蔻酸上 BB
基因型显著低于另 2个基因型。这一发现可能对 DECR1的
基因表达研究有一定意义 。
游离氨基酸是决定肉香味及鲜味的重要物质。绝大多
数游离氨基酸与火腿风味的相关达显著和极显著水平 ,其中
谷氨酸与丙氨酸的风味相关系数达 0.8以上 [ 8] 。谷氨酸钠
和肌苷酸作为基本鲜味物质 ,会由于其他氨基酸作为第 3因
子的加入而增加鲜味 [ 9] 。该研究发现基因型 BB组氨酸 、赖
氨酸值低于 AA、AB,说明 BB基因型对组氨酸 、赖氨酸含量
有一定的负面影响。这一发现将为今后进一步研究肉质风
味的影响因素提供借鉴。DECR1基因作为一个影响肉质性
状的候选基因在牛上的相关报道还很少 ,有许多基因调控机
理还是未知 ,因此需要继续深入研究才能进一步解释 DECR1
影响肉质的机理 。
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(上接第 16782页)
有约 60%的同源性 ,氨基酸序列一致变幅为 48% ～ 97%,蛋
白质同源性在 50% ～ 95%, mRNA的分子量在 2.2 ～ 2.8
kb[ 13] ,同种植物 ACS基因家族成员之间的同源性相差甚大 。
故在克隆 ACS基因片段时 ,引物的设计要参考多个基因序
列 ,采用同源序列 ,以保证基因克隆的成功。
该试验以蝴蝶兰 RNA为模板 ,经 RT-PCR得到 ACC合
成酶的 cDNA,从中克隆了 ACS的基因片段 ,再将其与植物
表达载体 pBI221反向连接 ,并转化到大肠杆菌DH5α感受态
细胞中 ,成功地构建了蝴蝶兰 ACC合成酶反义基因的植物
表达载体。今后进一步将其转化到蝴蝶兰植株中 ,以期能延
长蝴蝶兰的花期。
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