全 文 ：湖 北 农 业 科 学 2013 年
收稿日期：2012－09－12
基金项目：贵阳医学院院基金项目（2007－49）
作者简介：张 洁（1978－），女，贵州都匀人，讲师，硕士，主要从事药用植物的组织培养研究，（电话）13595019732（电子信箱）annie＠gmc．edu．cn。
坚龙胆（Gentiana rigescens Franch）为龙胆科龙
胆属植物，以其根茎入药，是《中国药典》收载的传
统中药材龙胆（Radix Gentianae）的主要品种之一［1］，
具有清肝胆实火、除下焦湿热、健脾、降压和保肝利
胆等多种功效 ［2］。 贵州省为坚龙胆药材道地产区之
一，多年来的大量采挖造成坚龙胆野生资源濒临灭
绝。 坚龙胆的人工种植主要采用种子繁殖和分株繁
殖两种方式，但坚龙胆的种子小，育苗时间长，且种
子繁殖存在品种退化的情况 ［3］，而分株繁殖的繁殖
系数低，根茎用量大，限制了种植规模。 组织培养是
坚龙胆快速繁殖和推广种植的有效途径。 目前龙胆
属植物组织培养的研究多数以北方产地的龙胆品
种为主［4－9］，而主产于南方的坚龙胆仅见朱宏涛等［10］
对云南产地的坚龙胆进行了组培快繁的研究。 本研
究对贵州产地的野生坚龙胆进行离体培养，建立系
统的快速繁殖体系，以推动贵州省坚龙胆的规模化
种植和中药产业现代化的进程。
1 材料与方法
1．1 植物材料
野生坚龙胆采集于贵阳市白云区牛场乡，实验
选用其带顶芽或腋芽的幼嫩茎段作为外植体。
1．2 方法
1．2．1 外植体的消毒与接种 采集的带顶芽或腋
芽的幼嫩茎段，经常规清洗后在超净台上进行灭菌
处理。 先用体积分数 75％的乙醇浸泡 30 s， 然后用
30 mg ／ mL 的次氯酸钠溶液浸泡 6 min， 无菌水冲洗
3～5 次后再用 30 mg ／ mL 的次氯酸钠溶液消毒 6
min，无菌水冲洗 7～8次后接入诱导培养基。 诱导培
养基以 MS为基本培养基， 添加 3％的蔗糖、7．5 g ／ L
琼脂粉，pH 5．9，并在 121 ℃下灭菌 20 min，添加不
同浓度的 6－BA 和 NAA（①MS＋1．0 mg ／ L 6－BA＋0．1
mg ／ L NAA；②MS＋2．0 mg ／ L 6－BA＋0．2 mg ／ L NAA）。
培养温度为 （25±2）℃ ，光照时间 13 h ／ d，光照度
贵州产坚龙胆组织培养体系的建立
张 洁，刘红美
（贵阳医学院医学生物技术教研室，贵阳 550004）
摘要：以贵州野生坚龙胆（Gentiana rigescens Franch）带有顶芽或腋芽的茎段作为外植体，建立坚龙胆的
组织培养体系。 结果表明，适宜的不定芽诱导培养基为 MS＋2．0 mg ／ L 6－BA＋0．2 mg ／ L NAA，最佳的增殖
培养基为 MS＋1．0 mg ／ L 6－BA＋0．10 mg ／ L NAA，最适生根培养基为 1 ／ 2MS＋0．1 mg ／ L IBA。在组织培养过
程中还观察到了瓶苗开花的现象。
关键词：坚龙胆（Gentiana rigescens Franch）；组织培养；培养基
中图分类号：S567．23＋9；S339．4＋1 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2013）17－4250-03
Establishment of Tissue Culture System of Gentiana rigescens from Guizhou Province
ZHANG Jie，LIU Hong－mei
（Department of Medical Biotechnology， Guiyang Medical College， Guiyang 550004， China）
Abstract： Using stem segments with apical bud or auxiliary bud as explants， tissue culture system of Gentiana rigescens
Franch from Guizhou province was established． The results showed that the optimal bud induction medium was MS＋2．0 mg ／ L
6－BA＋0．2 mg ／ L NAA； the optimal proliferation medium was MS＋1．0 mg ／ L 6－BA＋0．10 mg ／ L NAA； the appropriate rooting
medium was 1 ／ 2MS＋0．1 mg ／ L IBA． Furthermore， in vitro flowering phenomenon was observed during tissue culture of G．
rigescens Franch．
Key words： Gentiana rigescens Franch； tissue culture； culture medium
第 52卷第 17期
2013年 9月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 52 No.17
Sep．，2013
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2013.17.068
第 17 期
2．3 坚龙胆不定芽的生根及移栽
不同培养基中坚龙胆不定芽的生根情况见表
2。 从表 2可以看出，各培养基中均可诱导不定芽生
根， 但在生根的时间和数量以及长势上存在差别。
较低浓度的 IBA 或 NAA 对芽苗的生根有一定的促
进作用，但 IBA 或 NAA 浓度偏高，为 1．0 mg ／ L 时，
芽苗茎段基部膨大并出现较多的愈伤组织，芽苗矮
小，生长状态不佳，出现气生根，生根率反而下降。
由此可见低浓度的生长素有利于芽苗生根，高浓度
的生长素促进愈伤组织的分化，反而抑制了根的发
生和生长。 与相同浓度的 NAA 相比，IBA 促进芽苗
生根及生长的效果均优于 NAA。 从基本培养基来
看，与 MS 培养基相比，1 ／ 2MS 培养基中芽苗的生根
时间更短、生根率更高。但 MS培养基中芽苗株型比
1 500 lx。
1．2．2 坚龙胆不定芽的增殖培养 把长势较好的
不定芽转接到附加不同浓度的 6－BA 和 NAA 激素
组合的 MS 培养基中进行增殖培养， 培养条件与不
定芽诱导条件相同，培养 30 d 后对不定芽的增殖与
生长情况进行观察统计。
1．2．3 试管苗的生根、 移栽 将增殖壮苗培养后高
1．5～2．0 cm的无根小苗切段，转接生根培养基中诱导
生根。 生根培养基以 MS 和 1 ／ 2MS 为基本培养基，
附加不同浓度的 NAA 和 IBA， 观察生根情况，40 d
后统计生根率、平均生根条数等。 组培苗根系生成
并长到合适长度后进行炼苗移栽。
2 结果与分析
2．1 外植体的灭菌和不定芽的诱导
由于外植体是在野外采集的，表面往往带有较
多的细菌和真菌，实验表明，采用 30 mg ／ mL 的次氯
酸钠溶液灭菌两次， 既能达到较好的灭菌效果，又
能减少对幼嫩组织的损伤。 诱导培养中，采用带顶
芽或侧芽的幼嫩茎段作为外植体， 在 MS＋1．0 mg ／ L
6－BA＋0．1 mg ／ L NAA 及 MS＋2．0 mg ／ L 6－BA＋0．2
mg ／ L NAA 两种培养基均能诱导出不定芽， 其中
MS＋2．0 mg ／ L 6－BA＋0．2 mg ／ L NAA 只需 15 d 左右
即能诱导出不定芽，且不定芽生长快、长势好。
2．2 NAA 与 6－BA 不同浓度组合对不定芽增殖的
影响
以 MS 为基本培养基，NAA 与 6－BA 不同浓度
组合对不定芽增殖及生长的影响见表 1。 从表 1 可
以看出，随着 6－BA 浓度的升高，不定芽的增殖系数
不断提高，侧枝和芽的分化增多，6－BA 浓度升高到
2．0 mg ／ L时繁殖系数最高，但芽苗的生长状态差，细
弱、矮小、生长缓慢，严重影响存活率。 所以综合考
虑，最佳增殖培养基为 MS＋1．0 mg ／L 6－BA＋0．10 mg ／L
NAA，增殖系数较高且芽苗生长快、外观正常。
表 1 不同培养基中坚龙胆不定芽的增殖情况
培养基编号
3
4
5
6
7
8
9
10
11
6-BA//mg/L
0.5
0.5
0.5
1.0
1.0
1.0
2.0
2.0
2.0
NAA//mg/L
0.05
0.10
0.20
0.05
0.10
0.20
0.05
0.10
0.20
增殖系数
3.2
3.0
2.8
6.5
7.3
6.3
7.3
7.0
7.5
生长状态
芽苗生长较慢，稍显矮小
芽苗生长较慢，稍显矮小
芽苗生长较慢，稍显矮小
芽苗生长快，健壮，节间伸长适度
芽苗生长快，健壮，节间伸长适度
芽苗生长快，健壮，节间伸长适度
芽苗生长缓慢，不定芽较多，但芽苗细弱，矮小
芽苗生长缓慢，不定芽较多，但芽苗细弱，矮小
芽苗生长缓慢，不定芽较多，但芽苗细弱，矮小
表 2 不同培养基对芽苗生根的影响
培养基
编号
12
13
14
15
16
17
18
19
基本培
养基
1/2MS
1/2MS
1/2MS
1/2MS
1/2MS
1/2MS
MS
MS
NAA//mg/L
0.1
0.5
1.0
0
0
0
0.1
0
IBA//mg/L
0
0
0
0.1
0.5
1.0
0
0.1
起始生根时间
d
25
40
40
17
22
22
35
30
生根率
%
80
63
53
93
82
65
80
88
平均生根数
条/株
4.0
2.4
2.0
6.2
5.0
4.1
4.5
5.2
诱导生根情况
根健壮，芽苗长势较好
根健壮，芽苗长势较好
根细弱，基部出现大量愈伤组织，芽苗生长慢，较矮
根健壮，芽苗长势较好
根健壮，芽苗长势较好
根较细弱，基部出现愈伤组织，芽苗生长慢，较矮
根健壮，芽苗株型稍大，茎粗壮，叶片大而肥厚
根健壮，芽苗株型稍大，茎粗壮，叶片大且肥厚
激素
张 洁等：贵州产坚龙胆组织培养体系的建立 4251
湖 北 农 业 科 学 2013 年
1 ／ 2MS 培养基中的稍大，尤其是叶片大且肥厚。 各
处理中 1 ／ 2MS＋0．1 mg ／ L IBA 培养基生根所需时间
最短，17 d 左右即可生根，并且生根条数多，达 6．2
条 ／株，根系生长健壮，芽苗长势良好，利于提高后
期的移栽成活率。
2．4 炼苗移栽
当组培苗根系生成后，根长达到 2 cm 以上时在
室温下打开瓶口，炼苗 2～3 d，以使小苗逐渐适应外
界环境，从培养瓶中取出小苗，洗去苗根部琼脂，移
栽于高温灭菌的等体积混合的蛭石-珍珠岩基质
中，注意保持温湿度，移栽存活率可达 85％以上。
3 小结与讨论
坚龙胆作为贵州省的特产药用植物，在自然资
源不能满足市场需求的情况下，积极探索新的繁殖
方法是非常必要的。 本研究对贵州产野生坚龙胆进
行了离体培养，建立了其无性繁殖体系，确定适宜
的不定芽诱导培养基为 MS＋2．0 mg ／ L 6－BA＋0．2
mg ／ L NAA， 最佳的增殖培养基为 MS＋1．0 mg ／ L 6－
BA＋0．10 mg ／ L NAA，最佳生根培养基为 1 ／ 2 MS＋0．1
mg ／ L IBA。 这与朱宏涛等［10］对云南产坚龙胆的研究
结果不完全一致，其主要采用 6－BA、KT 和 NAA ／ I-
AA 3 种激素组合， 在增殖培养阶段还添加了水解
酪蛋白。 在试验初期，本研究也采用了 KT 与 6－BA
和 NAA 配合使用，但效果不佳，而后只采用两种常
用的激素 6－BA 和 NAA，反而取得了理想的不定芽
诱导和增殖壮苗的效果，这可能是不同产地的外植
体在生理特点和内源激素水平上有差别导致的。
坚龙胆除了具有重要的药用价值外，还具有较
高的观赏价值， 由于分布在较高海拔的向阳区域，
其具有独特的花色、花型，是野生花卉中较为珍贵
的类型［11，12］。 本研究在试验过程中发现坚龙胆在生
根培养阶段出现了瓶中开花的现象（图 1、图 2），为
紫蓝色小花，花多为多数，簇生枝顶，筒状花冠，颜
色和花型与野外的品种没有明显差别，只是花朵较
野生植株小，花期持续约 1 个月。 瓶中开花现象仅
出现在以 1 ／ 2MS 为基本培养基的生根培养基中，在
以 MS 为基本培养基的生根培养基中， 芽苗虽然长
势好、健壮、茎粗壮、叶大而肥厚，但始终都没有出
现过开花现象，这说明坚龙胆开花可能需要较低的
无机盐水平，无机盐浓度过高，芽苗营养生长过于
旺盛，不利于生殖生长。 在日本龙胆［13］及天蓝龙胆［14］
的瓶中开花的报道中，均采用了偏酸性（pH 4．5）的
培养基来诱导开花，而本实验中采用较低的无机盐
配合一定浓度的生长素，在 pH 5．9的培养基中就能
诱导坚龙胆瓶中开花。然而，花芽分化作为植物组织
培养中的一种分化模式， 是一个复杂的生理现象，
受到诸多因素的影响，包括外源激素、营养条件、光
周期、温度等，这都需要更加深入系统的研究。
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图 1 坚龙胆组培苗花苞
图 2 坚龙胆组培苗开花
（责任编辑 向 闱）
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