全 文 ：第 4 2卷 第 4 期
2 9 91 年 1 2月
实 验 生 物 学 报 V o l。 4 2, N o 。 4
A e ta B i o l o g i a e E x P e r im e n t a li s 5 1吐 e a D e e e m b e r 1 9 9 1
峨参原生质体的体细胞胚同步化发生及植株再生
夏光敏 李忠谊 于家驹 郭光沁 陈惠民
(山东大学生物系 、 济南 , 2 5 0 1 0 0 )
峨参 ( A n t人r i e u s s夕I v e s t r i s )是伞形于11植物 ,
作药用 。 其原生质体培养工作国内外尚未见记
载 。 本文报道峨参原生质体再生的细胞团直接
发育成体细胞胚 , 并且体细胞胚发生高度同步
化 , 提出了一个良好的休细胞发生高度同步化
的实验系统及方法 , 无论在理论上或在人工种
子等应用研究中都可以充分加 以利用 。
材 料 和 方 法
25 0 m g / L
, 水解 酪 蛋自 20 m g/ L ,葡萄糖 9 0 。。。 m g /
L
, 蔗和r z 0 0 0 o m g / L , 2 , 4一 D l m g / L , _ I之米素 o . s m g /
L
, 惊胎钻 0 . 3 % , p H S . 8 。 培养 ’ l了10 少: 统 计 分裂频
冲互, 然 ) l亏进行 )J111夜, 每川1 o . s m l , 振荡 ` 6 o r / m i n )培
养 , J甲 l亏缸 10 少: 加液一次 。 两个月左 右将细胞 lj1 分
别转移至 囚体及液体 分 化 培养 丛中 , 坟成分囚体为
M S 附 )J fl丈竹;糖 3 0 9 / L , 场:脂 7 5 /` L , 尤激素或: 1之米素
o一 m g / L 。 液 1’ J:士击养基除无巧:月行夕卜, 余同 。 毛诊 2 0天
( 卜勺体 )及 10 大 (液休 ) 继代一次 , 观察 沐 细胞胚及再
生小植株的生长发育 。
一 、 愈伤组织的诱导和选择
取峨琴的新鲜茎节 , 灭菌后 叨成 l一 2 m m 厚的薄
片 , 在禽 2 m s / L Z , 魂一D 的 M S “ ] 卜份]体培养丛土诱导
愈伤组织 。 以后 了i: 2 , l一 D 降为 2 m g / L 的 M S 培 养丛
上继代培养 , 每 即 天转代一次 。 3 个月以后 , 在原来
白色松软的愈伤组织 仁冉长出鲜黄 色颗粒状的愈伤组
织 。 在无激素的分化培养丛上 , 前者不能分化 , 后者
能发生体细胞胚 。 选取这种胚性愈伤组织作为制备原
生质休的材料。
二 、 耳生质体的分离和培养
取以上在 l m g / L Z , 4一 D 上继代 7 一 10 人的胚性
愈伤组织置于酶液中 , 酶液内含 1 . 5% 纤维素酶 o n 。 -
z uk a R一 1 0
,
0
.
5 %果胶酶 M a e e r o z y m e R一 1 0 , 0 . 5 %
蜗牛酶 (中科 院生物物理 所 ) , 5 m m o l / L C a c l: ,
0
.
6
mo l/ L 甘露醇 , 。 . 3 %葡聚糖硫酸钾 , p H 5 . 8 。 酶
混合液放在 25 ℃ 、 6 0 r/ m in 往复式摇床上 3 一 4小时 ,
然后用 3 0 0 目不锈钢丝网过滤 , 离心收集原生质体 。
原生质 f本用含 5 m m o l / L C a C I: + 0 . 6 m o l / L 甘露醇的
洗液洗两次 , 原生质体培养液洗一次 。 将已洗涤好的
原生质体以 2一 s x l o s/ m l 的密度 培 养 于直径 3 . s c m
的培养皿中 , 每了I几 0 . 5 m l。 基本培养基为 M S , 附加
天冬氨酸 20 m g/ L , 谷氨 酸胺 10 o m g / L , 抗 坏 血 酸
2 0 m g / L
, 甘氛酸 2 0 m g / L , 核 糖 2 5 0 m g / L , 木糖
结 果
一 、 原生质体的游离及培养
原生质体游离 4 小时后 得 率 为 吮 . 5 x 1 0丫
g , 蜗牛酶的存在是必要的 , 无 蜗牛酶 得率约
少一半 。 新分离的原生质体大小较均匀 , 颗粒
状 内含物较多 (图 1 ) 。 培 养 第 3 天 开 始分裂
(图 2 ) , 第 1 0天分裂 频 率 为 40 一 50 % ( 3 次
重复 ) ; 琼脂糖浓度降低显著不利」: 分裂 (琼脂
糖浓度为 0 . 1% , 分裂频率 达 7 一 15 % ; 无琼
脂糖则分裂只有 l 一 5 % ) 。 A A[ “ ’ 及 K M S P 〔“ ]
培养基在同样的条件下分裂频率各为 5 一 10 %
及 10 一 15 % , 均显著低于改 良的 M S , 「I丁能改
良 M S 的总氮或还原氮都较高是原因之一 。
培养第 1个月中 , 添加原来的培养液 。 30 天
时细胞团生长至含十几至几十个细 胞 ( 图 3 ) ,
此时密度可大于 1 0` /m b 如培养时不加振荡 ,
密度仅为 1护 /m l , 且体积较小 。 30 天后 细 BJ
,`
木文 19 9 0 年 z ( ) ) J 2 9 1 1收 到 。 1 9引 午 6月 7 日
按受 。
夏光敏 李忠谊 于家驹 郭光沁 陈惠民 2 4卷
团移入含 0.s mg /Z L, 4一D , 碳 源 只含 30 9 / L
蔗塘的 M S 培养基中振荡培养 , 细胞团继续增
殖 , 同时内部多在 中央开 始 变致密 。 60 天前
后把已大量增殖的 细胞团 移入含 o . l m g / L 玉
米素的 M S 固体培养基上 , 进行分化 。
二 、 休细胞胚的分化 、 发育及植株再生
在上述分化培养基上 , 最初两星期细胞团
仍在增殖 , 以后明显变慢 , 并逐渐由白色转变
为鲜黄色的胚性愈伤组织 , 并十分疏松 , 如放
其在水中便即分散为细胞团 。 它们在培养丛上
可发育为球形胚 (图 9 、 10 ) , 其中多数发育同
步 , 并进一步 发育为 子 叶胚 (图 n 、 12) , 最
后形成完整植株 (图 1 3 ) 。
三 、 体细脸胚发生的同步化
为了便于观察体细胞胚发生的同步化 , 将
细胞团转移至固体培养基上的同时 , 其中一部
分转移至液体分化培养墓中。 细胞 团 在 继 代
1 一 2 次后增殖减慢 , 不管是较大的老细胞团
还是较小的新增殖的细胞团 , 内部 都 变 得致
密 , 致密部分进一步变圆并扩大 , 最后扩展到
边缘 , 使整个细胞团成为单个 的 球形原胚 (图
4
、
5 )
, 但也有极少数多 聚胚 的 发生 。 10 0天
时统计 , 有 90 % 以 上的培 养 物为 球 形 胚 (图
6 )
, 除去 2 , 4一 D , 对球形胚的形成是必要的 ;
如含有 0 . s m g / L Z , 4一 D 的 M S 液 体培养基中
长期继代的细胞团则不能发育为球形胚 , 但仍
可保持胚性 , 当转入无激 素 或含 0 . 1 m s/ L 玉
米素的 M s 培养基中仍能在短时间内高度同步
化地形成球形胚 。 球形胚形成后 10 一 15 天 , 有
7 0%以上的球形胚同步发育为心形胚 (图 了 ) ,
以后再发育为鱼雷胚及子叶胚 (图 8 ) 。 如果将
球形胚直接转移到固体 培养 基 上 , 20 天后形
成子叶胚的同步 率 可 达 50 % 以上 。 各阶段的
体细胞均可在固体培养基上发育为幼苗 。
讨 论
体细 胞胚发生的同步化无论在胚胎发育的
理论研究以及人工种子等应用研究中均具有重
要意义 。 但同步化方法还未得到完满的解决 。
w ar er n 等 [` ] 利用通过一定大小玻 璃珠柱的方
法来分离不同发育阶段的体细胞胚 。 F uj i m ur a
等 【” ]把含不同阶段体细胞胚先后经过过筛 、 密
度离心及慢速 离心 等手 续 , 最终获得 90 %的
球形胚 。 朱激等 l。 ] 利用植物 胚 性细 胞团分选
仪来进行分选 。 以上物理方法虽然效果较好 ,
但要经过复杂的步骤 , 并且都是应用在胡萝 卜
悬浮细胞上 。 S e h e i b n e r 等 [ ’ l 曾利 J干」培芥垄 、激
素 、 密度等综合因素来控制毛地黄体细胞胚发
生的同步化 , 也获得较好结果 。 本文工作则利
用原生质体培养得到同步率高而且数量多的体
细胞胚 。
峨参原生质体培养后可获高频率体细胞胚
发生及同步化 , 可能与下述因素有关 :
1
. 峨参本身具有较高的 体 细胞胚发生的
潜能 , 这一点可 见 于 原 生质体再生植株的表
现 , 它们在无激素培养基上再生后的初期 , 无
论在根 、 胚轴或叶的表面上都很易直接再长出
胚来 (图 14 ) 。 此外 , 峨参的愈伤 组 织 即使在
有 2 m g / L Z , 4一 D 的培养 基 上继 代 8 个月以
上 , 仍然具有和原来相近的分化能力 。
2
. 原生质体的培养过程可 能包 含有体细
胞胚诱导的因素 , 因为原生质休是存活在一个
渗透浓度相对较高的环境中 。 根据前人在多种
植物 ( 包括胡萝 卜、 大豆 、 向日葵 、 黄瓜 、 小麦
等等 l) 3 1 , 以及我们在小麦 `。 ’ 、 甜菜 〔 ` 。 ’ 的 实验
结果 , 培养基中高的渗透浓度能够促进体细胞
胚的发生 。 峨参原生质体在开始一个月的培养
中 , 一直维持在渗透压比较高 的培养 液中 (添
液时仍用原来的培养液 ) , 所 以体细胞胚的 大
量发生可能与此有关。
原生质体培养不仅具有以上效应 , 还可能
有对原生质体进行筛选的作川 。 愈伤组织通常
是一个性质或多或少不 同的细胞的聚集体 , 当
这些细胞受到游离的冲击 , 以及后来培养在一
个与原来差异很大的环境中时 , 必然有一部分
原生质体适应不了这种剧烈的变化而死亡 , 或
者再生的细胞不能正常或持续的分裂 。 经过这
样的淘汰过程 , 余下的细胞就会比在愈伤组织
4 期 峨 参原生质体的体细胞胚同步化发生及植株 }手少生
时在性质上较为一致 , 因而它们在形态发生上
同步化的可能性也会比原来高。 我们 曾直接用
制备原生质体的愈伤组织 来诱 导 分 化体细胞
胚 , 在无激素的 M S 培养丛上 40 天时 , 球 形
胚形成的频率约为 15 % (将愈伤组织 分散后 ,
计算球形胚 /细胞团 十胚性细 `胞 团 十 各时期体
细胞胚的百分率 ) 。 延长分化时 间 , 球 形胚数
目级丫f 提高 , 但许多细胞团并不向前发白 , 而
是分裂产生新的细胞团 , 整个愈伤组织表面仅
有较少体细胞胚发生 , 不能获得同步化 。
综合上述 , 我们认为通过适 合条件下的原
生质体培养 , 可能是获得体细胞胚同步发生的
途径之一 , 值得继续加以探讨 。 另外 , 从本工
作可见峨参原生质体确实是体细胞胚发生同步
化的一个良好实验系统 , 可以充分利用在理论
及应用研究 上 。
关妞词 : 峨今 原生质 体培养 体细饱胚发生同
步化 植株再生
参 考 文 献
摘 要
川峨 参茎节来源的胚 性 愈伤 组 织 , 在 含
1
.
5% 纤维素酶 o n o z u k a R一 1 0 + 0 . 5 %果胶酶
M a e e r o z y m e R 一 1 0 + 0
.
5 %蜗牛酶 + s m巾 0 1/ L
e a e l
Z + 0
.
6 m o l / L 甘露醉 + 0 . 3 % 葡聚 搪硫酸
钾 , p H S . 8 的酶液中游离原生质体 , 培养在改
良 M S 培养丛 , i , , I勺含激 素 l m g / L Z , 4一 D +
o
.
s m g / L 玉米索 , 并 附 加 0 . 3%琼脂 塘 。 第
1 0天 分裂频率达 40 一 50 % 。 此后 振荡 培养 1
个月 , 细胞团移至含 0 . s m g / L Z , 4一 D 及渗透
压降低的 M S 培养毖中大址繁殖 , 然后再移至
无激素或含 O . l m s/ L 玉米素的 M S 培 养 基中
进行分化 , 得到大量的球形胚 , 并且同步化达
9 0%
,
7 0% 的球形胚在 10 一巧 天 后 同步发育
为心形胚 , 以后继续发育为鱼雷胚及子叶胚 ,
皎后形成完整植株 。 并讨论了获得大量同步化
发生的体细胞胚的原因 。
[ l 〕 M u r a s h i g e , T . a n d F . S k o o g , 一9 6 2 , A r e -
v i
s e d m e d i u m f o r r a p i d s r o w t h a n d b i o a
-
s s a y s w i t h to b a e e o t i
s s u e e u l t u r e
.
P h y s沁王
P l a ” t , 1 5 : 1 7 3 一 4 0 7 ·
仁2 」 T o r i y a m a , K . a n d K . H i n a t a , 1 0 5 5 , C e l l
s u s P e n s io n a n d P r o t o P l a
s t e u l t u r e i n r i e e
.
P l a n t S e ie ” e e 41 : 1 7 9一 18 3 .
[ 3 」 K a o , K . N . a n d M . R . M i e h a y l u k . 10 7 5 ,
N u t r i t io n a l r e q u i r e m e n t s f o r g r o w t h o f
V ie ia h a ja s t a 凡 a e e l l s ￡, n d P r o t o P la s r s a t a
v e r y I o w P o P u l a t i o n d e n
s
i ty i n Ii q u i d
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.
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12 6 : 一0 5 一 1 2了) .
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,
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a l m e t h o d f o r t h e s e P a r a t j o n o f
v a r i o u
s s t之、 g e s i n t h e e m b r y o g e n e s i s o f
e a r r o t e e l l e u lt u r e s
.
P l a ” t S e i e ” e e L e t t e r
9 : 7 1一 7 6 .
L S 」 F u ji m u r a , T . a n d A . K o m a m i n e , 1 9 7 9 ,
S y n e h r o n i z a t i o n o f s o m a t i e e m b r y o g e ll e
-
5
1
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i n e a r r o t e e l l s u s P e n s io n e u l t u r e
.
P l a n t P瓦y s i o l · 6 4 : 16 2 一 16 4 ·
[ 6 」朱散 、 黄美交{l 、 牛小枚 、 李修 J及 , 一。。O , 产J」
珍【、 {本夕f{l咆胚在人 l冲}, 1气 {}, }l作 1 }, }!勺分 级 分
选 。 植物学报 , 3 2 ( 一 、 : 8 7一 5 7 7
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z a t io n o 它
d e v e lo P m e
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-
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.
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[ 9 」 享体光沁 、 夏光敏 、 李忠 z宜、 }汤;惠 民 , 19 9 0 ,
刁、 麦咏产仁质 f水 } I于生自f{胞 l ,〔于妄形 ,;又体 夕l}l胞 胚
不}1 1!乡了于乙植株 。 ! 1, l引科学 B 辑 9 : 9 7 0一。 7 盆。
[ 2 0〕 一李兴峰 、 陈惠民 、 邵明文 、 张悦 琴 : 舌tl 菜
厉L生质体培养直接产生体细胞胚 。 植物学报
(待刊登 ) 。
398夏光敏 李忠谊 于家驹 郭光沁 陈惠民 忿1 奋
SY NH C RO NO US
E RA O T I N
E M B Y O RGE NE S ISAD NL PA NT RE GE N一
F ROM P RO O TL PA STCL T U U RE OF
A T NH I RC S US SL YVE ST I RS
Xi aG u a n g一 mi n, L i Z h o n g 一 y i , Y u J i a 一 j u , G u o G u a n g一 q i n g a n d C h e n H u i一 功 i n
{ D e P a r t , ,乙e , 1￡ o了 B `0艺o g y , S瓦a n d o n g U n 东v e r s东玄y , J诬卜飞a ” , S瓦a ” d o n g , 2 5 0 1 0 0 )
A B S T R A C T
P r o t o P l a s t s w e r e i s o l a t e d f r o m s t e m n o
-
d e 一d e r i v e d e m b r y o g e n i e e a l l u s w i t h a n e n
-
Z y m e m i x t u r e c o n t a i n i n g 1
.
5% C e l l u
-
I a s e R 一 1 0 + 0 . 5 9
·石 M a e e r o z y m e R 一 1 0 +
0
.
5 % S n a i l a s e + 0
.
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2 +
0
.
6 m o l / L m
a n n i t o l + 0
.
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d e x t ar n s u l f a t e a t P l f 5
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;弓, a n d e u l t u er d i n
m o d i f i e d M S m e d i u m s u P P l e m e n t e d w i t h
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,厂L 竺 , 4一 D + 0 . 5
m g / L
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T h e y d i v i d e d w i t h a h i g h
f er q u e n e y
,
4 0一 5 0 9石 n t 1 0 d a y s e u l t u r e . A
m o n t h l a t e r t h e P r o t o e o l o n i e s w e r c t r a n s
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f e r r e d t o M S l i q u i d m e d i u m w i t h 0
.
5 m g /
L : , 4一 D a n d d e e r e￡zs e d o s m o t i e u m
.
A f te r
P r o l i f e r a t e d i n l a r g e n u m b e r
,
t h e y w e r e i n
-
d u e e d t o d i f fe r e n t i a t e b y t r a n s f e r r i n g t o M S
m e d i u m w i t h o u t h o rm o n e o r e o n ta i n i们 9 0
.
1
m g / L z e o t i n
,
w h e r e o v e r 9 0 % o f t h o m
f o rm e d g lo b u l a r e m b r y o s s y p e h r o n o u s l y a n d
d e v e lo P e d i n s u e e e s s i o n i n t o h e a r t 一 s h a p e d
e m b r y o s w i t h 7 0% o f s y n e h r o n i z a t i o n
.
F u r
-
t h e r d e v e l o Pm e n t o f t h e e m b r y o s r e s u l te d i n
t h e f o r m a t i o n o f w h o l e P l a n t l e t s
.
T h e s a k e f o r t h e s u e e e s s o f g e t t i n g a
g r e o r n u m b e r o f s o m a 一i e e m b r y o s a n d h i g h
s y n e h r o n i z a t io n i n e m b r y o g e n e s i s 认 a s 乏飞150
d i s e u s s e d i n t h i s P a r e r
.
K e y w o r d s : A ” r l r is e “ 5 s y 工v e s t r i s . E m b r y o g e n e s i s . P i a n t r昭 e n e r a t i o n . P r o t o p l a s t e u l t u r e .
S y n e h r o n i az t io n
.
图
4 0 0夏光敏 李忠谊 于家驹 郭光沁 陈惠民 24卷
田 版 说 明
1
。 峨参胚性愈伤组织新分离的原生质体 。 x0 20
2
。 原生质体再生细胞的第一次分裂 。 x 20
3
。 原生质体再生的细胞团 。 x 10
4
、
5, 正在发育的球形胚 。 x 1 0 0 、 x 3〕
6
。 同步发生的球形胚 。 K 20
7
. 同步发生的心形胚 。 x ,
8
。 鱼雷胚和子叶胚 。 x Z。
9
。 原生质体再生的愈伤组织上形成大量的球形胚 。
10
。 图 9的局部放大 , 示愈伤组织上的球形胚 。
1 1
。 球形胚发育成大最子叶胚 。
12
。 图 n 的局部放大 , 示子叶胚 。
邓 。 峨参原生质体再生植株。
14
。 原生质体再生植株的根上形成胚 个。
X l
。
Q
K 2 0
X l
。
0
X 1 5
X l
。
0
X 2 0
E X P L A N A T I O N O F F I G U R E S
凡 g 。 1 。 P r o t o P】as t s n e w l y js o l a t e d f r o m e m b r y og e叻 e e a l l us o f A n t h r i s e us s y l v e s t r i s .
F场。 2 。 l s t di v过 o n o f r e g e n e r a t e d e e l l s . x 2 0 0
刊招。 3 。 P or toc 】O n i e s d e ir v e d f r o m p or t o p fa s t s
.
x 1 0 0
砚目。 4 。 5 . D ve lOP in g g 10 b ul a r e m b r y o s . x 1 0 0 , x 5 0
F场。 6 。 G IOb lu a r e m byr o s f o r m e d s v cn h or n o su l y f or m P r o t oc o l o n i e s . x 2 0
F孟g 。 7 。 H七a r t一 s h a讲d e m b r y o s . x 0 0
F匆。 8 。 介月珍d o a n d e o t y l e d o n a r y e m b r y o s . x Z。班 g 。 9 。 10 。 G】O b lu a r e m b r y o s f o r m e d o n e a l l su s ur fa e e . x l , x 2 0
F场。 1 2 . 2 2 . G or w i昭 e o t y l e d o n a r y e m b r y o s . x z , x 2 5
下场一 13 。 R姐en e r a t i o n o f p l a n t f r o m p r o to p l a s t s . x z
川g 。 2 4 . E m b r y o s f o r m e d f r o m t l飞c r o o t o f 0 p r o to P la s t一 d e r iv e d p la n t l e t . x : 、
又 Z J J
4期 蛾参原生质体的体细胞胚同步化发生及泣件再卫 0 4 1
, `