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大孔树脂吸附法纯化滇桂艾纳香总黄酮的工艺研究



全 文 :第 32 卷 第 5 期
2 0 1 4 年 5 月
中 华 中 医 药 学 刊
CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol. 32 No. 5
May 2 0 1 4





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DOI:10. 13193 / j. issn. 1673-7717. 2014. 05. 083
大孔树脂吸附法纯化滇桂艾纳香总黄酮的工艺研究
陈伟鹏,陈倩欣,蔡志华,卓晓雪,陈思斯,李杰梅
(中山大学新华学院,广东 广州 510520)
摘 要:目的:优化大孔树脂纯化滇桂艾纳香总黄酮的最佳工艺。方法:以吸附率和解吸率为指标,利用静态
吸附试验对 4 种大孔树脂进行筛选,并通过静态吸附和动态吸附的单因素影响试验,优选树脂的最佳分离纯化条
件。结果:研究结果表明:HPD100 树脂宜于滇桂艾纳香总黄酮的提纯,最佳纯化工艺为:上样液总黄酮浓度为
0. 75 mg /mL,上样液 pH = 4,洗脱溶剂为 60%乙醇,上样液体积为 60 mL,洗脱速度为 2. 5 mL /min,洗脱体积为
275 mL,树脂柱径高比为 1 ∶ 8,纯化后总黄酮量高达 95. 05%。结论 HPD100 大孔树脂能有效分离纯化滇桂艾纳
香中的总黄酮。
关键词:滇桂艾纳香;总黄酮;大孔树脂树脂;纯化
中图分类号:R284 文献标志码:A 文章编号:1673-7717(2014)05-1205-04
Purification Process of Total Flavonoids from Blumea riparia by Macroporous Resin
CHEN Weipeng,CHEN Qianxin,CAI Zhihua,ZHUO Xiaoxue,CHEN Sisi,LI Jiemei
(Xinhua College of Sun Yat - Sen University,Guangzhou 510520,Guangdong,China)
Abstract:Objective:A method for purification of total flavonoids from Blumea riparia with macroporous resin was
studied,and the optimal process for separating and purifying was established. Methods:By using adsorption rate and de-
sorption rate as the indices,4 kinds of macroporous resins were screened by static adsorption test. And the optimal purifi-
cation conditions of resin were obtained based on dynamic adsorption and static adsorption. Results:Experiment results
showed that HPD100 resin possessed high absorption capacity. The best conditions were:concentration 0. 75 mg /mL,pH
4,60% alcohol as the elution,sample volume 60 mL,eluting velocity 2. 5 mL /min,elution volume 275 mL,and the ratio
of diameter to height was 1 ∶ 8. After purification,the content of total flavonoids could be raised to 95. 05% . Conclusion:
HPD - 100 macroporous resin is the most effective macroporous resin to purify total flavonoids separated from Blumea ri-
paria.
Key words:Blumea riparia;total flavonoids;macroporous resin;purification
收稿日期:2013 - 12 - 02
作者简介:陈伟鹏(1990 -) ,男,广东饶平人,助理药师,学士,研究
方向:天然药物研究与分析。
通讯作者:李杰梅(1983 -) ,女,广东广州人,讲师,硕士,研究方
向:天然药物研究与分析。 E-mail:mary1102357 @
hotmail. com。
滇桂艾纳香 Blumea riparia (Bl.)DC. 又名假东风
草[1]、管芽[2]等,为多年生木质草本植物,属菊科,是一种
壮族民间草药,主产于广西西南、云南东南、贵州及广东等
省。滇桂艾纳香全草均可入药,主要用于治疗寒湿泻痢、腹
痛肠鸣、跌打刀伤和高血压等[3]。在化学成分研究上发现
滇桂艾纳香中主含黄酮类、有机酸、甾体类等多种成分[4],
滇桂艾纳香目前并未有相关的药理作用研究报道,但其同
属植物艾纳香中的艾纳香二氢黄酮对大鼠实验性肝损伤有
保护作用[5],对脂质过氧化损伤大鼠原代培养肝细胞亦有
保护作用[6]。本文选用几种常用于分离纯化黄酮类成分
的大孔树脂[7 - 16],比较不同型号大孔吸附树脂对滇桂艾纳
香初提取物中总黄酮的纯化效果,为滇桂艾纳香黄酮成分
的进一步研究奠定基础。
1 仪器与材料
FA1004N电子天平(上海精密仪器有限公司) ;UV -
1102 型紫外分光光度计(上海天美科学仪器有限公司) ;
KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公
司) ;DH -101 - 2 电热恒温鼓风干燥箱(天津市中环实验
电炉有限公司) ;HH -2KS二列八孔智能水浴锅(郑州英峪
予华仪器有限公司) ;SHA - CA型水浴恒温振荡器(金坛市
宏华仪器厂) ;AB - 8、HPD - 100、HPD - 600、DM130 大孔
吸附树脂(沧州宝恩化工公司) ;滇桂艾纳香(批次:GZ144)
经鉴定为菊科艾纳香属植物 Blumea ri paria(Bl.)DC.的干
燥全草;芦丁对照品,批号:37179(中国药品生物制品检定
所) ;其余试剂均为分析纯。
2 方 法
2. 1 滇桂艾纳香总黄酮的测定方法
2. 1. 1 对照品溶液的制备[13] 芦丁标准品置于 120 ℃烘
箱里干燥至恒重,精密称取恒重的芦丁 21. 1 mg,置于 50
mL容量瓶中,加入适量的 60%乙醇,置水浴上微热,溶解
后放冷,以 60%乙醇稀释至刻度,摇匀备用。精密吸取其
中的 25 mL,置 50 mL量瓶中,加蒸馏水稀释至刻度,摇匀,
即得每 1 mL溶液中含芦丁 0. 211 mg的标准溶液。
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2. 1. 2 测定波长的选择 精密量取芦丁对照品溶液 5
mL,利用 NaNO2 - Al(NO3)3 - NaOH 方法进行显色处理,
在 200 ~ 800 nm波长范围内扫描,测定最大吸收波长,确定
508 nm为最佳检测波长[13]。
2. 1. 3 标准曲线的绘制[13] 精确量取芦丁对照品溶液
0、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0 mL,分别置于 6 个 25. 00 mL容量
瓶中,各加入浓度为 30%的乙醇至 6. 0 mL,各加入 5%亚
硝酸钠溶液 1. 0 mL,摇匀,室温下放置 6 min,再分别加入
10%硝酸铝溶液 1. 0 mL,摇匀并放置 6 min,最后各加入
4%氢氧化钠试液 10. 0 mL,再加入 30%乙醇定容至刻度,
摇匀后放置 15 min。以相应试剂为空白,按照紫外 -可见
分光光度测定法(药典附录Ⅳ A) ,在 508 nm波长处测定各
对照样品的吸光度,以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘
制标准曲线,得到回归方程为:y = 10. 911x - 0. 0015,r =
0. 9995。
2. 1. 4 样品液的制备 取 560 g滇桂艾纳香药材粉末,加
10 倍量的水,加热至沸腾,保持微沸状态 4 h。过滤得到滤
液,继续往药渣中加入 7 倍量的水,加热煮沸后保持微沸
1. 5 h。过滤得到第二份滤液,合并两次滤液,并浓缩至密
度为 1. 150(在 60 ℃测得) ,冷却后即制得滇桂艾纳香粗提
物浓提取液。取相当于生药 5 g 的浓提取液,置于 100. 0
mL容量瓶中,定容至 100. 0 mL,即得样品液。
2. 1. 5 样品的测定 精密量取上述步骤得到的滇桂艾纳
香样品液 1. 0 mL,置于 100. 0 mL容量瓶中,以 60%乙醇稀
释,定容至刻度。精密量取稀释后的溶液 1. 0 mL,转移至
25. 00 mL量瓶中,加入 30%乙醇至体积为 6. 0 mL,加 5%
亚硝酸钠溶液 1. 0 mL,摇匀并于室温下放置 6 min,再加入
10%硝酸铝溶液 1. 0 mL,摇匀并放置 6 min。最后加入氢
氧化钠试液 10. 0 mL,加 30%乙醇至刻度,摇匀后放置 15
min。以相应试剂为空白,在已测定的最大吸收波长 508
nm下测定样品的吸光度,平行测定 3 次。根据测得的结
果,利用 2. 1. 3 所得到的标准曲线计算样品中总黄酮的含
量。
2. 2 大孔树脂的预处理
在树脂柱内加入高于树脂层 10cm 的乙醇浸泡 4 h,放
出浸液,加入纯净水进行洗涤,直洗涤液在试管中加水稀释
不浑浊并且洗涤液用紫外光谱扫描不得检出吸收峰为止,
再用水洗涤至乙醇含量少于 1%,即可使用[13]。
2. 3 大孔树脂型号的筛选试验
称取已经处理完成的 HPD600、DM130、HPD - 100、AB
- 8 4 种大孔树脂各 3. 0 g分别置于 50. 00 mL有塞锥形瓶
中,将滇桂艾纳香浓提取液 1. 0 mL 定容置 100. 0 mL,摇
匀,每个锥形瓶加入 20. 00 mL 稀释后的溶液,置水浴恒温
振荡器中,温度为 25 ℃,转速为 120 r /min连续不间断震摇
24 h,使粗提物中的总黄酮被大孔树脂充分吸附,过滤得到
滤液,用紫外 -可见分光光度法测定续滤液中总黄酮的含
量。将吸附饱和后的各型号大孔树脂分别置于 100. 0 mL
有塞锥形瓶,再加 55 mL 95%的乙醇,置水浴恒温(25 ℃)
振荡器中,转速为 120 r /min连续震摇 36 h,使滇桂艾纳香
中的总黄酮充分解吸附,过滤得到滤液,用紫外 -可见分光
光度法测定续滤液中总黄酮的含量。依据前面得出数据用
以下公式(1)、(2)、(3)、(4) ,计算得出 HPD600、DM130、
HPD - 100、AB - 8 四种不同型号的大孔树脂的解吸附率和
静态比吸附量。计算得出的结果见表 1。
吸附量 = 上样液的浓度(mg /mL)× 上样液的体积
(mL)-流出液浓度(mg /mL)×流出液体积(mL) (1)
静态比吸附量 =吸附量 /树脂重量 (2)
解吸量 =洗脱液体积(mL)×洗脱液浓度(mg /mL)
(3)
静态解吸附率 =吸附量(mg)/解吸量(mg)× 100%
(4)
表 1 4 种大孔树脂的静态吸附效果
种类 静态比吸收量 静态解吸附率(%)
HPD100 5. 390 66. 89
AB - 8 5. 281 66. 89
HPD600 5. 255 63. 26
DM130 5. 246 63. 36
结论:由表 1 得出,滇桂艾纳香总黄酮在 HPD - 100、
HPD600、DM130、AB - 8 四种型号不一样的大孔树脂中,通
过比较得出 HPD - 100 这个型号的大孔树脂的静态比吸附
量和静态解吸附率都相对其他 3 种型号来说有更好的效
果,所以通过筛选得出 HPD - 100 这个型号的大孔树脂是
分离和纯化滇桂艾纳香总黄酮的最优树脂。
2. 4 树脂型号 HPD - 100 对滇桂艾纳香总黄酮分离和纯
化的研究
2. 4. 1 上柱液总黄酮浓度的考察 取五份相同样品液,
分别稀释成总黄酮浓度为 0. 55、0. 75、0. 95、1. 15、1. 35、
1. 55 mg /mL的溶液,以 2. 5 mL /min进行动态吸附后,静置
30 min;接着对树脂柱用纯净水按照 2. 5 mL /min这个速度
对进行动态冲洗,使其流出的液体变为无色,而且流出的液
体必须满足 Molish 反应为阴性。然后对树脂柱使用 70%
乙醇按照 2. 5 mL /min这个速度进行洗脱,直至完全洗脱出
全部黄酮类物质为止,每个浓度收集到洗脱液都为 375
mL,最后根据紫外 -可见分光光度法测出洗脱液中总黄酮
含量。
由图 1 可以看出,上柱液中总黄酮浓度的增加,会导致
洗脱液中的总黄酮含量呈先增加后减少的趋势,所得出在
上柱液的浓度为 0. 75 mg /mL 时,洗脱液中的黄酮含量得
以最高。所以上柱液总黄酮最优浓度为 0. 75 mg /mL。
图 1 上样液总黄酮浓度对树脂吸附量的影响
2. 4. 2 最大上样量的考察 将浓度为 0. 75 mg /mL 样品
溶液通过装有 20 g HPD - 100 型树脂的直径为 2. 5 cm、高
为 28. 5 cm层析柱,按照 2. 5 mL /min这个速度进行动态吸
附,分每 20 mL一段收集流出的液体,根据紫外 -可见分光
光度法测出流出液中总黄酮含量。
由图 2 可以看出,当上柱液体积为 60. 0 mL的时候,已
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经有黄酮开始溢出,大孔树脂对总黄酮的吸附已经达到饱
和的状态,所以该型号的树脂对滇桂艾纳香总黄酮的最大
吸附量为 2. 2145 mg /g。
图 2 上样液体积对树脂吸附量的影响
2. 4. 3 上样液 pH值的考察 取 4 份 0. 75 mg /mL的样品
液并且已经调节其溶液对应的 pH值为 2. 0、3. 0、4. 0、5. 0,
每种样品液 60. 0 mL,接着调节树脂柱内的大孔树脂为相
应的 pH值,按照“2. 4. 1”进行动态吸附与洗脱,根据紫外
-可见分光光度法测出洗脱液中总黄酮含量。
由图 3 可以看出,当 pH 值处于 3. 0 这个值的时候,可
以得到洗脱液中总黄酮的含量最多,所以最优的上柱液的
pH为 3. 0。
图 3 上样液 pH值对树脂吸附量的影响
2. 4. 4 不同树脂柱径高比对洗脱总黄酮量的考察 取 4
份浓度为 0. 75 mg /mL,pH值为 4. 0 的样品溶液 60. 0 mL,
接着调节树脂柱内的大孔树脂的 pH 值为 4. 0,按照 2. 5
mL /min这个速度上样于树脂柱径高比为 1 ∶ 4、1 ∶ 6、1 ∶ 8、1
∶ 10 的四根树脂柱里,静置 30 min,待吸附平衡后,用蒸馏
水洗脱至无色,然后按照“2. 4. 1”进行动态洗脱,直至完全
洗脱出全部黄酮类物质为止,根据紫外 -可见分光光度法
测出洗脱液中总黄酮含量。
由图 4 得出,为保证分离效果,选择层析柱的径高比为
1 ∶ 8。
图 4 不同径高比对树脂吸附量的影响
2. 4. 5 洗脱液乙醇体积分数的考察 取五份 0. 75 mg /
mL的样品液 60. 0 mL,按照 2. 5 mL /min 这个速度进行动
态吸附,静置 30 min,分别用 50%、60%、70%、80%、90%乙
醇按照“2. 4. 1”进行动态洗脱,收集所得的洗脱液,根据紫
外 -可见分光光度法测出洗脱液中总黄酮含量。
由图 5 得出,随着乙醇洗脱液体积分数的增大,洗脱液
中的总黄酮含量总体呈先增加后减少的趋势。而 60%的
乙醇的分离效果相对其他浓度的乙醇来说是最好的,所以
最优的洗脱溶剂为 60%乙醇。
图 5 不同洗脱液乙醇体积分数对吸附效果的影响
2. 4. 6 不同洗脱速度对洗脱总黄酮量的考察 取四份浓
度为 0. 75 mg /mL,pH值为 4. 0 的样品溶液 60. 0 mL,接着
调节树脂柱内的大孔树脂的 pH 值为 4. 0,然后按照 2. 5
mL /min这个速度上样,静置 30 min。再接着使用 60%乙
醇分别以 1. 5 mL /min、2. 5 mL /min、3. 5 mL /min、4. 5 mL /
min的速度分别按照“2. 4. 1”进行动态吸附与洗脱,根据紫
外 -可见分光光度法测出洗脱液中总黄酮含量。
由图 6 可以看出,洗脱速度为 2. 5 mL /min 时,总黄酮
的洗脱率最高,故确定 2. 5 mL /min作为最佳洗脱速度。
图 6 不同洗脱速度洗脱对吸附效果的影响
2. 4. 7 最佳洗脱体积的考察 取浓度为 0. 75 mg /mL 的
样品溶液 60 mL通过装有 20 g HPD - 100 型树脂的直径为
2. 5 cm、高为 28. 5 cm层析柱,以 2. 5 mL /min上样,静置 30
min。用蒸馏水洗脱至无色,用 60%乙醇在 2. 5 mL /min 流
速下进行洗脱,分每 25 mL一段收集流出的液体,经过试剂
显色后,根据紫外 -可见分光光度法测出洗脱液中总黄酮
含量。
由图 7 可以看出,得到的洗脱液从 275 mL 处开始往
后,洗脱液中总黄酮的含量已达到平稳的趋势,增加的黄酮
量较少,综合考虑洗脱溶剂的成本以及洗脱液中总黄酮的
得率,所以确定最优的洗脱液体积为 275 mL(即为 3. 86 倍
的柱体积)。
图 7 最佳洗脱体积的确定
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2. 4. 8 纯度检验 根据前面所得出来的最佳因素和条件
进行完整的实验,用紫外 -可见分光光度法测定得到的洗
脱液中总黄酮的含量,接着对洗脱液进行烘干浓缩,烘箱干
燥,对得到的产物进行称重和计算,平行 3 次,得出的结果
详见表 2。
纯度 = C × VM
公式中 C 代表纯化后黄酮质量浓度(mg·mL -1) ,V
代表黄酮溶液体积(mL) ,M代表黄酮物质干重(mg)。
黄酮转移率 = C × Vm
式中 C为上样液浓度(mg·mL -1) ,V 为上样液体积
(mL) ,m为纯化后黄酮质量(mg)。
表 2 纯度验证试验
编号
纯化后
黄酮量
(mg)
黄酮物
质干重
(mg)
黄酮
转移率
(%)
纯度(%)
x 珋x RSD
1 36. 861 39. 000 81. 9 94. 52 95. 05 0. 9810%
2 34. 970 37. 000 77. 7 94. 51
3 37. 490 39. 000 83. 3 96. 13
3 结果和讨论
考察了 4 种不同型号大孔树脂对滇桂艾纳香总黄酮的
吸附和解吸能力。结果表明,HPD - 100 大孔树脂对滇桂
艾纳香总黄酮有良好的纯化和富集作用。
由于现在并没有关于利用大孔树脂对滇桂艾纳香总黄
酮进行纯化和分离的报道,所以该实验具有一定的价值,从
这个实验得出的结论是:以 HPD100 这个型号的大孔树脂
对滇桂艾纳香中总黄酮进行分离纯化的效果是最优的。最
优的纯化工艺为上柱液总黄酮浓度为 0. 75 mg /mL,上样液
体积为 60 mL,上样液 pH = 4. 0,洗脱溶剂为 60%乙醇,洗
脱速度为 2. 5 mL /min,最佳吸附量为 2. 2145 mg /g,树脂柱
径高比为 1:8。纯化后总黄酮量高达 95. 05%,具有较高的
富集和纯化效率,可为利用滇桂艾纳香总黄酮进行新药开
发提供一定的参考价值。
上柱液浓度的影响:如果保持上柱液中黄酮类成分不
变的时候,上柱液浓度越低,则会导致需要的上柱液体积变
多,由于上柱液的体积增多,会导致液体中的总黄酮来不及
被大孔树脂吸附而流出,直接影响吸附量下降。相反的,如
果上柱液浓度较高的时候,也会影响大孔树脂对总黄酮的
吸附,同样造成吸附量下降。
大孔树脂 HPD - 100 具有物理化学稳定性,对滇桂艾
纳香总黄酮吸附选择性强,富集效果好,解析条件温和,且
HPD - 100 再生简便,使用周期长,是一种理想的富集纯化
滇桂艾纳香总黄酮的主材料。
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139.
走路运动可舒缓下背痛
一项新的研究显示,进行简单的有氧走路运动有助于
舒缓下背痛不适,其效果可与肌力训练、复健治疗相媲美。
以色列研究人员发现,如果每周走路 2 ~ 3 次,一次走
路 20 ~ 40 min,就能舒缓下背痛不适。
以色列台拉维夫大学医学院的研究人员招募了 52 名
下背痛患者参与研究计划,研究人员问卷方式询问他们的
疼痛程度、行动能力好坏,以及肌肉、走路耐力。
共中,有一半的患者接受临床肌肉训练计划,每周做两
三次复健肌力训练运动,持续 6 周。另外一半患者则进行
有氧走路运动,一星期走两三次,刚开始先走 20 min,然后
逐渐增加到 40 min。
研究结果显示,无论是接受复健肌力训练,还是进行走
路运动,两组成员下背痛都获得了明显改善。这说明进行
有规律的走路运动与复健治疗同样有效。
研究人员表示,当人在走路的时候,腹部、背部肌肉都
需要用力、运动,运动量与复健疗程进行的肌力训练所差无
几。如果是接受复健肌肉训练计划,多半需要使用很多特
殊设备,且要在医师、复健师监督下才能进行。但走路就比
较简单,自己一个人也能走路健身。
研究人员指出,走路是一项低冲击运动,规律地进行走
路运动,不仅可减少疼痛、酸痛发生的机率,还可以降血压、
提升脑力、增强免疫功能,对缓解压力也很有帮助。