全 文 ：蝴蝶兰褐斑病病原鉴定
游春平， 施祖荣， 向梅梅， 张云霞， 曾永三
（仲恺农业工程学院农学院，广东 广州 510225）
摘 要：对广州地区近年来新发生的蝴蝶兰褐斑病病原细菌进行分离、致病性测定、16S rDNA 序列分析和 Biolog 测定。 结果
表明， 该菌的 16S rDNA 序列与燕麦食酸菌燕麦亚种 （Acidovorax avenae subsp. avenae）、 燕麦食酸菌西瓜亚种 （A. avenae subsp.
citrulli）、燕麦食酸菌卡特兰亚种（A. avenae subsp. cattleyae） 、水稻食酸菌（A. oryzae）的序列相似度达到 99%；经 Biolog 进一步测
定，该病菌属于燕麦食酸菌燕麦亚种（A. avenae subsp. avenae）的可能性达 99%。 初步确定引起广州地区蝴蝶兰褐斑病的病原菌为
燕麦食酸菌（A. avenae）。
关键词：蝴蝶兰褐斑病； 病原菌； 鉴定； 燕麦食酸菌
中图分类号：S436.8 文献标识码：A 文章编号：1004-874X（2012）19－0071-02
Identification of the pathogen causing bacterial
brown spot of moth orchid
YOU Chun-ping, SHI Zu-rong, XIANG Mei-mei, ZHANG Yun-xia, ZENG Yong-san
(College of Agronomy, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China)
Abstract: A causal agent of bacterial brown spot in moth orchid was isolated and identified which occured in Guangzhou ，Guangdong
province in recent years. 16S rDNA sequence analysis and Biolog test were undertaken to elucidate the precise position of the causal
bacterium． The results indicated that, 16S rDNA sequence from the pathogen was 99% homologous to 16S rDNA sequences from
Acidovorax avenae subsp. avenae, Acidovorax avenae subsp. citrulli, Acidovorax avenae subsp. cattleyae, Acidovorax oryzae, Biolog test
showed the pathogen was Acidovorax avenae subsp. avenae with a 99% probability. Therefore，it could be concluded that the pathogenic
bacterium causing bacterial brown spot of moth orchid was identified as Acidovorax avenae.
Key words: bacterial brown spot of moth orchid; pathogen; identification; Acidovorax avenae
蝴蝶兰(Phalaenopsis sp.)为兰科植物，属于热带气生
类洋兰，蝴蝶兰属有 50多个种，原产于阿萨姆、菲律宾、缅
甸和中国台湾等热带地区。 我国大陆自 20 世纪 90 年代
初从台湾引进栽培，随后成逐年发展趋势，近 10 年来我
国蝴蝶兰栽培规模和面积快速发展， 栽培质量和经济效
益有很大提高，是我国花卉行业中的新兴产业，同时成为
一项高产高效的现代花卉产业。 随着蝴蝶兰的发展，蝴蝶
兰病害也相继发生， 甚至某些病害给蝴蝶兰生产造成严
重损失，如蝴蝶兰褐斑病和软腐病。 蝴蝶兰褐斑病是蝴蝶
兰生产中常见的病害，严重影响蝴蝶兰的生产。 关于蝴蝶
兰褐斑病的病原，丁爱东等 [1]与徐文华等 [2]对广州地区的
蝴蝶兰褐斑病病原菌进行了初步测定， 分别认为广州地
区蝴蝶兰褐斑病病原菌为卡特兰假单胞菌（Pseudomonas
cattleyae）和油菜黄单胞菌 （Xamthomonas campestris）；而
刘志华[3]对吉林省的蝴蝶兰褐斑病病原菌进行了测定，认
为其病原菌为卡特兰假单胞菌；黄泽春 [4]认为台湾蝴蝶
兰褐斑病菌为燕麦食酸菌卡特兰亚种（Acidovorax avenae
subsp. cattleyae）。为了准确地鉴定广州地区蝴蝶兰褐斑病
病原菌， 本研究应用分子技术和 Biolog 方法对其进行鉴
定。
1 材料与方法
1.1 试验材料
蝴蝶兰褐斑病材料采自广州花卉研究中心资源库，接
种用的蝴蝶兰（Phalaenopsis amabilis）由广州市花卉研究
中心提供。
1.2 试验方法
1.2.1 蝴蝶兰褐斑病病原菌的分离及纯化 采用常规组
织分离法进行分离：用 75%酒精擦拭叶表，再用无菌水冲
洗，将病斑（大小 1 cm）放入 0.5%次氯酸钠中浸渍 2 min
后用无菌水漂洗 2 次，将消毒好的病组织放入 5 mL 无菌
水中并捣碎， 用接种环取 1 环菌液在 NA 平板上划线，
28℃下培养 2 d，挑取单菌落，然后在 NA[5]平板上划线纯化
2次，挑取单菌落于 NA斜面上培养，置 4℃下保存备用。
1.2.2 病菌致病性测定及重新分离 将纯化的分离物转
接于 NB[5]培养液中培养 2 d，选取无病的蝴蝶兰苗 20 株
（约 12 cm 高），用灭菌过的接种针刺破叶片表皮，再将蘸
有分离物的棉花团覆盖在伤口处，28℃下保湿培养 3 d，观
察分离物的致病性； 再对发病植株进行病菌分离纯化，并
观察病菌菌落形态和颜色；将纯化的菌株再进行致病性测
定。
收稿日期：2012-04-16
基金项目：广东省现代农业产业技术体系建设专项（粤农[2009]
380 号）
作者简介：游春平（1962-），男，博士，教授，E-mail: chunpingyou
@sina.com
广东农业科学 2012 年第 19 期 71
C M Y K
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2012.19.031
（下转第 80页）
FJ447562.1
FJ418768.1
EF418616.1
FJ447560.1
EU024135.1
GU339087.1
FJ447558.1
AM850114.1
AF137504.1
F137505.1
EU024134.1
FJ447561.1
FJ447559.1
AF078759.1
CP002521.1hdl-1
0.1
图 1 蝴蝶兰褐斑病菌（hdl-1）及相近种的系统发育树
1.2.3 病菌菌株的分子鉴定 （1）病菌 DNA的提取：根据
细菌 DNA提取试剂盒（购自广东东盛生物科技有限公司）
要求提取 DNA，并保存在-20℃下备用。
（2）16S rDNA 序列的 PCR 扩增：PCR 扩增引物采用
16S rDNA 通用引物[6-7]（上游引物 16sf95：5-TGACGAGTG
GCGGACGGGTG-3/下游引物 16sr394：5-CCATGGTGTGA
CGGGCGGTGTG-3 ）。
PCR 反应体系（50 μL）：10×Taq Buffer 5 μL、上游引
物 1 μL、下游引物 1 μL、模板 1 μL、dNTPs 4 μL、MgCl2 5
μL、Ex Taq 0.5 μL、ddH2O 32.5 μL。
PCR 扩增程序 ：95℃预变性 2 min；94℃变性 40 s，
56℃退火 40 s，72℃延伸 1 min，共 30 个循环；72℃终延伸
10 min。 PCR 产物产物由华大生物技术责任公司测序。 将
得到的测序结果在 GenBank 进行 Blast 比对，找出最近似
序列，分析序列相似程度。
（3）系统发育树的构建：应用分析软件 Mega4.1 程序
中 Clustal W 程序进行序列比对，采用 Neighbor-joining 法
构建系统进化树。
1.2.4 病菌菌株的 Biolog 系统鉴定 通过 Biolog 自动微
生物分析系统〔MS(i)/C027-C01〕的革兰氏阴性细菌鉴定
微孔板 GN2 对蝴蝶兰褐斑病菌进行 95 种碳源的生化反
应测试（由广东省微生物研究所完成），并分析测试菌株
的分类地位。
2 结果与分析
2.1 蝴蝶兰褐斑病病原菌的分离与致病性测定
从具有典型症状的蝴蝶兰叶片上分离出单菌落（菌落
为圆形，黄色，表面光滑，半透明，略隆起，边缘整齐无皱
褶），经致病性测定，此分离物对蝴蝶兰具有致病性，接种
后 3 d的症状与田间症状相似，初期在伤口处出现水渍状
圆斑，接种后 2 d 病斑扩展迅速，病斑中央褐色，边缘黄
色。 而对照除了针刺处有愈合伤疤外，其他正常。 从接种
的发病组织上再次分离纯化病菌， 经再次接种后产生的
症状与原来的症状一致。 接种前后分离的病菌菌落与初
次分离的病菌菌落特征一致。
2.2 蝴蝶兰褐斑病菌 16S rDNA序列分析
PCR扩增的片段经测序得知有 1 017 bp，将测得的蝴
蝶兰褐斑病菌 16S rDNA 序列(登录号 JQ010991)与 NCBI
数据库进行 Blast同源性比对，结果显示，蝴蝶兰褐斑病菌
的 16S rDNA 序列与燕麦食酸菌燕麦亚种 （Acidovorax
avenae subsp. avenae， 登 录 号 分 别 为 AF137505、
EF418616、CP002521、EU024134、AF078759）、燕麦食酸菌
西瓜亚种（A. avenae subsp. citrulli，登录号分别为 FJ447559、
FJ447561、FJ447562、FJ447560、AM850114、FJ447558）、燕麦
食酸菌卡特兰亚种（A. avenae subsp. cattleyae，登录号分
别为 AF137504、FJ418768、GU339087、EU024135）、水稻食
酸菌 （A. oryzae， 登录号分别为 JF505947、JN700196、
JF505945）的序列相似度达到 99%。
2.3 蝴蝶兰褐斑病菌菌株的系统发育树
将序列与 NCBI 数据库进行 Blast 同源性比对， 该菌
株的 16S rDNA 序列与数据中的多个菌株的序列同源性
达到 99%，将同源性高的 15 个菌株下载，通过分析软件
Mega4.1 进行系统发育树的构建，结果表明，该菌株与一
株 燕 麦 食 酸 菌 燕 麦 变 种 （A. avenaae var.avenaae，
CP002521.1）聚集在一分支上（图 1），但与其他 3 株燕麦
食酸菌燕麦变种并不聚集在一分支上。
2.4 蝴蝶兰褐斑病菌菌株的 Biolog鉴定结果
Biolog 软件将读取的 96 孔微平板反应结果按照与数
据库的匹配程度列出 10个结果， 并将与数据库匹配良好
的鉴定结果显示在绿色状态栏上。 软件分析结果表明，蝴
蝶兰褐斑病菌菌株仅与数据库中的燕麦食酸菌燕麦亚种
匹配良好，其可能性为 99%。
3 结论与讨论
利用 16S rDNA 扩增测序技术鉴定细菌与其他细菌
鉴定方法比较，具有高效、准确、简便、特异性强的优点。
随着基因组学的迅猛发展，细菌 16S rRNA 序列数据库不
断扩大，运用 16S rRNA 序列分析技术对微生物进行分类
鉴定，确定微生物在进化中的位置，己成为微生物分类学
中最重要的方法。 本研究将蝴蝶兰褐斑病菌 16S rDNA序
列(登录号 JQ010991)与 NCBI 数据库进行 Blast 同源性比
对，结果表明，蝴蝶兰褐斑病菌的 16S rDNA 序列与燕麦
食酸菌燕麦亚种、燕麦食酸菌西瓜亚种、燕麦食酸菌卡特
兰亚种、水稻食酸菌的序列相似度都达到 99%。 从系统发
育树上的同源性来说，蝴蝶兰褐斑病菌 hdl-1 只与一株燕
麦食酸菌燕麦亚种（A. avenae subsp. avenae ATCC 19860）
在同一分支上。 与其他 3 株燕麦食酸菌燕麦亚种不在同
一分支上，因此，从 16S rDNA 序列的比对结果和系统发
育树同源性上难以确定蝴蝶兰褐斑病菌的分类地位 ；
Biolog 测试结果显示，供试的蝴蝶兰褐斑病菌菌株仅与数
据库中的燕麦食酸菌燕麦变种匹配良好， 属于此菌的可
能性为 99%。 因此，可将蝴蝶兰褐斑病菌鉴定为燕麦食酸
菌（A. avenae），这与丁爱冬等[1]、徐文华等[2]和刘志华[3]的研
究鉴定结果完全不同，与黄泽春 [4] 、Willems 等 [8]报道的蝴
蝶兰褐斑病菌 （燕麦食酸菌卡特兰亚种） 在种水平上一
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（上接第 72页）
致。 蝴蝶兰褐斑病是否由多种病原菌引起，或者致病菌是
否存在区域性的差异，还有待于进一步研究。
参考文献：
[1] 丁爱冬,刘朝祯,戚佩坤.蝴蝶兰细菌性褐斑病鉴定[J].华南农业大
学学报,199314(4):124-126.
[2] 徐文华,范燕萍.蝴蝶兰细菌性褐斑病病原菌初步鉴定[J].植物保
护,2006,32(4):87-89.
[3] 刘志华.蝴蝶兰病害的病原鉴定及室内药剂筛选[D].长春:吉林农
业大学,2008.
[4] Huang T C. The Occurrene and Control of Fungal and Bacterial
Orchid Diseases[R]. Bureau of Animal and Plant Health Inspection
and Quarantine, 2008.
[5] 方中达.植病研究方法 [M].第 3 版 .北京 :中国农业出版社 ,1998:
62-67,179-181.
[6] Sogin M L, Gunderson J H. Structural diversity of eukaryotic
small subunit ribosomal RNAs. Evolutionary implicationsp [J].
Annals of the New York Academy of Sciences,1987, 503:125-
139.
[7] Lee I M, Bartoszyk I M, GundersenRindal D E, et al.
Phylogeny and classification of bacteria in the genera
Clavibacter and Rathayibacter on the basis of 16S rRNA gene
sequence analyses [J].Applied and Environmental Microbiology,
1997,63(7):2631-2636.
[8] Willems A, Goor M, Thielemans S, et al. Transfer of several
phytopathogenic Pseudomonas species to Acidovorax as Acidovorax
avenae subsp. avenae subsp. nov. comb. nov., Acidovorax avenae
subsp.citrulli, Acidovorax avenae subsp. cattleyae, and Acidovorax
konjaci, Int[J]. J. Syst. Bacteriol,1992, 42:107–119.
样本数量
1
1
1
2
3
1
1
1
1
4
1
1
8
1
1
27
滑刃属
1
2
3
真滑刃属
1
1
1
1
1
2
1
3
11
根结属
1
1
1
3
肾形属
1
1
1
2
2
1
1
1
4
1
1
8
1
25
螺旋属
1
1
矮化属
1
1
垫刃属
1
1
丝尾垫刃属
1
1
2
4
作物
十字花科
白菜（油菜）
大白菜
芥菜
旋花科
番薯
蕹菜
菊科
生菜
苦麦菜
春菜
葱科
葱
藜科
菠菜
芸薹属
小白菜
伞形科
芹菜
茄科
茄子
杂草
合计
表 3 蔬菜作物根际线虫类群
nematodes ［M］∥LUC M，SIKORA R A，BRIDGE J，et al. Plant
parasitic nematodes in subtropical tropical agriculture.UK：CAB
International，Wallingford，1990:45-68.
[3] 谢辉 .植物线虫分类学 ［M］.第 2 版 .北京 ：高等教育出版社 ，
2005.
[4] 中华人民共和国农业部．中华人民共和国进境植物检疫性有害生
物名录[S]．中华人民共和国农业部公告第 862 号，2007．
[5] 武华国，夏晓东，何可佳.蔬菜肾状线虫病的发生规律与防治研
究[J].湖南农业科学，1997（1）：41-42.
[6] 张绍升.柑桔寄生线虫在福建的发生概况 [J].福建果树 ,1993(3):
55-57.
[7] 邓大林 ,兰庆渝 ,谢成伦 ,等 .四川、重庆两省市主要果树线虫名
录[J].四川果树,1998(1):11-14.
[8] 王扬，李娅琼，浦卫琼，等 .云南省柑桔根际短体线虫种类的鉴
定[J].华中农业大学学报，2007，26（6）：775-779.
[9] 郑小玲，项宇，赵传波，等.深圳市观赏植物根际茎线虫的种类鉴
定[J].中国植保导刊，2011，31（9）：49-51.
[10] 郑小玲，徐艳清，陈光虎，等 .观叶植物根际 3 种短体线虫的记
述[J].热带作物学报，2012，32（2）：310-314.
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