全 文 ：　　［文章编号］　１６７１－５８７Ⅹ（２０１３）０４－０６８４－０６　 ＤＯＩ：１０．７６９４／ｊｌｄｘｙｘｂ２０１３０４０９
［收稿日期］　２０１２－１１－２４
［基金项目］　青海省科技厅自然科学基金资助课题 （２０１１－Ｚ－７２１）
［作者简介］　范　妤 （１９７７－），女，陕西省宝鸡市人，讲师，医学硕士，主要从事肿瘤分子病理学研究。
［通信作者］　范　妤 （Ｔｅｌ：０２９－３８１８５１１５，Ｅ－ｍａｉｌ：ｆａｎｓ９５９５０＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ）
网络出版时间：　２０１３－０７－０２　１４：０７
网络出版地址：　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／２２．１３４２．Ｒ．２０１３０７０２．１４０７．００１．ｈｔｍｌ
总状绿绒蒿醇提物对人白血病Ｋ５６２细胞ＤＮＡ损伤及
细胞周期的影响
范　妤１，范建平２，３，李　涛１，马晓军１，杜军华２
（１．陕西中医学院组胚教研室，陕西 咸阳７１２０４６；２．青海师范大学细胞生物学教研室，青海 西宁８１０００８；
３．陕西师范大学细胞生物学教研室，陕西 西安７１００６２）
［摘　要］　目的：探讨传统藏药总状绿绒蒿体外对人慢性髓系白血病细胞株Ｋ５６２细胞增殖活性的影响，并阐明
其相关作用机制。方法：不同浓度（３０、６０、９０、１２０和１５０ｍｇ·Ｌ－１）总状绿绒蒿醇提物作用于体外培养的白血
病Ｋ５６２细胞，同时设置空白对照组，ＭＴＴ法检测各组细胞增殖抑制率，倒置显微镜观察细胞形态学改变，单
细胞凝胶电泳检测细胞ＤＮＡ损伤，流式细胞术检测细胞周期时相变化。结果：作用于Ｋ５６２细胞２４、４８和７２ｈ
后，不同浓度总状绿绒蒿醇提物组Ｋ５６２细胞生长受到明显抑制，与空白对照组比较，其增殖抑制率明显增加
（Ｐ＜０．０５），并呈浓度和时间依赖性。倒置显微镜下观察，随着总状绿绒蒿醇提物浓度增加，Ｋ５６２细胞数量减
少，细胞形态不规则，轮廓模糊，细胞碎片增多。单细胞凝胶电泳（ＳＣＧＥ）检测，与空白对照组比较，６０、９０和
１２０ｍｇ·Ｌ－１总状绿绒蒿醇提物组Ｋ５６２细核内ＤＮＡ片段化、ＴａｉｌＤＮＡ％升高，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５或
Ｐ＜０．０１）。细胞周期检测，６０、９０和１２０ｍｇ·Ｌ－１总状绿绒蒿醇提物作用于 Ｋ５６２细胞２４ｈ后，Ｇ０／Ｇ１ 期、
Ｓ期细胞所占比例逐渐下降，Ｇ２／Ｍ 期细胞所占比例逐渐升高，分别为（１．８８±０．３０）％、（５．４６±０．５７）％和
（１９．８０±１．０３）％，各浓度组与空白对照组［（１．１０±０．１２）％］比较差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０５），总状绿绒蒿
醇提物组Ｋ５６２细胞周期发生了Ｇ２／Ｍ 期阻滞。结论：总状绿绒蒿醇提物对Ｋ５６２细胞有显著的增殖抑制作用，
其机制可能与诱导ＤＮＡ损伤引发Ｇ２／Ｍ期阻滞有关联。
［关键词］　总状绿绒蒿；Ｋ５６２细胞；增殖抑制；ＤＮＡ损伤；细胞周期阻滞
［中图分类号］　Ｒ５５２　　［文献标志码］　Ａ
Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｍｅｃｏｎｏｐｓｉｓ　ｒａｃｅｍｏｓａ　Ｍａｘｉｍ．ａｌｃｏｈｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｉｎ　ＤＮＡ
ｉｎｊｕｒｙ　ａｎｄ　ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｋ５６２ｃｅｌｓ
ＦＡＮ　Ｙｕ１，ＦＡＮ　Ｊｉａｎ－ｐｉｎｇ２，３，ＬＩ　Ｔａｏ１，ＭＡ　Ｘｉａｏ－ｊｕｎ１，ＤＵ　Ｊｕｎ－ｈｕａ２
（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ，Ｓｈａａｎｘｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｘｉａｎｙａｎｇ
７１２０４６，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｅｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｑｉｎｇｈａｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ｎｉｎｇ　８１０００８，Ｃｈｉｎａ；
３．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｅｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｈａａｎｘｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ　７１００６２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｍｅｃｏｎｏｐｓｉｓ　ｒａｃｅｍｏｓａ　Ｍａｘｉｍ．ｏｆ　ａ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｔｉｂｅｔａｎ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ
ｉｎ　ｔｈｅ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｃｅｌ　ｌｉｎｅ　Ｋ５６２ｃｅｌｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｎｄ　ｔｏ　ｃｌａｒｉｆｙ　ｉｔｓ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　Ｋ５６２ｃｅｌｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ （３０，６０，９０，１２０，１５０ ｍｇ·Ｌ－１）ｏｆ
Ｍｅｃｏｎｏｐｓｉｓ　ｒａｃｅｍｏｓａ　Ｍａｘｉｍ．ａｌｃｏｈｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ，ｍｅａｎｗｈｉｌｅ　ｂｌａｎｋ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｓｅｔ　ｕｐ．ＭＴＴ　ａｓｓａｙ　ｗａｓ
４８６
第３９卷　第４期
２０１３年７月
吉　林　大　学　学　报　（医　学　版 ）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）
Ｖｏｌ．３９ Ｎｏ．４　
Ｊｕｌ．２０１３
ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｒａｔｅｓ　ｏｆ　Ｋ５６２ｃｅｌｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｍｅｃｏｎｏｐｓｉｓ　ｒａｃｅｍｏｓａ　Ｍａｘｉｍ．ａｌｃｏｈｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔ．
Ｔｈｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　Ｋ５６２ｃｅｌｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｂｙ　ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．ＤＮＡ　ｉｎｊｕｒｙ　ｗａｓ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ　ｂｙ
ｓｉｎｇｌｅ　ｃｅｌ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ａｓｓａｙ （ＳＣＧＥ）．Ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．
Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｒａｔｅｓ　ｏｆ　Ｋ５６２ｃｅｌｓ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｍｅｃｏｎｏｐｓｉｓ　ｒａｃｅｍｏｓａ　Ｍａｘｉｍ．ａｌｃｏｈｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｇｒｏｕｐｓ
ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｏｓｅ　ｉｎ　ｂｌａｎｋ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ａｆｔｅｒ　２４，４８ａｎｄ　７２ｈ（Ｐ＜０．０１）ｉｎ　ｄｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｎｄ
ｔｉｍｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒ．Ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｏｆ　Ｋ５６２ｃｅｌｓ　ｗａｓ　ｒｅｄｕｃｅｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｅｌｓ　ｓｈａｐｅｓ　ｗｅｒｅ　ｉｒｒｅｇｕｌａｒ　ｗｉｔｈ　ｃｕｎｔｏｕｒ
ｆｕｚｚｙ　ｕｎｄｅｒ　ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．Ｔｈｅ　ＳＣＧＥ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｎｕｃｌｅｕｓ　ＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＴａｉｌＤＮＡ％ ｗｅｒｅ
ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　６０，９０，ａｎｄ　１２０ｍｇ·Ｌ－１　Ｍｅｃｏｎｏｐｓｉｓ　ｒａｃｅｍｏｓａ　Ｍａｘｉｍ．ａｌｃｏｈｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔ，ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｂｌａｎｋ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）．Ｔｈｅ　ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ
ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｉｎ　６０，９０ａｎｄ　１２０ｍｇ·Ｌ－１　Ｍｅｃｏｎｏｐｓｉｓ　ｒａｃｅｍｏｓａ　Ｍａｘｉｍ．ａｌｃｏｈｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｇｒｏｕｐｓ，ｔｈｅ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ　ｏｆ
Ｋ５６２ｃｅｌｓ　ａｔ　Ｇ０／Ｇ１ｐｈａｓｅ　ａｎｄ　Ｓ　ｐｈａｓｅ　ｗｅｒｅ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ｔｈｅ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ　ｏｆ　Ｋ５６２ｃｅｌｓ　ａｔ　Ｇ２／Ｍ　ｐｈａｓｅ　ｗｅｒｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ
（１．８８％±０．３０％，５．４６％±０．５７％，１９．８％±１．０３％），ｔｈｅｙ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｂｌａｎｋ　ｃｏｎｔｒｏｌ
ｇｒｏｕｐ（１．１０％±０．１２％）（Ｐ＜０．０５），ｗｈｉｃｈ　ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ　ａ　Ｇ２／Ｍ　ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ　ａｒｒｅｓｔｉｎｇ　ｉｎ　Ｍｅｃｏｎｏｐｓｉｓ　ｒａｃｅｍｏｓａ　Ｍａｘｉｍ．
ａｌｃｏｈｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｇｒｏｕｐｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　 Ｍｅｃｏｎｏｐｓｉｓ　ｒａｃｅｍｏｓａ　Ｍａｘｉｍ．ａｌｃｏｈｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｃｏｕｌｄ　ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ
ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｋ５６２ｃｅｌｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｍａｙ　ｂｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ＤＮＡ　ｉｎｊｕｒｙ　ｏｆ　Ｋ５６２ｃｅｌｓ　ａｎｄ　ａｒｒｅｓｔｉｎｇ
ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ　ｉｎ　Ｇ２／Ｍ　ｐｈａｓｅ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｍｅｃｏｎｏｐｓｉｓ　ｒａｃｅｍｏｓａ　Ｍａｘｉｍ．；Ｋ５６２ｃｅｌｓ；ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ；ＤＮＡ　ｉｎｊｕｒｙ；ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ　ａｒｒｅｓｔ
　　现代研究［１－２］证明：多种中草药具有不同程度
的抗肿瘤作用，中药以其攻补兼施、毒副反应小及
注意整体的优越性而在肿瘤治疗中得到广泛认可或
重视。罂粟科绿绒蒿属（Ｍｅｃｏｎｏｐｓｉｓ　Ｖｉｇ．）植物是
一类具有较高经济价值的高山植物，全球共４９种，
中国有３８种，其中３２种集中分布于青藏高原地
区，资源丰富，在藏医药应用中被作为具有多种疗
效的民族药物［３］。藏医药典籍《四部医典》［４］、《晶
珠本草》［５］对其有详细的记载，且延用至今。总状
绿绒蒿（Ｍｅｃｏｎｏｐｓｉｓ　ｒａｃｅｍｏｓａ　Ｍａｘｉｍ．）是绿绒蒿属
植物之一，藏药中称为“才完”，味淡，微寒，其全
草具有消炎、止骨痛作用，用于治疗头伤和骨
折［６］。近年来有关总状绿绒蒿化学成分研究的报道
较多，但未见其抗肿瘤活性的相关文献。为研究其
现代药用价值，开发藏药资源，本研究以人慢性髓
系白血病细胞株Ｋ５６２细胞为模型，初步探讨总状
绿绒蒿的体外抗肿瘤作用及其机制，为绿绒蒿属植
物在临床治疗中的应用提供依据。
１　材料与方法
１．１　材　料　总状绿绒蒿采于自青海省玉树藏族
自治州杂多县境内，海拔４　２３２ｍ，由青海师范大
学生命与地理科学学院杜军华副教授鉴定为总状绿
绒蒿全草。取全草粉碎，称取５００ｇ，用体积分数
为０．９５的乙醇５０℃浸泡过夜，超声处理１ｈ，负
压抽吸过滤，滤液用旋转蒸发仪回收乙醇至无醇
味，超低温冷冻干燥后得棕黑色浸膏，－２０℃保
存。实验前以少量 ＤＭＳＯ 助溶后用基础培养基配
制成终浓度为２０ｇ·Ｌ－１的溶液，０．２２μｍ微孔滤
器过滤除菌，分装，－２０℃保存备用。ＤＭＳＯ 终
浓度小于０．０５％。
１．２　试剂及仪器　ＲＰＭＩ－１６４０培养基购自美国
Ｇｉｂｃｏ公司；胎牛血清购自兰州民海生物工程有限
公司；胰蛋白酶、四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）、溴化
乙锭（ＥＢ）购自Ｓｉｇｍａ公司；细胞周期检测试剂盒
购自碧云天生物技术研究所。生物安全柜购自新加
坡ＥＳＣＯ公司；二氧化碳培养箱购自德国Ｂｉｎｄ公
司；倒置显微镜购自重庆奥特光学仪器有限责任公
司；倒置荧光数码显微镜购自日本 Ｎｉｋｏｎ公司；
全自动酶标仪购自美国Ｂｉｏ－Ｔｅｋ公司；流式细胞仪
购自美国ＢＤ公司。
１．３　细胞培养　人慢性髓系白血病细胞株 Ｋ５６２
细胞（陕西中医学院形态学实验中心传代保种），在
含１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ－１６４０培养基中置于体积
分数为 ５％ＣＯ２、３７℃ 培养箱中培养传代，每
１～２ｄ传代１次。
１．４　ＭＴＴ比色法检测总状绿绒蒿醇提物对Ｋ５６２
细胞的生长抑制作用　取生长状态良好的对数生长
期Ｋ５６２细胞，调整细胞浓度至１×１０５　ｍＬ－１，设
空白对照组（加入溶剂对照处理）和不同浓度药物处
理组（总状绿绒蒿醇提物终浓度分别为３０、６０、
９０、１２０和１５０ｍｇ·Ｌ－１），混匀后接种于９６孔板
中，每孔１００μＬ，每组４个复孔，５％ＣＯ２、３７℃
培养箱中继续培养２４、４８和７２ｈ后，每孔加入
５８６范　妤，等 ．　总状绿绒蒿醇提物对人白血病Ｋ５６２细胞ＤＮＡ损伤及细胞周期的影响
５ｇ·Ｌ－１　ＭＴＴ溶液２０μＬ，继续培养４ｈ后，每
孔加入三联液１００μＬ，３７℃培养箱中放置１８ｈ，
用酶标仪在５７０ｎｍ波长处测定吸光度（Ａ）值，用
以下公式计算总状绿绒蒿醇提物对肿瘤细胞生长抑
制率：生长抑制率（％）＝［１－（药物组加ＭＴＴＡ值－
药物组无ＭＴＴＡ 值）／对照组加ＭＴＴＡ 值－对照组无ＭＴＴ
Ａ值］×１００％。实验重复３次。
１．５　倒置显微镜下观察细胞形态学变化　取对数
期生长的Ｋ５６２细胞，以１×１０５　ｍＬ－１浓度接种于
６孔板中，每孔加入细胞悬液１ｍＬ，设空白对照
组和不同浓度药物处理组（６０、９０和１２０ｍｇ·Ｌ－１
总状绿绒蒿醇提物），作用２４ｈ后，在倒置显微镜
下（×４００倍）观察并照相，记录细胞形态变化。
１．６　单细胞凝胶电泳（ＳＣＧＥ）观察细胞核损伤　
ＳＣＧＥ即彗星电泳，是用于检测外在因素导致细胞
核ＤＮＡ 损伤程度的实验方法。当细胞核受到损
伤，核内ＤＮＡ断裂时，细胞核在电泳条件下，其
断裂ＤＮＡ片段的移动速度将高于细胞核部分，从
而形成彗星状图形；尾部越长或面积越大，表明细
胞核ＤＮＡ 损伤程度越高，而没有ＤＮＡ损伤的细
胞核成圆形［７］。细胞处理同１．４步骤，药物处理
４、８和１２ｈ后，分别离心收集细胞，ＰＢＳ重悬
后，取３０μＬ细胞悬液和９０μＬ、３７℃的低熔点琼
脂糖溶液在混匀，用移液枪灌注到镀膜后搭建成
“品”字型的玻片缝隙中，４℃放置，待胶凝固后取
下盖玻片，制成含细胞胶层，依次放入４℃预冷的
裂解液（ｐＨ＝１３）中裂解１ｈ，解旋液（ｐＨ＝１０）中
避光解旋２０ｍｉｎ，２５Ｖ、２００～２５０ｍＡ条件下低
温避光电泳２０ｍｉｎ，室温下中和液（ｐＨ＝７．５）中浸
泡５ｍｉｎ，放入梯度酒精中固定，晾干后每张胶板
上滴加２０μＬ溴化乙锭（２０ｍｇ·Ｌ
－１），加盖盖玻
片，荧光显微镜下观察拍照。ＣＡＳＰ分析软件对图
像进行分析，每张玻片至少计数２５个细胞，观察
指标 为 尾 部 ＤＮＡ 百 分 率 （ＴａｉｌＤＮＡ％），即
ＴａｉｌＤＮＡ含量的百分率。
１．７　流式细胞术检测细胞周期　Ｋ５６２细胞处理同
上，２４ｈ后收集细胞，用乙醇４℃固定过夜，离心
去除固定液，冷 ＰＢＳ 洗２次，每管细胞加入冷
ＰＢＳ　４２５μＬ、ＲＮＡ 酶５０μＬ、ＰＩ　２５μＬ 混匀，
３７℃避光放置３０ｍｉｎ，采用流式细胞仪检测，计
数５　０００个细胞，检测细胞周期的分布。结果以细
胞周期各时相中细胞的百分率表示。
１．８　统计学分析　采用ＳＰＳＳ　１３．０统计软件包进
行统计学处理，细胞增殖抑制率、ＴａｉｌＤＮＡ％及细
胞周期时相分布比率以ｘ±ｓ表示，组间比采用方
差分析。
２　结　果
２．１　不同浓度总状绿绒蒿醇提物组 Ｋ５６２细胞的
增殖抑制率　ＭＴＴ结果显示：不同浓度总状绿绒
蒿醇提物（３０、６０、９０、１２０和１５０ｍｇ·Ｌ－１）体外
作用于Ｋ５６２细胞２４、４８和７２ｈ后，对 Ｋ５６２细
胞的增殖有明显的抑制作用，与空白对照组比较差
异均有统计学意义（Ｐ＜０．０５），并呈现浓度和时间
依赖性。见表１。
表１　各组Ｋ５６２细胞的增殖抑制率
Ｔａｂ．１　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｒａｔｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｋ５６２ｃｅｌｓ　ｉｎ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｇｒｏｕｐｓ ［ｎ＝３，η／（ｘ±ｓ）％］
Ｇｒｏｕｐ
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｒａｔｅ
（ｔ／ｈ）　　２４　 ４８　 ７２
Ｂｌａｎｋ　ｃｏｎｔｒｏｌ　 ０．００　 ０．００　 ０．００
Ｍｅｃｏｎｏｐｓｉｓ　ｒａｃｅｍｏｓａ　Ｍａｘｉｍ．
　ａｌｃｏｈｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔ（ｍｇ·Ｌ－１）
　 ３０　 ２８．６０±５．３４＊ ３８．３５±４．２７＊ ４６．２９±４．１２＊
　 ６０　 ３１．３１±３．４８＊ ４４．８９±３．５６＊ ５９．４８±３．７９＊
　 ９０　 ３５．２１±６．３２＊ ６４．９２±４．４６＊ ７０．０７±５．３６＊
　１２０　 ５４．４４±５．６３＊ ８２．０５±４．７５＊ ８６．１７±４．４１＊
　１５０　 ８２．４０±３．７０＊ ９４．７３±３．９８＊ ９４．６２±５．７４＊
　　＊ Ｐ＜０．０５　ｖｓ　ｂｌａｎｋ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．
２．２　不同浓度总状绿绒蒿醇提物组 Ｋ５６２细胞形
态　倒置显微镜下观察：空白对照组细胞生长状态
好，生长旺盛，轮廓清晰，折光均匀且透明，核膜
轮廓明显。６０ｍｇ·Ｌ－１总状绿绒蒿醇提物组细胞
数量减少，大小不均匀，部分细胞皱缩变小，轮廓
模糊，折光性差；９０ｍｇ·Ｌ－１总状绿绒蒿醇提物
６８６ 吉林大学学报（医学版）　第３９卷　第４期　２０１３年７月
组细胞数量明显减少，轮廓模糊，出现细胞碎片；
１２０ｍｇ·Ｌ－１总状绿绒蒿醇提物组细胞形态不规
则，细胞碎片较多。随各组总状绿绒蒿醇提物浓度
增加，Ｋ５６２细胞生长抑制现象逐渐明显。见图１。
图１　各组Ｋ５６２细胞形态学（×４００）
Ｆｉｇ．１　Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　Ｋ５６２ｃｅｌｓ　ｉｎ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｇｒｏｕｐｓ（×４００）
Ａ：Ｂｌａｎｋ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ；Ｂ－Ｄ：６０，９０，ａｎｄ　１２０ｍｇ·Ｌ－１　Ｍｅｃｏｎｏｐｓｉｓ　ｒａｃｅｍｏｓａ　Ｍａｘｉｍ．ａｌｃｏｈｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｇｒｏｕｐｓ．
２．３　ＳＣＧＥ检测各组 Ｋ５６２细胞的细胞核损伤　
空白对照组细胞未受损伤，细胞核圆形，无拖尾现
象；当不同浓度总状绿绒蒿醇提物 （６０、９０和
１２０ｍｇ·Ｌ－１）作用于Ｋ５６２细胞后，细胞核出现不
同程度损伤，出现明显的彗星状拖尾，且尾部荧光
强度逐渐增强 （图２，见插页一）。ＴａｉｌＤＮＡ％检
测结果显 示：与 空 白 对 照 组 比 较，６０、９０ 和
１２０ｍｇ·Ｌ－１总状绿绒蒿醇提物组 ＴａｉｌＤＮＡ％升
高，差异有统计学意义 （Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１），且
表现出时间和浓度的依赖性关系。见表２。
表２　各组Ｋ５６２细胞的ＴａｉｌＤＮＡ％检测结果
Ｔａｂ．２　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ＴａｉｌＤＮＡ％ｏｆ　Ｋ５６２ｃｅｌｓ　ｉｎ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｇｒｏｕｐｓ ［η／（ｘ±ｓ）％］
Ｇｒｏｕｐ
ＴａｉｌＤＮＡ％
（ｔ／ｈ）　　４　 ８　 １２
Ｂｌａｎｋ　ｃｏｎｔｒｏｌ　 ０．０１０　０±０．００３　８　 ０．０１０　０±０．００２　１　 ０．０１０　０±０．００２　３
Ｍｅｃｏｎｏｐｓｉｓ　ｒａｃｅｍｏｓａ　Ｍａｘｉｍ．
　ａｌｃｏｈｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔ（ｍｇ·Ｌ－１）
　 ６０　 ４．４６０　０±１．３４０　０＊ ３．８８０　０±１．３５０　０＊ ３．８９０　０±１．７９０　０＊
　 ９０　 ８．８３０　０±３．５４０　０＊＊ １５．１５０　０±５．０１０　０＊＊ ２１．７３０　０±６．６８０　０＊＊
　１２０　 １３．２５０　０±４．７５０　０＊＊ ２７．９７０　０±８．３１０　０＊＊ ３８．１３０　０±１４．８６０　０＊＊
　　＊ Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１　ｖｓ　ｂｌａｎｋ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．
２．４　不同浓度总状绿绒蒿醇提物组细胞周期的变
化　流式细胞术检测，总状绿绒蒿醇提物作用于
Ｋ５６２细胞２４ｈ后，随着药物浓度升高，Ｇ０／Ｇ１
期、Ｓ期细胞所占比例逐渐下降，Ｇ２／Ｍ 期细胞所
占比例逐渐升高，不同浓度总状绿绒蒿醇提物组与
空白对照组比较差异均有统计学意义 （Ｐ＜０．０５）。
表明总状绿绒蒿醇提物可将Ｋ５６２细胞分裂阻滞于
Ｇ２／Ｍ期，且对细胞周期的影响呈现剂量依赖性。
见图３和表３。
３　讨　论
本研究初步探讨了总状绿绒蒿醇提物诱导人白
血病Ｋ５６２细胞的 ＤＮＡ损伤作用及其分子机制，
结果表明：总状绿绒蒿醇提物能有效抑制Ｋ５６２细
胞的体外增殖，并呈现出明显的时间－剂量依赖关
系；形态学观察发现：伴随总状绿绒蒿醇提物的浓
度增加，Ｋ５６２细胞数量减少，轮廓模糊，细胞核
固缩，核形态不规则，细胞碎片增多。形态学变化
与细胞增殖抑制实验结果相符，表明总状绿绒蒿醇
提物能够抑制Ｋ５６２细胞的增殖，具有体外抗肿瘤
活性。同时本研究结果显示：总状绿绒蒿醇提物能
诱导Ｋ５６２细胞的 ＤＮＡ 损伤，随给药浓度升高
ＤＮＡ的损伤程度增强；总状绿绒蒿醇提物作用
Ｋ５６２细胞后，细胞周期阻滞于Ｇ２／Ｍ 期，显示其
诱导的Ｋ５６２细胞的ＤＮＡ损伤和细胞周期时相分
布的改变具有关联性。
７８６范　妤，等 ．　总状绿绒蒿醇提物对人白血病Ｋ５６２细胞ＤＮＡ损伤及细胞周期的影响
图３　各组Ｋ５６２细胞周期流式细胞图
Ｆｉｇ．３　Ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ｇｒａｐｈ　ｏｆ　ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ　ｏｆ　Ｋ５６２ｃｅｌｓ　ｉｎ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｇｒｏｕｐｓ
Ａ：Ｂｌａｎｋ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ；Ｂ－Ｄ：６０，９０，ａｎｄ　１２０ｍｇ·Ｌ－１　Ｍｅｃｏｎｏｐｓｉｓ　ｒａｃｅｍｏｓａ　Ｍａｘｉｍ．ａｌｃｏｈｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｇｒｏｕｐｓ．
表３　各组Ｋ５６２细胞周期时相分布
Ｔａｂ．３　Ｔｉｍｅ－ｃｏｕｒｓｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ　ｏｆ　Ｋ５６２ｃｅｌｓ　ｉｎ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｇｒｏｕｐｓ ［ｎ＝３，η／（ｘ±ｓ）％］
Ｇｒｏｕｐ
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ　ｏｆ　Ｋ５６２ｃｅｌｓ
Ｇ０／Ｇ１ Ｓ　 Ｇ２／Ｍ
Ｂｌａｎｋ　ｃｏｎｔｒｏｌ　 ５２．２５±１．３４　 ４６．６５±１．７２　 １．１０±０．１２
Ｍｅｃｏｎｏｐｓｉｓ　ｒａｃｅｍｏｓａ　Ｍａｘｉｍ．
　ａｌｃｏｈｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔ（ｍｇ·Ｌ－１）
　 ６０　 ４９．６１±１．６１　 ４８．５１±１．７５　 １．８８±０．３０
　 ９０　 ４７．８６±２．１５　 ４６．６８±２．０６　 ５．４６±０．５７＊
　１２０　 ４２．９３±２．４８＊ ３７．２６±１．９１＊ １９．８０±１．０３＊＊
　　＊ Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１　ｖｓ　ｂｌａｎｋ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．
　　细胞周期是细胞分裂过程的完整体现，分为
Ｇ１ 期即 ＤＮＡ 合成前期、Ｓ 期即 ＤＮＡ 合成期、
Ｇ２ 期即 ＤＮＡ 合成后期和 Ｍ 期即细胞分裂期，
Ｇ０ 期为暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，执行
一定生物学功能的细胞所处的时期［８－９］，这一过程
受到细胞周期蛋白依赖性激酶 （Ｃｄｋｓ）与由Ｇ１／Ｓ
期、Ｓ期和 Ｇ２／Ｍ 期３个检测点的细胞周期素
（ｃｙｃｌｉｎ）组成的复合物调控，其中Ｇ２／Ｍ 期检测点
主要由ＣｙｃｌｉｎＢ／Ｃｄｋ１复合物调节［１０－１１］。肿瘤细胞
ＤＮＡ在细胞周期运行过程中若持续受到损伤因素
作用，引起ＤＮＡ损伤后能激活细胞周期损伤检验
点，如果在进入有丝分裂之前对受损伤的ＤＮＡ修
复失败或者损伤因素积累，就可能导致细胞死
亡［１２－１４］。本研究中ＳＣＧＥ及流式细胞术结果表明：
Ｋ５６２细胞ＤＮＡ受到损伤，Ｇ２／Ｍ 调控点异常阻
滞，其机制可能是能力及关卡基因 （ＡＴＭ）蛋白
识别ＤＮＡ断裂点并迅速磷酸化激活，然后通过磷
酸化激活ｐ５３、Ｃｈｋ２及Ｃｈｋ１等下游底物起作用，
其过程与干扰Ｃｄｋｓ的抑制性磷酸化Ｔｙｒ－１５位点的
脱磷酸化有关，最终使细胞不能通过检测点 “关
卡”导致细胞周期阻滞［７，１５］。总状绿绒蒿醇提物诱
导的Ｋ５６２细胞周期阻滞具有两方面的意义：一方
面为受损伤ＤＮＡ的修复提供了缓冲时间，同时另
一方面也增加了ＤＮＡ及其修复系统暴露于外界刺
激的时间和几率。Ｋ５６２细胞ＤＮＡ损伤与修复失
衡可能是总状绿绒蒿醇提物诱导其ＤＮＡ损伤加重
并趋向凋亡的重要环节［１６］。本实验结果提示：总
状绿绒蒿醇提物通过诱导Ｋ５６２细胞ＤＮＡ损伤来
改变细胞周期时相的分布，并通过细胞周期Ｇ２／Ｍ
期的阻滞引起Ｋ５６２细胞ＤＮＡ损伤的进一步加重。
综上所述，总状绿绒蒿醇提物对人白血病细胞
株Ｋ５６２细胞有显著的增殖抑制作用，其作用机制
可能与诱导Ｋ５６２细胞ＤＮＡ损伤引起Ｇ２／Ｍ 期阻
滞有关，其具体机制还有待通过进一步的研究。
［致谢：衷心感谢陕西师范大学生命科学院刘全宏教授
对本研究给予的帮助］
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