全 文 ：文章编号:1001-4829(2008)04-1010-05
　　收稿日期:2008-01-14
　　基金项目:海南省教育厅高校科研项目(Hj200626)
作者简介:符贤英(1977-),女 ,海南 ,在读硕士 , E-mail:fuxiany-
ing888@ 163.com, ＊为通讯作者。
蒌叶细菌性疫病的症状和病原菌鉴定
符贤英 ,谭志琼 ,宋卡魏 ,张荣意＊
(华南热带农业大学环境与植物保护学院 ,海南 儋州　571737)
摘　要:本文描述了海南省某蒌叶种植基地发生细菌性疫病的症状 ,根据对该病原菌的形态 、染色反应 、培养性状 、生理生化特性 、
寄主范围等测定结果 ,将该病原菌鉴定为甘蓝黄单胞菌萎叶致病变种 [ Xanthomonascampestrispv.betlicola(Patel, KulkarnietDhande
1951)Dye1978.] 。
关键词:蒌叶;细菌性疫病;病原菌鉴定
中图分类号:S432.4　　　文献标识码:A
Symptomsofbacterialblightandidentificationofthe
causalorganismonPiperbetleLinn.
FUXian-ying, TANZhi-qiong, SONGKa-wei, ZHANGRong-yi＊
(ColegeofEnvironmentandPlantProtection, SouthChinaUniversityofTropicAgricultrue, HainanDanzhou571737, China)
Abstract:ThisarticledescribedsymptomsofbacterialblightonPiperbetleLinn.inHainanprovince.Onthebasisofinvestigationconcerning
morphology, stainingreaction, culturalcharacteristics, physiologicalandbiochemicalpropertiesandhostrange, thepathogenofbacterialblight
wasidentifiedasXanthomonascampestrispv.betlicola(Patel, KulkarnietDhande1951)Dye1978.
Keywords:PiperbetleLinn.;bacterialblight;pathogenicidentification
　　蒌叶(PiperbetleLinn.)又名蒟酱 ,为胡椒科攀
援藤本植物 。我国东起台湾 ,经东南至西南部各省
区均有栽培 ,具有较高的经济价值。在细菌病害方
面国外有相关的报道 , Ragunathan(1926)报道锡兰
发生蒌叶细菌性叶斑病[ 1] 。 1928年 Ragunathan将
该病原细菌重新鉴定为 Bacterinm betleRagu-
nathan[ 2] 。之后 , Burkholder(1948)将该病原细菌
重新鉴定为 Pseudomonasbetle(Ragunathan)Burk-
holder[ 3] 。 Asthana, R.P.等人(1945)报道印度发生
蒌叶细菌性叶斑病 [ 4] 。 Patet, M.R.等人 (1951)将
该原菌鉴定为 XanthomonasbetlicolaPateletal.[ 5] 。
近年来 ,在海南省一个大面积蒌叶种植基地发生蒌
叶细菌性疫病 ,为了使广大的科技工作者和种植者
认识该病害 ,从而为防治此病提供科学依据 ,有必要
进行该病的症状描述和病原菌的鉴定 。
1　材料与方法
1.1　供试菌株
病叶采自海南省某蒌叶种植地 ,采集新鲜病叶 、
病蔓作为病害诊断和分离病原菌的标本 。在 NA培
养基上用划线分离法分离到 3个菌株 ,编号为 PL1、
PL2、PL3(PL1、PL2分离自病叶 , PL3分离自病蔓)。
经过烟草过敏性反应测定和柯赫氏法则验证为致病
的 3个菌株 PL1、PL2、PL3转至 NA斜面上培养 48
h,置于冰箱保存供鉴定时用 。为验证测定方法的正
确性 ,细菌学性状测定用下列菌株:致金色荧光假单
胞菌 (Pseudomonasaureafeciens)(P.a)、大肠杆菌
(Escherichiacoli)(E.c)、枯草芽孢杆菌 (Bacilus
subtilis)(B.s)等 ,作为某性状的阴性和阳性反应的
对照菌同时测定。
1.2　细菌学性状测定
采用常规鉴定方法进行测定 [ 6 ～ 10] 。测定项目
包括菌体形态 、染色反应 、培养性状和生理生化性
状。生理生化性状包括荧光色素 、氧化酶反应 、过氧
1010
西　南　农　业　学　报
SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences　　　　　　　　　　　　　　
2008年 21卷 4期
Vol.21　　No.4
DOI :10.16213/j.cnki.scjas.2008.04.004
化氢酶反应 、葡萄糖氧化或发酵产酸 、糖醇代谢等。
1.3　寄主范围测定
供测定的植物有胡椒(P.nigrumL.)、假蒟(P.
sarmentosumRoxb.)、山蒟(P.hanceiMaxim.)、椰子
(CocosnuciferaLinn.)、小叶桉(EucalyptusexsertF.
V.Muel.)、橡胶树(HeveabrasiliensisMuel-Arg)、菠
萝蜜(ArtocarpusheterophylusLam.)、香蕉(Musana-
naLour.)、芒果(Mangiferaindica)、美人蕉(Canna
indicaL.)、木薯 (Manibotesculenta)、花生 (Arachis
hypogeaL.)、油棕(ElaeisguineensisJacq.)、佛肚竹
(Bambusaventricosa)、毛竹 (Phylostachyshterocy-
cla)、鱼尾葵(CaryotaochlandraHance)、豇豆(Vigna
unguiculata)、茄子(SolanummelongenaL.)共 18种
植物。采用浸润接种法(不带针头的注射器注射),
接种供试植物的嫩叶 ,每种植物接 2 ～ 3片嫩叶 ,供
接种菌株为 PL1,菌液浓度为 3×108cfu/mL,接种后
第 3天开始观察 ,并记录发病情况 ,每 3d1次 ,直到
21d止。以无菌水接种作对照 。
2　结果与分析
2.1　病害症状
叶片受侵染后 ,感病初期感病部位出现黄色近
圆形小斑点 ,中央有褐色小点 ,病斑周围出现褪绿晕
圈(图 1)。随着病菌的扩展 ,褪绿晕圈变黄 ,近圆形
病斑中央的近圆形黑褐色变成不规则黑褐色斑块。
病情严重的叶片病斑连成一片 ,病叶变黄萎蔫 ,甚至
枯死(图 2)。空气湿度大时 ,病斑周围出现水渍状
斑 ,病斑背面产生黄色菌脓。蔓受侵染后 ,表现出暗
绿色斑点后扩大成褐色长条形或线形条纹 ,病情严
重的蔓变黑(图 3)。显微镜检查病叶和病蔓的病健
交界处有明显的喷菌现象。
2.2　病原菌的致病性确定
采用划线分离法 ,在 NA培养基上分离到 3个
菌株 。经烟草过敏性反应测定 ,结果表明 PL1、PL2、
PL3菌株有过敏性反应 。将 PL1、PL2、PL3 3个菌株
叶片浸润接种 5 ～ 7d出现黄色近圆形小斑点 ,随后
病斑慢慢扩大 ,病斑周围出现褪绿黄化中央出现褐
色 ,后期为不规则黑褐色病斑。接种出现的症状与
田间观察到的症状相一致。用无菌水作对照接种不
发病 。再用 NA培养基从接种发病的病组织中分离
出病原菌 ,分离到的病原菌与初次分离菌株的菌落
形态相同 ,证实 PL1、PL2、PL3 3个菌株为致病菌 。
2.3　病原菌的细菌学性状
菌体短杆状 , 大小 0.50 ～ 0.60 μm×1.30 ～
1.75 μm,革兰氏染色阴性反应 ,菌体鞭毛单根极生
表 1　糖醇代谢测定结果
Table1　Metabolismofcarbohydrate
测定项目
Testitem
分离菌 Isolate 参照菌 Referencestrain
PL1 PL2 PL3 P.a E.c B.s
葡 萄糖 Glucose + + + + + +
阿拉伯糖 L-Alabinose S S S + + +
果 糖 D-Frucatose + + + + + +
甘露 糖 D(+)mannose + + + + + +
乳 糖 Lactose + + + - + +
麦芽 糖 Maltose + + + + + +
纤维二糖 Celobiose + + + + + +
木 糖 Xylose - - - - + +
蔗 糖Sucrose + + + + + +
海藻 糖 Trehalose + + + + + +
甘油 Glycerol S S S + + +
山梨 糖 Sorbose - - - + - +
半 乳糖 D(+)Galactose + + + + + +
甘 露醇 Mannitol - - - + + +
甜醇 Dulcitol - - - + + -
山梨 醇 Sorbitol - - - + + -
　　注:“ +”表示产酸;“ -”表示不产酸 ,不利用;“S”表示表现不明显;P.a:Pseudomonasaureafeciens;E.c:Escherichiacoli;B.s:Bacilussubti-
lis。
Note:+:Acidproduction;-:Noacidproduction;S:Noobviodity;P.a:Pseudomonasaureafeciens;E.c:Escherichiacoli;B.s:Bacilussubtilis.
10114期 　　　　　　符贤英等:蒌叶细菌性疫病的症状和病原菌鉴定
(图 4),无荚膜 ,不产生芽孢 ,在 NA培养基上 , 28℃
培养 2 ～ 3d出现黄色圆形 、隆起 、光滑的菌落 ,不具
流动性 , 但在半固体培养基中有运动性 。在含
0.1mg/mLTTC的 NA培养基上 28 ℃培养不生长 。
在 KingB培养基上 28 ℃培养 2 ～ 7 d的菌落在 365
nm紫外线照射下不产生荧光色素 ,不产生聚 -β -
羟基丁酸盐(PHB)内含体;葡萄糖氧化产酸 ,能利
用柠檬酸盐而不能利用酒石酸盐作为唯一的碳素营
养来源。糖醇代谢测定结果见表 1。
　　从表 1可看出 , PL1、PL2、PL3 3个供试菌株能利用
葡萄糖 、果糖 、甘露糖 、乳糖 、麦芽糖 、纤维二糖 、蔗糖 、海
藻糖和半乳糖产酸 ,而不能利用木糖 、山梨糖 、甘露醇 、
甜醇和山梨醇产酸。对阿拉伯糖 、甘油的利用不明显。
其他生理生化特性测定结果见表 2。
表 2　其他生理生化测定结果
Table2　Partialphysiologicalandbiochemicalcharacteristicsofisolates
测定项目
Testitem
分离菌 Isolate 参照菌 Referencestrain
PL1 PL2 PL3 P.a E.c B.s
氧化酶反应
Oxydase - - - - - -
过氧化氢酶
Catalase + + + + + +
淀粉水解
Starchhydrolysis + + + + + +
明胶液化
Gelatinhydrolysis + + + + + -
七叶苷水解
Aesculinumpurisshydrolysis + + + + + +
吲哚产生
Benzazoleproduction - - - - + -
硝酸盐还原
Nitratereduction - - - - + +
从蛋白胨产 H2SH2SproductionS S S + + +
产氨
Ammoniaproduction - - - - - -
M.R. - - - - + -
V.P. - - - - - +
Tween80水解
Tween80 + + + + - -
35℃生长
35℃Growth + + + + + +
37℃生长
37℃Growth - - - + + +
10 ～ 20g/LNaCl生长
10-20g/LNaClGrowth + + + + + +
30～ 50g/LNaCl生长
30-50g/LNaClGrowth - - - + + +
生长粘性
Growthcoherency + + + + - +
石蕊牛奶
Litmusmilk 胨化 Peptone 胨化 Peptone 胨化 Peptone 胨化 Peptone 胨化 Peptone 胨化 Peptone
马铃薯薯块斜面
菌苔生长
丰盛 、薯
块变褐
菌苔生长
丰盛 、薯
块变褐
菌苔生长
丰盛 、薯
块变褐
菌苔生长
丰盛 、薯
块变褐
菌苔生长
丰盛 、薯
块变褐
PotatoblockinclineA A A B - A
　　注:生长粘性(50g/L葡萄糖 NA);“ +”表示反应阳性;“ -”表示反应阴性;“S”表示反应不明显;P.a:Pseudomonasaureafeciens;E.c:Esch-
erichiacoli;B.s:Bacilussubtilis。
Note:Growthcoherency:(50g/LGlucoseNA);+:Positive;-:Negative;S:Noobviodity;A:Bacteriamossgrowth, thepotatoblockbrowns;B:
Bacteriageneralgrowth, thepotatoblockbrowns;P.a:Pseudomonasaureafeciens;E.c:Escherichiacoli;B.s:Bacilussubtilis.
1012 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　21卷
　　从表 2可看出:PL1、PL2、PL3 3个供试菌株的
氧化酶反应 、M.R.测定 、V.P.测定均为阴性;在马
铃薯薯块斜面上 ,菌苔生长丰盛 、黄色 、薯块变褐;过
氧化氢酶反应阳性;能水解淀粉 、七叶苷 、Tween80;
液化明胶;不产生吲哚 、不能还原硝酸盐 、从蛋白胨
产 H2S反应不明显;不产氨;能使石蕊牛奶变得澄
清略透明;能在 35 ℃下生长 ,不能在 37 ℃下生长;
能在 10 ～ 20g/LNaCl葡萄糖培养基中生长 ,而不能
在 30 ～ 50 g/L葡萄糖 NA培养基中生长。
2.4　寄主范围测定结果
病原菌除能侵染蒌叶外 ,还能侵染胡椒科植物
的胡椒 、假蒟 、山蒟等 3种 。接种后 4 ～ 12 d出现黄
褐色病 ,后期为不规则黑褐色病斑。显微镜检查病
组织 ,病组织有喷菌现象;对照不发病 。病原菌不侵
染椰子 、小叶桉 、橡胶树 、菠萝蜜 、香蕉 、芒果 、美人
蕉 、木薯 、花生 、油棕 、佛肚竹 、毛竹 、鱼尾葵 、豇豆 、茄
子等 15种植物。
3　结论与讨论
　　遵循柯赫氏法则 ,通过对 3个菌株的致病性测
定 ,根据病原菌的菌落色泽 、菌体形态 、染色反应 ,不
能在含 0.1 mg/mLTTC的 NA培养基上生长等性
状 [ 6 ～ 9, 11] ,可确认 2个病原菌为同一个菌种 ,均为黄
单胞菌属细菌 。侵染蒌叶病原菌的细菌学性状与黄
单胞菌属(Xanthomonas)细菌种的鉴别性状[ 6 ～ 9]中
的(Xanthomonascampestris)细菌学性状基本相符 ,
通过寄主范围测定 ,可将该病原菌鉴定为甘蓝黄单
胞菌萎叶致病变种 [ Xanthomonascampestrispv.betli-
cola(Patel, KulkarnietDhande1951)Dye1978.] 。
人工接种此病原菌能侵染山蒟 ,以前未见报道。本
研究中 ,此病原菌在阿拉伯糖 、甘油利用和从蛋白胨
产 H2S上表现不明显。与 Peter等人鉴定的又为
Mathew, J.等人证实的蒌叶叶斑病病原菌 Xan-
thomonasbetlicolaPatel, etal.比较 ,都能利用蔗糖。
至于对木糖利用 、产氨 、37 ℃生长等情况的差异 ,是
否由地域存在菌系间差异所致 ,尚待进一步的研究。
致　谢:本论文是在文衍堂教授 、张荣意教授的悉心
指导下完成的 ,在此表示最衷心的感谢 !
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(责任编辑　陈　虹)
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