全 文 ：收稿日期:2007-07-06　　　接受日期:2007-11-23
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30571285 , 30671452)资助。
作者简介:高华君(1971—),男 ,山东昌乐人 ,副研究员 ,博士,主要从事果树生理研究。 Tel:0538-8266655, E-mai l:ghj@sdip.cn
＊通讯作者 Tel:0538-8249304, E-mai l:hqyang@sdau.edu.cn
平邑甜茶幼苗生长过程中精氨酸和
一氧化氮水平的变化
高华君1 , 杨洪强2＊ , 杜方岭3 , 赵海洲2
(1 山东省果树研究所 ,山东泰安 271000;2 山东农业大学园艺科学与工程学院 ,作物生物学国家重点实验室 ,山东泰安 271018;
3 山东省农业科学院 ,山东济南 250100)
摘要:研究了平邑甜茶幼苗生长过程中根 、茎 、叶和子叶精氨酸 、精氨酸酶 、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)水
平的变化及其与幼苗生长发育的关系。结果表明 ,精氨酸含量和精氨酸酶活性子叶中最高 , 且随幼苗生长发育逐
渐下降 ,其次为叶片和茎 , 根中最低。幼苗生长第 5 d 的子叶中 NO含量及 NOS 活性均最高 , 此后迅速下降至较低
水平。除子叶外 , NO含量和 NOS 活性在茎中较高 , 生长第 11 d 均达到最高 ,与茎的快速生长相适应;叶片居中 , 在
第17 d达到高峰 , 与叶片的快速生长有关;根中最低 ,在第 8 d 达到最高 ,与主根的快速生长相对应。这些结果表
明 , NO在快速生长的器官中含量高 ,可能与平邑甜茶幼苗各器官的生长发育有关;而子叶中的精氨酸可能是平邑
甜茶幼苗早期生长主要的氮素贮藏营养物质之一。
关键词:精氨酸;精氨酸酶;一氧化氮;一氧化氮合酶;平邑甜茶
中图分类号:S66　　　文献标识码:A　　　文章编号:1008-505X(2008)04-0774-05
Changes in arginine and nitric oxide levels in Malus hupehensis Rehd.
seedlings during plant development
GAO Hua-jun1 , YANG Hong-qiang2 ＊ , DU Fang-ling3 , ZHAO Hai-zhou2
(1 Shandong Institute of Pomology , Tai an , Shandong 271000 , China;2 College of Horticulture Science and Engineering ,
Shandong Agricultural University , StateKey Laboratory of Crop Biology , Tai an , Shandong 271018 , China;
3 Shandong Academy of Agricultural Science , Jinan 250100 , China)
Abstract:Changes in arginine , arginase , nitric oxide(NO), nitric oxide synthase(NOS)levels in roots , stems , leaves
and cotyledons of Malus hupehensis Rehd.seedlings , which are related to plant growth and development , were investigat-
ed.The results showed that the levels of arginine and arginase were the highest in cotyledons , which decreased slowly
during plant development , followed by leaves and stems , with roots being the lowest.In cotyledons , NO and NOS levels
reached the highest after 5 days of growth , then decreased quickly after 8 days of growth.Among roots , stems and
leaves , the highest levels of NO and NOS existed in stems and reached the highest after 11 days of growth , coinciding
with the rapid elongation of stems , while those of roots were the lowest and reached the highest after 8 days of growth , co-
inciding with the rapid elongation of primary roots.NO and NOS levels in leaves reached the highest after 17 days of
growth , coinciding with the rapid expansion of leaves.It is concluded that NO is mainly located in actively growing tis-
sues , suggesting its possible roles in plant growth and development in Malus hupehensis Rehd.seedlings and cotyledon
arginine might be one of the important nitrogen reserve that is required for the early development of the seedlings.
Key words:arginine;arginase;nitric oxide;nitric oxide synthase;Malus hupehensis Rehd.
植物营养与肥料学报 2008 , 14(4):774-778
Plant Nutrition and Fertilizer Science
　　精氨酸是植物体内 N/C比最高的氨基酸之一 ,
它能够以较少的碳结合较多的氮 ,是苹果树体中主
要氮素贮藏营养物质之一[ 1] 。一氧化氮(Nitric ox-
ide ,NO)广泛参与植物的多种生理过程 ,外源和内源
NO均能调节植物生长发育 ,NO 的生理作用和信使
功能已成为近年国际生命科学领域的研究热点之
一[ 2] 。精氨酸是很多植物种子的主要贮藏氮形态 ,
可占到种子贮藏蛋白氮含量的 50%和发芽后幼嫩
组织可溶性氮的 90%[ 3-4] 。精氨酸作为一种氮素贮
藏形态 ,其分解利用首先通过精氨酸酶催化生成鸟
氨酸和尿素 ,再用于其他含氮化合物的生成[ 3] ,植物
精氨酸酶的研究也多集中于发芽的种子和萌发后早
期幼苗的生长[ 5] 。精氨酸能够转化为多胺 、NO等重
要物质 ,并通过这些代谢产物行使其更广泛的生理
功能[ 6] ;其中NO是一种多功能信使分子 ,参与植物
生长发育和抗逆性的多种生理生化过程[ 7-8] , 被认
为是一种新型的植物生长调节物质[ 9] 。动物细胞
NO的产生主要依赖于一氧化氮合酶(Nitric oxide
synthase ,NOS),而植物细胞存在酶促和非酶促反应
两类途径 ,其中也存在以 L-精氨酸为底物的类 NOS
活性[ 10-12] 。
平邑甜茶是原产山东省沂蒙山区的木本植物资
源 ,常用作苹果和观赏海棠的砧木 ,并有重要观赏价
值。同时 ,平邑甜茶具有高度无融合生殖能力 ,实生
后代个体差异非常小 ,是很好的试验材料。
近年来 ,植物中 NO的研究取得了很大进展 ,但
多集中在外施 NO 对植物生理生化过程的影响上
(如抗逆性等),而 NO 的形成特点及其与植物生长
发育的关系报道很少 。种子萌发和萌发后幼苗的快
速生长是一个植物个体早期形态建成的复杂过程 ,
其中涉及一系列复杂的生理生化反应 ,其中包括作
为贮藏氮素营养的精氨酸的分解和再利用 。由于
NO与植物的生长发育密切相关 ,而精氨酸是其产生
的供体氨基酸 ,因此通过研究平邑甜茶种子萌发后
幼苗早期快速生长过程中根 、茎 、叶和子叶精氨酸和
NO水平及相关酶活性的变化 ,以便更好地了解和认
识精氨酸和NO的生理作用以及相互的关系。
1　材料与方法
1.1　试验方法
将低温层积至露白的平邑甜茶种子播于洗净的
石英砂中 ,室温 、自然光照培养。分别于第 5 、8 、11 、
14 、17和 20 d选取长势一致的幼苗 ,分为根(胚根)、
茎(包括下胚轴和上胚轴)、叶(真叶)和子叶 4部分 ,
液氮速冻保存供测定用;同时测量植株根和茎的长
度 ,作为幼苗生长情况的指标。
1.2　测定项目与方法
1.2.1　精氨酸含量 、精氨酸酶活性测定　按 1∶10
(w/v)的比例用 10%(w/v)三氯乙酸冰浴研磨提取
植物材料中的精氨酸 ,4℃13 000×g 离心 10 min ,然
后根据 Sakaguchi[ 13]的方法测定 。精氨酸酶活性按
照 Chen等[ 4]的方法测定。
1.2.2　一氧化氮(NO)含量测定　NO 的测定采用
鲁米诺-H2O2 化学发光法[ 14-16] 。植物材料按 1∶5(w/
v)的比例用无氧水冰浴研磨 ,4℃12 000×g 离心 20
min ,上清为 NO 提取液 , 立即用于化学发光测定。
仪器采用 BPCL 超微弱发光测量仪(中国科学院生
物物理研究所)。测量参数:调节高压为 800 V ,标
准光源发光强 度 7 000 counts/s , 本底强度 5
counts/ s ,采样间隔时间 1 s ,测定温度 30℃。向发光
管中加入160 μL发光液(50 mmol/L碳酸盐缓冲液 ,
含 10μmol/L鲁米诺 、20 mmol/L H2O2 、2 mmol/L ED-
TA ,37℃时 pH 9.72),快速注入 40 μL 提取液 ,记录
波长635 nm时 6 s的累计发光值 。以每克鲜重产生
的化学发光量表示 NO 相对含量(1×106 counts/g ,
FM)。
1.2.3　一氧化氮合酶(NOS)活性测定　NOS的提取
按照Guo 等[ 11]的方法 , 酶的反应测定参照徐顺清
等[ 17]的化学发光法 ,有改动 。反应体系 400 μL ,包
括 100 μL 酶液和 300 μL NOS 反应液(50 mmol/L
HEPES ,pH 7.4 ,含 0.5 mmol/L CaCl2 ,1 mmol/L DTT ,
1 μmol/L FAD , 1 μmol/L FMN , 0.1 μmol/L CaM , 1
mmol/L β-NADPH ,2 mmol/L L-精氨酸),30℃水浴
反应 30 min ,按以上的化学发光法测定生成的 NO
量 ,以反应前的化学发光量作为空白。NOS 活性以
每分钟每克鲜重产生的化学发光量表示[ 1 ×103
counts/(min·g), FM] 。
2　结果与分析
2.1　幼苗生长过程中精氨酸含量和精氨酸酶活性
的变化
图 1为平邑甜茶种子萌发后幼苗早期生长过程
中根 、茎 、叶和子叶精氨酸含量的变化动态 。图中看
出 ,不同器官精氨酸含量差异很大。子叶中含量远
远高于根 、茎和叶 ,其次为叶片 ,根中最低 。子叶精
氨酸含量以生长第 5 d尚未展开时最高 ,以后随幼
苗生长发育逐渐降低。与子叶相比 ,根 、茎和叶中精
氨酸含量随幼苗生长发育变化较小。
7754 期　　　 高华君 ,等:平邑甜茶幼苗生长过程中精氨酸和一氧化氮水平的变化
图 1　幼苗生长过程中不同器官精氨酸含量的变化
Fig.1　Changes in arginine content in different organs of
Malus hupehensis Rehd.seedlings during plant development
幼苗生长过程中不同器官精氨酸酶活性的变化
(图 2)看出 ,精氨酸酶活性与精氨酸含量有着基本
相同的变化规律 ,即两者之间呈正比例关系。子叶
中精氨酸酶活性远高于根 、茎和叶 ,以生长第 5 d尚
未展开时活性最高 ,之后迅速下降 ,至第 11 d 时下
降了 52.5%,此后基本维持在较高的水平 ,直到生
长的第 20 d。与精氨酸类似 ,根 、茎 、叶中精氨酸酶
活性明显低于子叶(三者中又以叶片最高 ,根最低),
且随幼苗生长发育变化不大。值得注意的是 ,幼苗
生长第 5 d 时子叶尚未展开 ,幼叶还未出现(见图
5),此时精氨酸含量和精氨酸酶活性均为最高 。而
精氨酸是一种贮藏氨基酸 ,表明子叶中高水平的精
氨酸含量和精氨酸酶活性可能主要与精氨酸作为氮
素贮藏营养的分解利用有关 ,精氨酸是平邑甜茶种
子萌发和幼苗早期生长的主要贮藏营养之一 。
图 2　幼苗生长过程中不同器官精氨酸酶活性的变化
Fig.2　Changes in arginase activity in different organs of
Malus hupehensis Rehd.seedlings during plant development
2.2　幼苗生长过程中 NO含量和 NOS活性的变化
平邑甜茶种子萌发后早期幼苗生长过程中不同
器官 NO含量及变化规律不同 。图 3 看出 ,幼苗生
长第5 d尚未展开的子叶中 NO 含量最高 ,但到第 8
d时迅速下降为第5 d的 20.1%,此后基本维持在较
低的水平 ,一直持续到生长的第 20 d。根中 NO含
量在第 5 d时已有较高的水平 ,到第 8 d时升至最
高 ,此后迅速下降 ,基本维持在较低的水平(第 17 d
时稍有升高),在所有器官中其含量是最低的。除幼
苗生长第5 d的子叶外 ,茎中NO含量在各类器官中
是最高的 。从幼苗生长的不同时期的变化来看 ,茎
中NO含量在生长前期(5～ 11 d)较后期高 ,并在第
11 d 时达到最高 ,此后基本呈下降趋势 。叶中 NO
含量高于根但低于茎 ,并在幼苗生长第 17 d 时达到
最高。
图3　幼苗生长过程中不同器官 NO含量的变化
Fig.3　Changes in nitric oxide content in different
organs of Malus hupehensis Rehd.seedlings
during plant development
　　图 4表明 ,幼苗生长过程中不同器官 NOS活性
除生长第5 d的幼苗外 ,以茎中NOS 活性最高 ,其次
为叶 ,根中最低 ,这与 NO含量的分布基本一致 ,说
明平邑甜茶幼苗中 NOS 是 NO合成的关键酶之一。
从不同时期的变化规律来看 ,NOS 活性与 NO 含量
的变化也基本一致 ,第 5 d时子叶中NOS 活性最高 ,
但到第 8 d时已下降为第 5 d的 47.6%,此后基本维
持在这一水平 ,一直持续到生长的第 20 d。与 NO
类似 ,根 、茎和叶中 NOS 活性也分别在第 8 d 、11 d
和 17 d时达到最高 。
结合图 5和图 6 发现 ,平邑甜茶幼苗生长过程
中不同器官NO和NOS 水平的这种变化特点与各器
官的生长发育状态密切相关 。叶片中 NO 含量和
NOS在幼苗生长的第 17 d均较高 ,而此时正是叶片
加速生长的时期 ,此时 NO 含量的升高可能与叶片
的快速生长相联系(图 5)。根和茎中NO含量和NOS
776 植 物 营 养 与 肥 料 学 报 14 卷
图 4　幼苗生长过程中不同器官 NOS活性的变化
Fig.4　Changes in nitric oxide synthase activity
in different organs of Malus hupehensis Rehd.
seedlings during plant development
图 5　生长 5、8 、17 d的平邑甜茶幼苗
Fig.5　Malus hupehensis Rehd.seedlings after
5 , 8 and 17 d growth
图 6　平邑甜茶幼苗生长过程中根 、茎长度的变化
Fig.6　Changes in root and stem length in Malus hupehensis
Rehd.seedlings during plant development
活性在幼苗生长的前期(5～11 d)较高 ,而此时正是
根和茎伸长生长最快的时期(图 6)。茎中 NO 含量
和NOS活性则均在第 11 d达到最高 ,这很可能与茎
的生长分化密切相关(图 6)。由图 6可以看出 ,第 5
d至第 11 d是茎伸长生长最快的时期 ,第 11 d之后
生长速度明显减缓 ,幼苗生长的第 11 d正是茎由快
速伸长生长转为缓慢生长的转折点。
3　讨论
本文研究表明 ,平邑甜茶种子萌发后幼苗的早
期生长过程中 ,子叶中精氨酸含量和精氨酸酶活性
远远高于根 、茎和叶 ,且随幼苗生长发育逐渐降低。
可见 ,子叶中丰富的精氨酸是幼苗植株形成建成(包
括根系 、茎 、叶片等器官的发生 、分化)所必需的 。种
子开始萌发后 ,贮藏蛋白水解生成大量精氨酸 ,精氨
酸酶催化其生成鸟氨酸和尿素。尿素被尿素酶分解
为二氧化碳和氨 ,后者进一步合成谷氨酰胺 ,再用于
其它含氮化合物的形成 ,鸟氨酸可进一步生成多胺 、
脯氨酸和谷氨酸等[ 3 , 5 ,18] 。
精氨酸在体内的免疫功能和营养生理以及精氨
酸代谢的研究受到广泛重视[ 19] 。在植物上 ,精氨酸
除作为一种重要的氮素贮藏营养外 ,还具有其它氨
基酸不具备的一些特殊生理功能[ 6] 。精氨酸的这些
特殊生理功能可能与精氨酸代谢有关 ,NO即是精氨
酸代谢产物之一。
Beligni和 Lamattina[ 9]曾提出 ,NO类似植物激素
的作用 ,参与植物根 、茎 、叶等器官的生长发育 。精
氨酸是NO产生的供体氨基酸 ,鉴于种子萌发后幼
苗中丰富的精氨酸含量 ,本试验进一步检测了平邑
甜茶种子萌发后幼苗不同器官的 NO及 NOS水平与
各器官生长发育的关系。结果表明 ,平邑甜茶种子
萌发后幼苗生长过程中不同器官 NO 、NOS水平的变
化与各器官的生长发育密切相关。根和茎中 NO 、
NOS 水平在幼苗生长的前期(5～ 11 d)较高 ,与根 、
茎的快速伸长生长相对应。茎中 NO 、NOS在生长的
第 11 d达到最高 ,此时正是茎由快速伸长生长向缓
慢伸长生长转变的时期。Corpas等[ 20]在豌豆幼苗
上也观察到 NOS 与茎伸长相关的现象。本试验还
观察到 ,除播种后第 5 d的子叶外 ,茎的 NO含量在
所有器官中是最高的 ,这可能与 NO 在植物器官中
主要定位于维管组织(木质部)有关[ 20-21] 。根中
NO 、NOS水平在第 8 d达到最高 ,可能与主根的快速
生长有关。已有研究表明 ,NO 是新根(不定根 、侧
根)发生的关键信号分子[ 22-23] 。叶片中 NO 、NOS 在
幼苗生长的第17 d出现一个小高峰 ,与叶片的快速
生长相对应 。Beligni和 Lamattina[ 9]认为 ,NO 作为一
种非传统的植物生长调节物质(植物激素),具有明
7774 期　　　 高华君 ,等:平邑甜茶幼苗生长过程中精氨酸和一氧化氮水平的变化
显的促进叶片生长 、延缓衰老的效果。最近 ,Modolo
等[ 24]研究表明 ,拟南芥内源精氨酸水平降低影响到
NOS活性 ,从而 NO生成减弱 ,也证明 NO 的生成与
精氨酸有关 。考虑到 NO在植物生长发育中的信使
分子作用 ,可以认为精氨酸在种子萌发及幼苗的早
期形态建成过程中可能不只是氨素贮藏营养的作
用 ,其代谢产物之一的 NO很可能参与幼苗的早期
形态建成 。
本研究还看出 ,生长第 5 d的幼苗子叶中具有
极高的NO和 NOS 水平 ,与子叶中极高的精氨酸含
量呈正相关。Caro 和 Puntarulo[ 25] 在大豆上也曾观
察到子叶中大量形成 NO的现象。但子叶中高浓度
NO的生理功能和生成途径尚不清楚 ,NOS可能是其
生成途径之一 ,因为生长第 5 d 的子叶中 NOS 活性
亦很高 ,但很可能还有其他生成途径 ,这有待于进一
步深入研究。除 NO外 ,精氨酸也可用于合成多胺 ,
而多胺也是与植物生长发育有直接关系的生物活性
分子 。萌发的种子及早期幼苗丰富的精氨酸含量为
此类研究提供了一种可行途径 ,如本试验中幼苗生
长第 5 d的子叶中精氨酸 、精氨酸酶 、NO以及 NOS
水平均相当高 , 而子叶也是多胺的产生源之
一[ 26-27] 。可见 ,植物体内丰富的精氨酸并不仅仅作
为贮藏营养 ,精氨酸的代谢转化也不仅仅是作为一
般营养物质利用 ,它还有许多特殊功能有待研究发
掘。
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