全 文 ：蝴蝶兰叶片离体培养中与褐变相关的酶研究
黄象男 , 吕晓辉 , 宿显瑞 , 郭晓慧 , 臧 新＊　(郑州大学生物工程系 ,河南郑州 450001)
摘要　对蝴蝶兰叶片在离体培养中与褐变相关的酶进行了研究 ,结果表明:蝴蝶兰叶片在褐变发生前期 POD和PPO活力都升高 ,褐变发
生后酶活力下降。PAL活力随外植体褐变的增强而逐渐增加。POD同工酶谱分析发现 ,对照组中 POD有 2条弱带。离体培养 3 d时
POD出现 4条酶带 ,酶活性最强。
关键词　蝴蝶兰;酶;褐变;活性
中图分类号　Q943.1　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2007)27-08455-02
Study on the Enzyme Related to Phalaenopsis Leaf-browning in vitro Culture
HUANG Xiangnan et al　(Bioengineering Department , Zhengzhou University ,Zhengzhou ,Henan 450001)
Abstract　The study on the enzyme related to Phalaenopsi leaf-browning in vitro culture was conducted.The result showed that in the early stage of Pha-
laenopsis leaf-browning , the activity of POD and PPOwas increased ,while in the later stage , their activities were declined , respectively.The activity of PAL
was increased as explant turned black.The POD isoenzyme showed twoweak bands of POD appeared in control group.After 3 days culture , there were four
bands of POD appeared and the activity was the highest.
Key words　Phalaenopsis;Enzyme;Browning;Activity
　　蝴蝶兰(Phalaenopsis)是多年生热带单茎性气生兰 ,分株
繁殖系数极低[ 1] 。国内外对其组培过程中出现的褐变问题
的研究报道较少。有研究表明 ,导致褐变的主要原因是过氧
化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)共同氧化酚成醌 ,醌转变
成缩合型鞣质 ,最后形成褐色的聚合体[ 2] 。笔者通过研究蝴
蝶兰叶片在离体培养过程中 , POD 、PPO 和苯丙氨酸解氨酶
(PAL)活力及POD同工酶谱的变化 ,探讨褐变发生机理。
1　材料与方法
1.1　材料　蝴蝶兰无菌苗的叶片。
1.2　方法　将蝴蝶兰叶片的上半部切割成 0.5 cm×0.5 cm
大小 ,接种在MS +5 mg/L 6-BA培养基上 ,叶片近轴部位接
触培养基 , 25 ℃、3 000 lx光照强度 、16 h/d光照的条件下培
养。取蝴蝶兰接种后 3～ 21 d 的外植体 ,进行 POD 、PPO和
PAL活力的测定 ,以蝴蝶兰新鲜叶片为对照。同时对POD同
工酶谱进行分析[ 3] 。
2　结果与分析
2.1　蝴蝶兰外植体褐变过程中 POD活力的变化　叶片在
接种后 6 d周围开始变黑 ,出现了轻微的褐变现象 ,8 d时褐
变现象比较明显。测定表明:叶片在接种 3 d后POD活力达
到最大值(图 1),为对照组的 13倍;第 6天时褐变开始发生 ,
POD活力下降;第 9 天 POD活力略为上升 ,比第 6 天高
22.2%;随后随着培养天数的增加 ,褐变程度不断加深 , POD
活力也逐渐下降。到第 21天时POD活力最低 ,约为第 6天
的 1/4 ,但也为对照组的 2倍。
2.2　蝴蝶兰外植体褐变过程中PPO活力的变化　PPO活力
在接种后的第 3天开始升高且达到最大值 ,为接种前的 6.5
倍(图 2),从第 6天开始 ,PPO活力逐渐下降 ,直到第 18天时
PPO活力较第 15天有所上升 ,之后再次下降 。
2.3　蝴蝶兰外植体褐变过程中PAL活力的变化　对照组中
PAL活力很小 ,几乎检测不到(图 3),叶片接种 3 d后可以检
测到PAL值 ,随着外植体褐变程度的不断加重 , PAL活力也
逐渐增加。到第 12天 PAL活力达到最大 ,为第 6天的2.31
作者简介　黄象男(1968-),女 ,河南郑州人 ,在读硕士 ,实验师 ,从事植
物组织培养的研究。 ＊通讯作者。
收稿日期　2007-05-11
倍;第 15天时略有下降 ,但也高于第 6天的水平;第 18天又
升高 ,第 21天下降 ,但都高于第 6天的 PAL活力。
图1　蝴蝶兰外植体褐变过程中 POD活力的变化
图 2　蝴蝶兰外植体褐变过程中PPO活力的变化
2.4　蝴蝶兰叶片在褐变过程中 POD同工酶的变化　在对
照样品POD中有两条微弱带出现 , POD活性较低 ,迁移率为
0.313和 0.388(图 4 ,谱带Ⅲ和Ⅳ);培养 3 d的外植体出现 4条
活性相对强的谱带(谱带Ⅰ～ Ⅳ),从上到下迁移率分别为0.2 ,
0.263 ,0.338和 0.413 ,迁移率为 0.338和 0.413的酶带活性较
高。培养 6 ～ 18 d 的同工酶谱都有 2条酶带出现(谱带Ⅲ、
Ⅳ)。第 21天酶活性降低 ,只有 1条隐约可见的酶带出现(谱
带Ⅲ),迁移率为 0.338。
3　结论与讨论
3.1　PPO 、POD和PAL活性分析　PPO是一种含有铜原子
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2007 , 35(27):8455-8456　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　罗芸　责任校对　李洪
的酶 ,活性较高 ,与多种植物代谢过程有关 。它存在于质体
中 ,但它的酚作用底物却位于液泡中 ,这种区域性分布使底
物与PPO不能接触[ 4] 。PPO介导的褐变反应只发生在细胞
膜的结构发生变化或受到损伤之后。
图 3　蝴蝶兰外植体褐变过程中 PAL活力的变化
　注:泳道 1～ 8分别为 1.对照;2.培养 3 d的外植体;3.培养 6 d的
外植体;4.培养 9 d的外植体 ;5.培养 12 d的外植体;6.培养
15d的外植体;7.培养 18 d的外植体;8.培养 21 d的外植体。
图 4　蝴蝶兰叶片褐变过程中 POD同工酶谱的变化
试验结果表明 ,PPO和POD活力的变化与蝴蝶兰外植体
褐变发生有一定的关系。在褐变发生前(培养 3～ 6 d), PPO
和POD的活力开始升高;褐变发生后 ,PPO的活力下降 ,POD
的活力在第 6天下降 ,第 9天升高 ,然后又下降。PPO和POD
活力的变化说明了在蝴蝶兰外植体褐变过程中这 2种酶参
与了褐变的开始。Murata等[ 5] 利用抗卡那霉素的根癌农杆
菌对苹果进行转基因时发现 ,含有反义PPO DNA的转基因苹
果根抑制了 PPO活性 ,与正常的苹果相比表现出较低的褐变
程度。Graham等[ 6]采用 PPO基因沉默抑制了 PPO活性 ,从
而有效控制了采摘后菠萝的褐化。Bachem等[ 7] 利用适宜的
启动子去表达反义PPO RNA ,显著地抑制了马铃薯块茎上黑
色素的形成 ,降低了马铃薯块茎被碰伤后所发生的褐变
现象。
由机械损伤所诱导的植物褐变长久来一直被认为与
PPO活性呈正相关[ 8] 。然而 ,Elia等[ 9]在研究PPO活性和木
质素含量对凉薯褐变的影响时发现 , PPO活性和褐变指数呈
现出较低的相关性 ,指出 PPO很可能并不直接参与褐变过
程。罗晓芳等[ 10] 也在实验中发现 ,褐变现象较严重的材料
阿月浑子的PPO活性最低 ,而不褐变的苹果枣PPO活性却相
当高 ,说明PPO活性与组织培养材料的褐变不呈正相关 ,酶
活性的高低不是判断褐变是否严重的充分条件。在该试验
中 ,蝴蝶兰叶片PPO活性在褐变发生前增加 ,褐变发生后降
低 ,且褐变程度随着 PPO活性的降低而加深 ,与罗晓芳等报
道的结果相一致。出现这种现象可能是由于褐变的毒害使
材料的生活力下降 ,从而导致酶活力下降。
PAL是植物次生代谢中的关键酶之一 ,在蝴蝶兰外植体
褐变过程中 ,随着培养时间的增加 , PAL活力逐渐上升 ,褐变
程度越来越严重 , PAL活力变化基本上与褐变程度保持一
致。PAL是酚类合成的关键酶 ,抑制PAL活性可以抑制酚类
的积累和合成 ,降低器官褐变的发生。Peiser等[ 11]使用 PAL
抑制剂AOA(氨基氧基乙酸)处理莴苣 ,有效地抑制了莴苣的
褐变。Wang[ 12]等在红豆杉细胞培养中通过 NO 抑制了 PAL
活性 ,减轻了培养过程中的褐变现象。
3.2　蝴蝶兰叶片褐变过程中 PPO 、POD和 PAL之间的关系
　植物组织培养过程中的褐变是由多种因素综合作用的结
果。试验中 ,PPO活性在褐变发生前增加 ,褐变发生后降低 ,
且与褐变程度呈负相关;POD活性的变化较大 ,第 3 天活性
即为对照的 13倍;PAL活性在试验中基本呈上升趋势 ,且褐
变程度随培养天数增加而增加 。说明 PPO和POD参与了褐
变的开始 ,而PAL却是褐变发生后的关键酶。罗晓芳[ 10] 认
为 ,单一的 PPO活性和总酚含量并不能说明褐变的机理 ,形
成酚和酶区域化分布的膜系统是褐变发生的关键因素。
3.3　蝴蝶兰叶片在褐变过程中 POD同工酶分析　从 POD
同工酶谱可以看到在新鲜叶片中活力很低 ,当发生褐变后
POD酶带有所增加 ,这有可能是由于环境的变化而在外植体
内重新合成。当蝴蝶兰叶片从母体上切割下来接种到培养
基中 ,环境的改变导致细胞从机制上产生反应 ,引起一系列
酶和蛋白质合成发生变化 ,以适应环境的变化。木质素是植
物体内具有防御功能的酚类聚合体 ,POD是植物体内木质素
合成的相关酶 ,因此若POD的合成增加 ,酶的活性增强 。外
植体褐变后 ,由于细胞膜的完整性被破坏 ,细胞被褐变产生
的物质毒害 ,外植体的生活力下降 ,酶的活力也随之下降。
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