全 文 ：收稿日期:2013-04-22 修改日期:2013-09-05
基金项目:中国科学院知识创新工程重要方向项目(KSCX2-EW-J-
26)
* 通讯作者 Tel:86-971-6132750;E-mail:hufz@ nwipb． ac． cn
天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2014，26:1715-1718
文章编号:1001-6880(2014)10-1715-04
响应面法优化康定鼠尾草中迷迭香酸提取工艺
迟晓峰，董 琦，胡风祖*
中国科学院西北高原生物研究所 中国科学院藏药研究重点实验室，西宁 810008
摘 要:利用单因素实验和响应面法优化康定鼠尾草中迷迭香酸提取工艺。采用高效液相色谱法测定迷迭香
酸含量，以提取率为参考指标。通过单因素实验筛选出料液比、提取时间和乙醇浓度三个主要因素，通过 Box-
Behnken设计方案，建立迷迭香酸提取得率的二次回归方程，得到优化组合条件。最佳提取条件为乙醇浓度
40%，液固比 15∶ 1，提取时间 50 min。最佳提取条件下，迷迭香酸提取得率为 12． 30 mg /g。优化得到的康定鼠
尾草中迷迭香酸的提取工艺合理，操作可行，质量稳定。
关键词:康定鼠尾草;迷迭香酸;响应面法
中图分类号:Ｒ915 文献标识码:A
Optimization of Extraction Technology for Ｒosmarinic Acid from
Salvia prattii Hemsl． by Ｒesponse Surface Analysis
CHI Xiao-feng，DONG Qi，HU Feng-zu*
Key Laboratory of Tibetan Drug Ｒesearch，the Chinese Academy of Sciences Northwest Institute of Plateau
Biology of Chinese Academy of Sciences，Xining 810008，China
Abstract:The extraction technology for rosmarinic acid from Salvia prattii Hemsl． was optimized by single factor tests
and response surface analysis． The content of rosmarinic acid was determined by HPLC and the extraction yield of rosma-
rinic acid was used as the investigation index． In order to obtain the maximum of extraction yield of rosmarinic acid，three
main factors including ratio of solid to liquid，extraction time and concentration of ethanol were selected through single
factor tests and further optimized using response surface analysis with Box-Behnken design． As a result，a quadric regres-
sion equation for predicting the yield of rosmarinic acid was established． The optimal extraction conditions were deter-
mined to be:1∶ 15 as ratio of solid to liquid，40% of alcohol as extraction solvent and extract for 50 min． Under these
conditions，the extraction yield of rosmarinic acid was 12． 30 mg /g． The optimal extraction condition was proved to be
stable and feasible for the extraction of rosmarinic acid from S． prattii．
Key words:Salvia prattii Hemsl．;rosmarinic acid;response surface analysis
康定鼠尾草(Salvia prattii Hemsl．)为唇形科鼠
尾草属植物，产四川西部、西北部、青海省南部;分布
于海拔 3750 ～ 4000 m 的山坡草地上［1］。迷迭香酸
(rosmarinic acid，Ｒos A 分子式 C18 H16 O8)是由一份
子咖啡酸和一分子 3，4-二羟基苯基乳酸(即丹参
素)的缩合物，为有活性的水溶性的多酚类化合物。
迷迭香酸具极强的清除体内自由基的活性和抗氧化
作用［2］;抗血栓作用［3］;以及抑制 HIV-1 逆转录酶
的活性［4］。初步实验发现，康定鼠尾草中迷迭香酸
含量较高，有较大开发利用价值，因此，本实验采用
响应面分析法对主要因素进行优化，确定较优的提
取工艺方法，为大批量生产提供科学的参考依据。
1 材料与方法
1． 1 材料、试剂与仪器
康定鼠尾草根采自青海省玉树自治州，经中国
科学院西北高原生物研究所陈世龙研究员鉴定为唇
形科植物康定鼠尾草(Salvia prattii Hemsl．)。迷迭
香酸对照品由上海同田生物技术有限公司提供，甲
醇为色谱纯和优级纯，H3PO4、无水乙醇，均为分析
纯。
美国 Waters 515 型高效液相色谱仪:二元梯度
泵，Waters 2996 紫外检测器，EMPOWEＲ 色谱工作
站;KQ-100E型超声波清洗器(昆山超声仪器科技
有限公司) ;MOLELEMENT 元素型超纯水机(上海
摩勒生物科技有限公司)。
1． 2 迷迭香酸的测定
1． 2． 1 标准溶液的配制
准确称取迷迭香酸标准品 2． 29 mg，用甲醇溶
解，定容于 10 mL 的容量瓶，其质量浓度为 0. 229
mg /mL。
1． 2． 2 色谱条件
LiChrospher Cl8柱(4． 6 mm × 250 mm i． d．，5
μm) ;流动相:甲醇:水(0． 1% H3PO4)= 40 ∶ 60;紫
外检测波长:330 nm;流速:1 mL /min;进样量:10
μL，柱温:30 ℃。
1． 2． 3 样品测定
分别制备不同的康定鼠尾草供试品，精密吸取
10 μL 注入液相色谱仪，测定样品中迷迭香酸的含
量，样品和对照品的 HPLC色谱图见图 1。
0.06
0.04
0.02
0
AU
0.04
0.02
0
AU
5 10% 15% 20% 25
5 10% 15% 20% 25
1
1
A
B
min
min
图 1 样品与对照品色谱图
Fig. 1 HPLC chromatograms of reference substance and
samples
A:对照品(reference substance) ;B:康定鼠尾草(S． prattii) ;1:迷
迭香酸(rosmarinic acid)
1． 3 单因素实验
在进行响应面分析之前，先通过单因素实验选
出对康定鼠尾草中迷迭香酸提取得率具有显著影响
的因素，并确定其实验水平。本文考察不同乙醇浓
度、液料比、提取时间和提取次数对康定鼠尾草中迷
迭香酸提取得率的影响。
2 结果与讨论
2． 1 迷迭香酸测定方法学考察
2． 1． 1 精密度实验
准确吸取混合标准溶液 10 μL 重复进样 5 次，
测得各标准峰面积，计算 ＲSD 值为:0． 93%。实验
表明，在该条件下精密度良好。
2． 1． 2 重现性实验
精密吸取同一批样品溶液，进样 6 次，测定样品
中迷迭香酸的量。测得各峰面积，计算 ＲSD 值为:
1． 19%。实验表明，迷迭香酸的测定结果重现性良
好。
2． 1． 3 稳定性实验
取同一批供试品溶液，按含量测定法分别在 0、
4、8、12、24 h进样，测定样品中迷迭香酸的含量。测
定各目的峰面积，计算 ＲSD 为:0． 87%。实验表明，
供试品溶液 24 h内稳定性良好。
2． 1． 4 回收率实验
准确称取 0． 500 g的样品 9 份，取 1． 2． 1 述标准
溶液依次加 50、100、150 μL 于每 3 份样品中，按样
品的测定方法提取及测定。以 9 次测定的平均值计
算回收率分别为:100． 3%，ＲSD为 1． 9%。
2． 2 单因素实验结果
2． 2． 1 乙醇浓度对迷迭香酸提取得率的影响
设定液料比 15∶ 1、超声 60 min、温度 20 ℃、提
取次数为两次的条件下，不同乙醇浓度对迷迭香酸
得率的影响。结果表明随着乙醇浓度的提高，迷迭
香酸得率呈上升趋势，当乙醇浓度达到 40%时迷迭
香酸得率最大，之后随着浓度的增加，得率反而降
低。因此选择 40%左右乙醇浓度作为较佳的提取
溶剂。
2． 2． 2 液料比对迷迭香酸提取得率的影响
设定乙醇浓度 40%、超声 60 min、温度 20 ℃、
提取次数为两次的条件下，不同液料比对迷迭香酸
得率的影响。结果表明，迷迭香酸得率随着溶剂量
的增加而增加，这是由于溶剂用量增加，药材与溶剂
接触面增加，有利于扩散速度的提高。在液料比达
到 15∶ 1 后，迷迭香酸含量提取得率基本保持不变。
由此确定迷迭香酸提取的液料比以 15∶ 1 为宜。
2． 2． 3 提取时间对迷迭香酸提取得率的影响
设定乙醇浓度 40%、液料比 15∶ 1、温度 20 ℃、
提取次数为两次的条件下，不同超声时间对迷迭香
酸得率的影响。结果表明，超声 10 ～ 50 min 内迷迭
香酸得率呈上升趋势，然后随时间的延长含量基本
不变。由 Fick 扩散定律可知得率与提取时间呈正
比，在一定条件下，超声时间越长得率越高;但时间
太长会使扩散次数降低，反而影响迷迭香酸的得率，
因此，本实验选择超声时间为 50 min。
2． 2． 4 提取次数对迷迭香酸提取得率的影响
设定乙醇浓度 40%、液料比为 15 ∶ 1、超声 60
min、温度 20 ℃的条件下，不同提取次数对迷迭香酸
得率的影响。结果表明，提取两次后，迷迭香酸含量
6171 天然产物研究与开发 Vol. 26
提取得率基本保持不变。由此确定迷迭香酸提取的
次数以两次为宜。
2． 3 响应面实验及其结果
2． 3． 1 响应面方案设计
根据单因素初筛试验结果，分别确定乙醇浓度、
液料比、提取时间为因素，每个因素三个水平进行实
验，因素水平表见表 1。
表 1 Box-Behnken因素及水平安排表
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design
水平
Level
X1 /料液比
Solid to
liquid ratio
X2 /提取时间
Extraction
time
X3 /乙醇浓度
Ethanol
concentration
-1 10 40 20
0 15 50 40
1 20 60 60
2． 3． 2 响应面分析结果
取康定鼠尾草干燥根，精密称定，由 Box-Be-
hnken 设计方案所得的试验条件进行试验，实验结
果见表 2。
采用 Design-Expert7． 0 软件对表 2 结果进行响
应面回归分析，得拟合方程 Y = -77． 77817 +
0. 75745 × X1 + 0． 38609 × X2 + 1． 49770 × X3-
0. 00075875 × X1 × X2 + 0． 0008375 × X1 × X3-
0. 0016125 × X2 × X3-0． 00777042 × X12-0． 00122385
× X22-0． 094698 × X32，对该方程的回归分析和方
差如表 3 所示。
由表 3 可以看出，方程的因变量和自变量之间
线性关系明显，该模型和失拟项均显著，并且该模型
的 Ｒ2 = 0． 9897，表明该二次回归得到的迷迭香酸提
取率模型与实际拟合较好，符合度为 98． 97%，表明
使用该方程模拟实际的三因素三水平的分析是可行
的。同时由 F值得大小可以推断，在所选择的实验
范围内，3 个因素对迷迭香酸提取率影响的排列顺
序为:乙醇浓度(X3)＞ 提取时间(X2)＞ 料液比
(X1)
表 2 Box-Behnken设计方案及响应值
Table 2 Box-Behnken design and response values
编号
No．
X1 X2 X3
迷迭香酸提取率
Extraction yield of
rosmarinic acid (mg /g)
1 -1 -1 0 12． 30
2 -1 1 0 4． 80
3 1 -1 0 4． 36
4 1 1 0 9． 35
5 0 -1 -1 12． 27
6 0 -1 1 9． 99
7 0 1 -1 11． 36
8 0 1 1 9． 87
9 -1 0 -1 9． 24
10 1 0 -1 10． 81
11 -1 0 1 4． 78
12 1 0 1 10． 04
13 0 0 0 11． 38
14 0 0 0 10． 71
15 0 0 0 4． 63
表 3 回归方程方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression equation
参数
Parameter
自由度
df
平方和
SS
均方
MS
F值
F value
P值(Prob ＞ F)
P value
X1 1 6． 133 11． 133 87． 908 0． 0018
X2 1 7． 021 7． 021 70． 906 0． 0037
X3 1 16． 035 6． 035 90． 446 0． 0003
X1 * X2 1 4． 971 6． 971 108． 103 0． 0022
X1 * X3 1 7． 557 6． 557 62． 310 0． 0018
X2 * X3 1 8． 914 8． 914 76． 619 0． 0059
X21 1 7． 746 7． 746 71． 873 0． 0053
X22 1 10． 210 12． 210 96． 103 0． 0025
X23 1 19． 543 12． 543 72． 124 0． 0005
Model 9 79． 693 8． 47 74． 477 0． 0070
Lack of fit 3 0． 162 0． 018 0． 12 0． 9024
Pure error 4 1． 656 0． 44
Cor． Total 16 86． 249
Ｒ2 0． 9897
5.4
4.975
4.55
4.125
3.7
60
55 50 45 40 10.012.5
20.0
17.515.0
A:时间（min） B：料液比
迷
迭
香
酸
含
量（
m
g/
g）
图 2 时间和料液比对迷迭香酸得率的影响
Fig. 2 Ｒesponse surface plot showing the effects of extrac-
tion time and solid-liquid ratio on extraction yield of
rosmarinic acid
7171Vol. 26 迟晓峰等:响应面法优化康定鼠尾草中迷迭香酸提取工艺
12.7
10.45
8.2
5.95
3.7
50 45 40
40 45
605550
C:乙酸浓度（%） A：时间（min）
迷
迭
香
酸
含
量（
m
g/
g）
35 30
图 3 时间和乙醇浓度对迷迭香酸得率的影响
Fig. 3 Ｒesponse surface plot showing the effects of extrac-
tion time and ethanol concentraion on extraction yield
of rosmarinic acid
12.4
10.245
8.45
6.475
4.5
50 45 40
C:乙酸浓度（%）
迷
迭
香
酸
含
量（
m
g/
g）
35 30 10.012.5
20.0
17.515.0
B：料液比
图 4 料液比和乙醇浓度对迷迭香酸得率的影响
Fig. 4 Ｒesponse surface plot showing the effects of solid-liq-
uid ratio and ethanol concentration on extraction yield
of rosmarinic acid
响应面图形是响应值对各因素(X1、X2、X3)所
构成的三维空间的曲面图，从图 2 ～ 4 上可形象地看
出各因素交互作用对响应值的影响。比较图 2 ～ 4
可知，乙醇浓度数对迷迭香酸得率的影响最为显著，
表现为曲线较陡，乙醇浓度最佳值在 40%左右;而
时间和料液比次之，表现为曲线较为平滑，其最佳响
应值分别在 50 min和 15∶ 1 左右。
2． 4 最优条件的确定
通过回归模型预测的迷迭香酸提取的最佳工艺
条件为:乙醇浓度 38． 44%，液固比 15． 56 ∶ 1，时间
50． 57 min，在此条件下，迷迭香酸理论上可达 12. 37
mg /g。
考虑到实际操作的可行性，将迷迭香酸的提取
条件在回归方程得到的理论值基础上修正为 ∶ 乙醇
浓度 40%，液固比 15∶ 1，提取时间 50 min。
3 结论
本实验以康定鼠尾草根为原料，对迷迭香酸进
行了超声提取工艺的研究。采用响应面分析法对乙
醇浓度、液固比、超声时间进行优化，确定提取溶液
为 40%乙醇、液固比 15∶ 1、提取 50 min，在此条件下
迷迭香酸提取效果最佳，迷迭香酸得率可达 12. 30
mg /g。通过该提取工艺的研究，为工业生产迷迭香
酸提取物提供科学的参考依据。
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