全 文 ：［7］ Lam JT，Martin MG，Turk E，et al． Missense mutations in
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［10］曾星，贺毅，周丹．甘草对脾虚证消化道黏膜及细胞保
护的分子药理机制研究进展［J］．时珍国医国药，2010，
21(8) :2030-2031．
收稿日期:2012-11-22
基金项目:青海省自然基金项目(2011-Z-721)
作者简介:范妤(1977-) ，女，硕士，讲师，主要从事肿瘤分子病理学研究;Tel:15706018068，E-mail:fans95950@ sohu. com。
总状绿绒蒿醇提物对 K562 细胞增殖的
影响及其机制研究
范 妤1，范建平2，3，郭东艳1，李 涛1，马晓军1，杜军华2
(1．陕西中医学院，陕西 咸阳 712046;2．青海师范大学，青海 西宁 810008;3．陕西师范大学，陕西 西安 710062)
摘要 目的:研究藏药总状绿绒蒿醇提物对人白血病 K562 细胞增殖的影响，并初步探讨其机制。方法:MTT
法检测总状绿绒蒿醇提物对 K562 细胞增殖的抑制作用;Hoechest 33342 荧光染色观察细胞核形态学改变;流式细
胞术检测凋亡率和线粒体膜电位变化。结果:一定浓度范围内的总状绿绒蒿醇提物对 K562 细胞的增殖有明显抑
制作用(P ＜ 0. 05) ，并呈时间及剂量依赖性;Hoechest 33342 荧光染色及凋亡率检测结果显示总状绿绒蒿醇提物处
理后诱导 K562 细胞发生凋亡;总状绿绒蒿醇提物能明显降低 K562 细胞线粒体膜电位。结论:总状绿绒蒿醇提物
对人白血病 K562 细胞有增殖抑制作用，通过改变线粒体膜电位诱导肿瘤细胞凋亡。
关键词 总状绿绒蒿醇提物;K562 细胞;增殖抑制;细胞凋亡;线粒体膜电位
中图分类号:R285. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2013)07-1143-04
总状绿绒蒿 Meconopsis racemosa Maxim．是罂粟
科绿绒蒿属植物，主要分布于我国西藏、云南、四川、
青海等高海拔省份，在传统藏医药中应用历史悠久，
传统藏医古籍《晶珠本草》记载其具有接骨，提升软
骨功效〔1〕。《中国植物志》记载:总状绿绒蒿西藏用
全草消炎、止骨痛、治头伤、骨折;云南用根入药，治
气虚下陷、浮肿、脱肛、久痢、哮喘;青海以花、茎入
药，治腰痛、腿痛〔2，3〕。作为有较高经济价值的民族
植物，为开发利用其药用价值，近年来对其研究越来
越多，谢鸿妍等〔4〕从中分离、鉴定了 2 个新的异喹
啉类生物碱。郭世民等〔5〕研究其醇提物的体内药
效学发现其具有抗疲劳、止泻、止痛、镇静作用。本
实验通过观察总状绿绒蒿醇提物对人白血病细胞株
K562 细胞增殖的影响，探索其抗肿瘤活性及其作用
机制，为该属植物的应用提供理论基础。
1 材料与仪器
1. 1 细胞株 人慢性髓系白血病细胞株 K562 细
胞，为悬浮生长细胞株。由陕西中医学院基础医学
院形态学实验中心传代保种。
1. 2 药物与试剂 总状绿绒蒿采于 2011 年 8 月下
旬，采集自青海省玉树藏族自治州杂多县境内，海拔
4 232 m。由青海师范大学生命与地理科学学院杜
军华副教授鉴定为总状绿绒蒿 Meconopsis racemosa
Maxim. ;RPMI-1640 细胞培养基(美国 Gibco公司) ;
胎牛血清(兰州民海生物工程有限公司产品) ;胰蛋
白酶、四甲基偶氮唑盐(MTT)、Hoechst33342 均购自
Sigma 公司;细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒、Rho-
damine 123 购自碧云天生物技术研究所。
1. 3 主要仪器 AC2-4E1 生物安全柜(新加坡 ES-
CO公司) ;CB-150 二氧化碳培养箱(德国 Bind 公
司) ;BDS-200 倒置显微镜(重庆奥特光学仪器有限
责任公司) ;MLS-3780 全自动高压灭菌器(日本三
洋公司) ;TS100-F倒置荧光数码显微镜(日本 Nikon
公司) ;ELX808IU全自动酶标仪(美国 Bio-Tek 公司
产品) ;流式细胞仪(美国 BD公司)。
·3411·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 7 期 2013 年 7 月
DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2013.07.037
2 方法
2. 1 总状绿绒蒿醇提物的制备 取总状绿绒蒿全
草干品，粉碎后精密称取 500 g，用 6 倍 95%乙醇 50
℃水浴中浸泡 24 h，超声破碎 1 h;提取 2 次，合并提
取液，抽滤，旋转蒸发仪蒸发浓缩，冷冻干燥，得到黑
褐色浸膏 48. 57 g，得率 9. 714%。实验前用二甲基
亚砜溶解(终浓度小于 0. 05%) ，0. 22 μm滤膜过滤
除菌，分装，－ 20 ℃避光保存。
2. 2 细胞培养 将人慢性髓系白血病 K562 细胞
接种于含 10%灭活胎牛血清的 RPMI-1640 培养基
的细胞培养瓶中，在 37 ℃、5% CO2、相对饱和湿度
的条件下放置培养箱中培养，每 1 ～ 2 d 换液传代 1
次。取对数生长期且生长状态良好的细胞进行试验。
2. 3 MTT 法检测细胞增殖 取对数期生长的
K562 细胞，将细胞浓度调整为 1 × 105 /mL，分别加
入不同浓度(30、60、90、120、150 μg /mL)的总状绿
绒蒿醇提物，轻轻吹打均匀后，接种于 96 孔板，100
μL /孔，同时设空白对照组(加入等体积含 10%胎牛
血清的 RPMI-1640 培养基)每组 4 个复孔，分别培
养 24、48、72 h后，加入 MTT(5 mg /mL)溶液 20 μL /
孔，继续培养 4 h后，每孔加入三联液 100μL终止反
应，37 ℃继续培养 16 ～ 18 h，用酶标仪在 570 nm波
长处检测各孔光密度值 D(λ)值，计算肿瘤细胞生
长抑制率。实验重复 3 次。
生长抑制率(%) [= 1 － D(λ)药物组 － D(λ)对照组D(λ) ]对照组 × 100%
2. 4 Hoechst 33342 染色检测细胞核形态的变化
取对数期生长的的 K562 细胞，以 1 × 105 /mL 的浓
度接种于 6 孔板中，加入不同浓度(60、90、120 μg /
mL)的总状绿绒蒿醇提物后孵育 12 h，收集细胞，冷
PBS洗 2 次，离心后将细胞重悬于 PBS 中，加入 Ho-
chest 33342 荧光染液避光染色 10 min，离心，加 PBS
重悬，涂片，在荧光显微镜下观察细胞核的改变并拍
照。
2. 5 流式细胞术检测凋亡 细胞处理同“2. 4”项，
加药处理 24 h后收集细胞，离心，用 PBS洗 2 次，重
悬后加入 70%冰乙醇 － 20 ℃静置 6 h，离心，用 1%
BSA重悬后离心，用 PBS洗 1 次，重悬后加入 RNase
(终浓度 100 μg /mL) ，37℃避光放置 30 min，加入
PI(终浓度 50 μg /mL) ，37 ℃避光放置 20 min 后用
流式细胞仪检测，计数 5 000 个细胞，检测凋亡率，
重复 3 次。
2. 6 流式细胞仪 Rhodamine 123 染色法检测线粒
体膜电位 细胞处理同“2. 4”项，加药处理 24 h 后
收集细胞，离心，用 PBS重悬细胞后加入 5 μL Rho-
damine 123(25 μg /mL) ，37 ℃避光反应 20 min，离
心，PBS洗 2 次，重悬后进行流式细胞仪检测，计数
3 000 个细胞，测定线粒体膜电位的变化。
2. 7 统计学处理 结果采用 SPSS 13. 0 统计软件
进行单因素方差分析比较组间差异，P ＜ 0. 05 为差
异有统计学意义。
3 结果
3. 1 总状绿绒蒿醇提物对 K562 细胞增殖的影响
不同浓度总状绿绒蒿醇提物作用于 K562 细胞
24、48、72 h后增殖抑制作用如图 1 所示:当 120 μg /
mL总状绿绒蒿醇提物作用 K562 细胞 24 h，其抑制
率为(54. 43 ± 5. 63)%;72 h 达到(86. 7 ± 44. 1)%，
与对照组比较 P ＜ 0. 05，有显著差异，显示总状绿绒
蒿醇提物在体外对白血病 K562 细胞有抑制作用。
在每个时间点，伴随总状绿绒蒿醇提物浓度的增加，
细胞增殖速度减缓，增殖抑制率显著升高，表明总状
绿绒蒿醇提物对人慢性髓系白血病 K562 细胞的生
长有抑制作用，并呈现剂量-效应关系。在同一给药
浓度下，增殖抑制率与作用时间呈正相关，表现出明
显的时间-效应关系。该实验结果显示，总状绿绒蒿
提物对肿瘤细胞生长抑制呈现浓度和时间的依赖
性。见图 1。
图 1 总状绿绒蒿醇提物对 K562 细胞增殖的抑制作用
3. 2 Hoechst 33342 染色检测细胞核形态的变化
Hoechst 33342 荧光染色下，可见空白对照组 K562
细胞核呈圆形或肾形，大小一致，染色质分布均匀、
疏松，发出均匀蓝色荧光;经不同浓度总状绿绒蒿醇
提物处理后，核形态不规则，核内染色质明显缩小，
呈致密浓染的蓝色荧光团块;120 μg /mL 浓度作用
后，核裂解成碎片，染色质聚集，细胞呈明显凋亡形
态。见图 2。
3. 3 流式细胞术检测细胞凋亡率结果 总状绿绒
蒿提物作用于 K562 细胞 24 h后，60 μg /mL时细胞
凋亡率为 2. 55%，90 μg /mL 时细胞凋亡率为
8. 20%，120 μg /mL时细胞凋亡率为 10. 06%，均高
于对照组(P ＜ 0. 05) ，并呈现浓度依赖性。见图 3。
·4411· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 7 期 2013 年 7 月
3. 4 流式细胞术检测线粒体膜电位结果 采用不
同浓度的总状绿绒蒿醇提物处理 K562 细胞 24 h
后，随着给药浓度的增加(60、90、120 μg /mL)细胞
线粒体膜电位逐步下降，下降幅度分别为 5. 16%、
6. 39%、12. 08%，与对照组 0. 49%比较有统计学意
义(P ＜ 0. 05)。表明总状绿绒蒿醇提物能诱导
K562 细胞线粒体膜电位的下降，并呈一定的剂量的
相关性。见图 4。
图 2 Hoechst 33342 染色荧光显微镜下观察总状绿绒蒿醇提物对 K562 细胞核形态的影响
图 3 流式细胞仪检测总状绿绒蒿醇提物对 K562 细胞凋亡的影响
图 4 总状绿绒蒿醇提物对 K562 细胞线粒体膜电位变化的影响
4 讨论
近年来，筛选来源广、毒性低、效果可靠的天然
中草药资源在抗癌药物领域中发挥越来越重要的作
用。绿绒篙属植物资源丰富，其中多种植物作为藏
药一直被广泛使用，极具开发潜力。本实验以人慢
性髓系白血病细胞株 K562 细胞为模型初步探索绿
绒蒿属植物中总状绿绒蒿的体外抗肿瘤作用机制，
为其开发应用提供实验依据。采用 MTT 法检测结
果显示:不同浓度总状绿绒蒿醇提物(30、60、90、
120、150 μg /mL)体外作用于 K562 细胞一定时间
后，表现出明显的生长抑制作用，细胞毒效果显著，
并呈现剂量-效应关系和时间效应关系。表明总状
绿绒蒿醇提物具有体外抗肿瘤活性。
形态学观察显示:60 μg /mL总状绿绒蒿醇提物
作用 K562 细胞 24 h 后出现细胞核形态不规则，呈
现致密浓染的蓝色荧光增强的凋亡细胞;浓度升至
120 μg /mL时，出现核裂解，染色质高度聚集现象，
呈现强蓝色荧光，凋亡细胞增多。流式细胞术检测
凋亡率的结果显示:随给药浓度增加，各药物处理组
(60、90、120 μg /mL)凋亡细胞比率逐渐增加，其结
果与形态学观察结果相一致，表明总状绿绒蒿醇提
物能够诱导 K562 细胞发生凋亡。
凋亡是通过 2 个进化保守的信号转导途径实现
的，即死亡受体途径和线粒体途径。细胞在应激状
态或受到毒物、化疗药物等凋亡诱导信号作用时，线
粒体被破坏，线粒体内外膜间的通透性转运孔
(MPT)开放，引起线粒体膜通透性增加、线粒体肿
胀以及线粒体内膜的跨膜电位下降，将细胞凋亡的
·5411·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 7 期 2013 年 7 月
启动因子细胞色素 C 由受损的线粒体内释放到胞
质中启动内源性凋亡的发生〔6〕。本实验用流式细
胞术检测 Rhodamine 123(25 μg /mL)染色后 K562
细胞线粒体膜电位结果显示:随着给药浓度的增加
细胞线粒体膜电位逐步下降，表明总状绿绒蒿醇提
物能诱导 K562 细胞线粒体损伤，诱发线粒体膜电
位下降，并呈一定的剂量的相关性。一旦线粒体膜
电位下降，细胞将进入凋亡程序，损伤线粒体诱导凋
亡可能是总状绿绒蒿醇提物抑制肿瘤细胞生长的重
要机制。
综上所述，总状绿绒蒿醇提物对人白血病 K562
细胞有增殖抑制作用，能促进凋亡的发生，损伤线粒
体诱导凋亡可能是其作用机制之一。尽管本次实验
研究中证明了总状绿绒蒿醇提物的抗肿瘤活性，但
其抗肿瘤有效成分的分离、筛选，抗肿瘤作用的具体
机制还需进一步深入研究。
参 考 文 献
［1］帝玛尔·丹增彭措．晶珠本草［M］．上海:上海科技出版
社，1986:117-118．
［2］冯志舟．绿绒蒿及其药用价值［J］． 云南林业，2004，25
(5) :24．
［3］王子敏．绿绒蒿属植物化学成分及生物活性的研究进
展［J］．华西药学杂志，2010，25(6) :759-761．
［4］谢鸿妍．滇西北藏药绿绒蒿属(Meconopsis Vig．)植物的
民族植物学研究［M］．昆明:中国科学院昆明植物研究
所，1999．
［5］郭世民，赵远，王曙光． 总状绿绒蒿药效学的初步研究
［J］．云南中医中药杂志，2003，23(1) :25-27．
［6］王卫东，陈正堂． Bcl-2 /Bax 比率与细胞“命运”［J］． 中
国肿瘤生物治疗杂志，2007，8(14) :393-395．
收稿日期:2012-07-17
基金项目:江苏省药学会 －施贵宝医院药学科研项目(JS2012-04) ;江苏省南通市应用研究计划项目(K2008027)
作者简介:窦志华(1966-) ，男，博士，主任中药师，主要从事中药药效物质基础及创新中药研究;Tel:0513-85116027，E-mail:zhihuadou@
163. com。
五味子血清药化学初步研究
窦志华1，罗 琳2，安莉萍3，陈 敏1，缪应祥1，王征宇1
(1．南通大学附属南通第三医院，江苏 南通 226006;2．南通大学，江苏 南通 226001;3．南京中医药大学，江
苏 南京 210046)
摘要 目的:分析五味子含药血清中的药源性成分。方法:大鼠灌胃给予五味子乙醇提取物，采集含药血清，
高效液相法测定其指纹图谱，与相同条件下测定的提取物、对照品及空白血清图谱比较，并参照相关文献，分析大
鼠给药后体内产生的药源性成分并进行鉴定。结果:含药血清中产生药源性成分 13 个，其中 8 个为药材原形成分
入血，5 个为代谢产物，8 个原形成分分别为五味子醇甲、戈米辛 D(或戈米辛 E)、五味子醇乙、五味子酯乙、五味子
甲素、γ-五味子素(戈米辛 N)、五味子乙素和五味子丙素。结论:本研究建立的方法准确、可靠，可用于五味子血清
药化学研究。
关键词 五味子;含药血清;药源性成分;血清药化学
中图分类号:R285. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2013)07-1146-03
中药虽成分众多，但只有那些被消化吸收进入
血液的成分或其代谢产物才有产生药效的可能，中
药药效成分研究应该以给动物或人服用药物后的血
清(即含药血清)为入手点〔1〕。含药血清中的药物
原形成分及代谢产物统称为“血中药源性成分”，与
中药中的化学成分相比，因经过胃肠道的处理、筛
选和滤过，含药血清中药源性成分的种类和数目已
大大减少，这样不仅大大简化了中药复杂体系，而且
对血清中所含化学成分进行进一步分析、鉴定，把得
到的成分与原中药进行药效学比较，就有可能揭示
中药产生药效的成分，甚至可以成为创制新药的基
础。中药血清药物化学主要是研究血清中的化学物
质，观测血清中外源性活性物质及其作用和代谢规
律，是近年来迅速发展起来的研究中药药效物质基
础较为科学的一种方法〔2〕。
五味子为木兰科植物五味子 Schisandra chinen-
sis(Turcz．)Baill． 干燥成熟果实，具有收敛固涩、益
气生津、补肾宁心的功效。现代研究表明，五味子具
有保护肝脏、抗氧化、抗衰老等作用〔3〕。本实验采
用血清药化学方法，对大鼠灌胃五味子乙醇提取物
·6411· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 7 期 2013 年 7 月