全 文 ：分光光度法测定凤仙花中总黄酮的含量
李晓明 ,姜华＊ ,李军 ,时清亮 ,徐幽 ,崔娇娇 ,杨莹莹　(河南科技大学化工与制药学院 ,河南洛阳 471003)
摘要　[目的 ]建立能够准确测定凤仙花中总黄酮含量的方法。 [方法] 分别以芦丁 、山柰酚为对照品 ,可见分光光度法是采用 AlCl3显色 ,在 412nm波长处测定总黄酮的含量;紫外分光光度法在 270nm处测定总黄酮的含量。 [结果 ]以芦丁、山柰酚为对照品采用可见分
光光度法测得总黄酮含量的平均回收率分别为 98.52%、99.72%, RSD分别为 2.38%、3.14%;紫外分光光度法测得总黄酮含量的平均
回收率分别为 97.53%、98.75%, RSD分别为 2.71%、2.86%。 [结论 ]以山柰酚为对照品、采用AlCl3为显色剂的可见分光光度法是一种
较理想的测定凤仙花中总黄酮含量的方法。
关键词　凤仙花;总黄酮;可见分光光度法;紫外分光光度法
中图分类号　O657.3　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)33-16378-02
ContentDeterminationofFlavonoidsinImpatiensbalsaminaL.bySpectrophotometry
LIXiao-mingetal　(ColegeofChemicalEngineeringandPharmaceutics, HenanUniversityofScienceandTechnology, Luoyang, Henan
471003)
Abstract　[ Objective] TheresearchaimedtostudythedeterminationmethodoftotalflavonoidscontentinImpatiensbalsaminaL.byvisible
lightandultravioletspectrophotometry.[ Method] Withrutinandkaempferolasreferencesubstancesrespectively, byusingvisiblelightspec-
trophotometryandAlCl3 aschromogenicreagent, thecontentoftotalflavonoidswasdeterminedatthewavelengthof412nm.Byusingultravio-
letspectrophotometry, thecontentoftotalflavonoidswasdeterminedatthewavelengthof270nm.[ Result] Withrutinandkaempferolasref-
erencesubstancesrespectively, theaveragerecoveriesbyvisiblelightmethodwere98.52% and99.72% , withRSDof2.38%and3.14%
resp.Theaveragerecoveriesbyvisiblelightmethodwere97.53% and98.75%, withRSDof2.71%and2.86%resp.[ Coclution] Byu-
singvisiblelightspectrophotometry, withkaempferolasreferencesubstanceisakindofmoreidealdeterminationmethodoftotalflavonoidsin
ImpatiensbalsaminaL..
Keywords　ImpatiensbalsaminaL.;Totalflavonoids;Visiblelightspectrophotometry;Ultravioletspectrophotometry
基金项目　大学生研究训练计划项目(2008058)。
作者简介　李晓明(1985-),女 ,河南许昌人 , 硕士研究生 ,研究方向:
天然产物研究与新药开发。 ＊通讯作者。
收稿日期　 2009-07-23
　　凤仙花(ImpatiensbalsaminaL.)为凤仙花科 (Balsami-
naceae)中凤仙花属(Impatiens)1年生草本植物 ,味甘苦 ,性
微温 ,具有祛风除湿 、活血止痛 、解毒杀虫之功效 [ 1] 。研究表
明 ,黄酮 、香豆素 、萘醌等为凤仙花的主要活性成分 [ 2] 。目前
文献报道的测定凤仙花中总黄酮含量的方法较少且仅为紫
外分光光度法 [ 3] ,而用可见分光光度法测定凤仙花中总黄酮
含量的方法还未见报道。笔者运用芦丁 、山柰酚 2种不同的
对照品 ,分别采用可见分光光度法与紫外分光光度法测定凤
仙花中总黄酮含量 ,并对不同测量方法进行了比较 ,拟寻找
一种准确而简便的测定凤仙花中总黄酮含量的方法 ,旨在为
进一步合理开发凤仙花提供参考依据。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　供试材料。风仙花干花瓣购自安徽亳州药材市场 ,
经鉴定为凤仙花科植物凤仙花的干燥花瓣。
1.1.2　仪器和试剂。UV-2501型紫外可见分光光度计(日
本岛津);KQ-50DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器
公司)。芦丁标准品购于中国药品生物制品检定所(批号
100080-200707),山柰酚标准品购于中国药品生物制品检定
所(批号 110861-200606)。甲醇 、三氯化铝 、无水乙醇均为分
析纯。
1.2方法
1.2.1　样品制备。先称量 1 g的凤仙花干花瓣 ,溶剂为甲
醇 ,料液比为 1∶20,超声温度为 20℃,超声(功率 50 W,频率
40kHz)30 min,提取 1次 。得到的提取液定容至 25 ml容量
瓶中 ,作为供试品溶液。
1.2.2　可见分光光度法标准曲线的制备。精密称取 120 ℃
干燥至恒重的芦丁对照品 2.1 mg,以甲醇溶解并定容至 5 ml
容量瓶中 ,摇匀 ,即得浓度为 0.42 mg/ml的芦丁对照品溶
液。精密称取 120 ℃干燥至恒重的山柰酚标准品 2.2mg,以
甲醇溶解并定容至 5 ml容量瓶中 ,得浓度为 0.44 mg/ml的
山柰酚标准品溶液 ,再精密吸取该对照品溶液 0.8 ml定容至
25 ml容量瓶中 ,即得浓度为 0.014 1mg/ml的山柰酚对照品
溶液。分别精密量取浓度为 0.42 mg/ml芦丁对照品溶液
0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ml和 0.014 1 mg/ml的山柰酚对
照品溶液 1.0、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 ml于 10 ml容量瓶中 ,
再分别加入 5 ml1%AlCl3溶液 ,摇匀后用甲醇定容 ,以相应
试剂为空白对照 ,其中芦丁标准品显色后于 414 nm处测定
吸光度 ,得回归方程 ,山柰酚标准品显色后于 416 nm处测定
吸光度 ,得回归方程。
1.2.3　紫外分光光度法标准曲线的制备。精密吸取
“1.2.2”项下浓度为 0.42 mg/ml的芦丁标准品溶液 0.1、
0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ml于 10 ml容量瓶中 ,并用甲醇定容
至刻度 ,于 258 nm处测定吸光度 ,得回归方程。另精密吸取
“1.2.2”项下浓度为 0.44mg/ml的山柰酚标准品溶液 0.5ml
定容至 10ml容量瓶中 ,再分别精密吸取浓度为 0.022mg/ml
溶液 1.0、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 ml于 10 ml容量瓶中 ,并用
甲醇定容。于 268 nm处测定吸光度 ,得回归方程。
1.2.4　回收率试验 。精密量取 6份 “1.2.1”项下已知总黄
酮含量的凤仙花样品 ,分别加入一定量的芦丁 、山柰酚对照
品 ,摇匀 ,分别按照 “1.2.2”项下可见分光光度法和 “1.2.3”
项下紫外分光光度法测定吸光度 ,由回归方程计算总黄酮含
量 ,计算回收率:
责任编辑　熊章琴　责任校对　卢瑶安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2009, 37(33):16378-16379
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2009.33.160
回收率(%)=(测得量 -样品已知含量)/加入对照品
量 ×100
1.2.5　样品的总黄酮含量测定。精密吸取 0.1 ml“1.2.1”
项制备的样品至 10ml容量瓶中 ,分别按照 “1.2.2”项下可见
分光光度法和 “1.2.3”项下紫外分光光度法测定吸光度 ,由
回归方程计算样品中总黄酮的含量 。
2　结果与分析
2.1　可见分光光度法回归方程的确定　分别将 “1.2.2”项
下配制好的不同浓度(C)的芦丁 、山柰酚对照品溶液 ,经
AlCl3显色后在 400 ～ 800nm波长范围内进行扫描 ,并在最大
吸收波长处测定吸光度值 A。以芦丁为对照品 ,在 414 nm处
测得吸光度值 ,得回归方程为 A=28.79C-0.045 2, r=
0.998 7,表明芦丁在 0.004 2 ～ 0.025 2 mg/ml的浓度范围内
与吸光度呈良好的线性关系。以山柰酚为对照品 ,在 416 nm
处测得吸光度值 ,得回归方程为 A=79.68C-0.008 6, r=
0.999 1,表明山柰酚在 0.001 4～ 0.007 0mg/ml的浓度范围
内与吸光度呈良好的线性关系。
2.2　紫外分光光度法回归方程的确定　分别将 “1.2.3”项
下配制好的不同浓度(C)的芦丁 、山柰酚对照品溶液在 200
～400 nm波长范围内进行扫描 ,并在最大吸收波长处测定吸
光度值(A)。以芦丁为对照品 ,在 258 nm处测定吸光度值得
回归方程为 A=34.937C+0.005 8, r=0.999 5,表明芦丁在
0.004 2 ～ 0.025 2mg/ml的浓度范围内与吸光度呈良好的线
性关系。以山柰酚为对照品 ,在 268 nm处测定吸光度值得
回归方程为 A=73.436C+0.043 5, r=0.998 8,表明山柰酚
在 0.002 2 ～0.011 0 mg/ ml的浓度范围内与吸光度呈良好
的线性关系。
2.3　加样回收率试验　按照 “1.2.4”项下方法进行回收率
试验 。采用可见分光光度法 ,以芦丁为对照品测总黄酮含量
时 ,加样回收率为 98.52%, RSD为 2.38%;以山柰酚为标准
品时 ,加样回收率为 99.72%, RSD为 3.14%。采用紫外分光
光度法 ,以芦丁为对照品测总黄酮含量时 ,加样回收率为
97.53%, RSD为 2.71%;以山柰酚为标准品时 ,加样回收率
为 98.75%, RSD为 2.86%。
2.4　样品的总黄酮含量测定　采用可见分光光度法时 ,样
品在 412nm处有最大吸收峰:以芦丁为对照品时 ,样品中总
黄酮的平均含量为 33.21 mg/g;以山柰酚为标准品时 ,样品
中总黄酮的平均含量为 10.85 mg/g。采用紫外分光光度法
时 ,样品在 270nm处有最大吸收峰:以芦丁为对照品时 ,样
品中总黄酮的平均含量为 44.01 mg/g;以山柰酚为标准品
时 ,样品中总黄酮的平均含量为 19.66 mg/g。
3　结论与讨论
试验结果表明 ,无论以芦丁还是山柰酚为对照品 ,采用
可见分光光度法和紫外分光光度法测定凤仙花中总黄酮的
含量都有较好的线性关系和回收率 。但是以不同的对照品 ,
采用不同的含量测定方法 ,得到的测定结果差异明显 ,所以
为了正确地评价凤仙花中总黄酮的含量 ,有必要先对其总黄
酮含量测定方法进行对比研究。在对凤仙花中总黄酮含量
进行测定中 ,除了运用可见分光光度法和紫外分光光度法
外 ,还尝试用 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法和浓 HCl-Mg粉法进
行含量测定 ,但前者因山柰酚和样品均不显色 ,后者因存在
色素类成分的干扰 , 2种方法均不能运用到凤仙花总黄酮的
含量测定中。
黄酮类化合物在 200 ～ 400 nm的紫外吸收光谱由 2个
吸收带组成 ,分别出现在 240 ～ 280 nm和 300 ～ 400 nm。试
验中 ,芦丁经紫外光谱扫描在 258 nm和 358 nm处有最大吸
收峰 ,山柰酚经紫外光谱扫描在 268 nm和 368nm处有最大
吸收峰 ,样品经紫外光谱扫描在 270 nm和 367nm处有最大
吸收峰 ,选择 240 ～ 280nm吸收带进行紫外分光光度法的含
量测定 。采用 AlCl3显色后 ,在 400 ～ 800 nm波长范围内进
行测定 ,其中芦丁最大吸收峰在 414nm处 ,山柰酚最大吸收
峰在 416 nm处 ,样品最大吸收峰在 412 nm处。通过对照品
和样品显色前后图谱进行比较可知 ,山柰酚的吸收图谱和样
品较为接近 ,所以山柰酚作为凤仙花中总黄酮含量测定的对
照品较为合适。另有研究表明 [ 4] ,凤仙花中的黄酮类成分多
为山柰酚 、山柰酚糖苷 、槲皮素 、芦丁 、杨梅素和各种花色素
及苷类化合物 ,该类化合物均可与 AlCl3络合采用可见分光
光度法进行含量测定 ,避免了其余化合物在紫外区测定时的
干扰。因此 ,采用 AlCl3显色的可见分光法比紫外分光法专
属性要强。综上所述 ,以山柰酚为对照品 ,采用 AlCl3显色的
可见分光光度法来测定凤仙花中总黄酮含量较为准确合理。
参考文献
[ 1] 田代华.实用中药辞典[ M] .北京:人民卫生出版社, 2002:388-389.
[ 2] 鞠培俊 ,孔德云 ,李晓波.凤仙花化学成分及药理作用研究进展 [ J] .沈
阳药科大学学报 , 2007, 24(5):320-324.
[ 3] 连桂香 ,刘玉芬,李滨.凤仙花中总黄酮的含量测定 [ J].化工时刊,
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[ 4] LINH, ZHAOFP, LIANSC, etal.SeparationofkaempferolsinImpatiensbalsaminaflowersbycapilaryeletrophoresiswithelectrochemicaldetection
[J].JournalofChromatographyA, 2001, 909:297-303.
[ 5] GAOSY.Determinationofthetraceelementcontentsinplantsusinga-
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1637937卷 33期　　　　　　　　　　　　　　　　李晓明等　分光光度法测定凤仙花中总黄酮的含量