全 文 ：第 36 卷　第 6 期 西北农林科技大学学报(自然科学版) Vol.36 No.6
2008 年 6 月 Journal of No rthwest A&F Univer sity(Na t.Sci.Ed.) Jun.2008
西藏披碱草属野生牧草种质资源的遗传多样性
分析与分子聚类研究＊
张文妤1 ,曹社会1 ,曹仲华1 , 2 ,魏　军3 ,周梦华1
(1 西北农林科技大学 动物科技学院陕西省农业分子生物学重点实验室 ,陕西杨凌 712100;
2 西藏自治区 农牧厅 ,西藏拉萨 850000;3 西藏大学理学院 ,西藏 拉萨 850000)
[ 摘　要] 　【目的】了解西藏披碱草属野生牧草的遗传多样性及其数量 、分布规律。【方法】以披碱草基因组
DNA为模板 , 利用微卫星(Micro sa te llite)分子标记对搜集到的 9份西藏披碱草属野生牧草及 8 份对照材料进行遗传
多样性研究 ,统计了不同引物对供试材料的扩增结果 , 分析了西藏的 9 个披碱草居群间的遗传距离 、遗传相似系数 ,
并对所有17 个居群进行了 UPGMA 聚类。【结果】试验共筛选 32 对引物 ,其中 14 对引物有扩增条带 , 具有多态性且
扩增效果较好的引物有 8 对。用筛选出的 8 对引物对供试的 17 份材料进行微卫星分析 ,共检测出 69 个等位基因 , 平
均每对引物所产生的等位基因数为 8.6 个;西藏 9 个居群间的遗传相似系数为 0.273 ～ 0.900。 UPGM A 聚类分析表
明 ,在相似系数阈值为 0.58 时 , 9 份材料可大致分为 3 类。【结论】西藏披碱草属野生牧草种质资源具有较高的遗传
多样性。
[ 关键词] 　西藏;披碱草属牧草;遗传多样性;SSR分子标记;UPGMA 聚类
[ 中图分类号] 　S543 +.902.4 [ 文献标识码] 　A [ 文章编号] 　1671-9387(2008)06-0039-06
Genetic diversity analysis of wild Elymus L.of Tibet an
germplasm resources and molecular cluster research
ZHANG Wen-y u1 ,CAO She-hui1 , CAO Zhong-hua1 , 2 ,WEI Jun3 ,ZHOU Meng-hua1
(1 Col leg e o f An ima l S cience Techno logy , Key Laboratory Molecu lar Biolog y o f Ag ricu lture Sh aanxi , Northwest
A &F Univer sity Y ang ling , Shaan xi 712100 , China;2 The Depar tment o f Ag ricu lture and animal Husbandry o f T ibet , Lhasa ,
Tibet 850000 , Ch ina;3 Co llege o f S cience , Tibet Univer si ty , Lhasa , Tibet 850000 , Ch ina)
Abstract:【Objective】The study was done in order to know the genetic diversity , quanti ty and dist ri-
bution of the wild E lymus L.o f Tibet g ermplasm resources.【Method】E lymus L .genome DNA was used
as template , genetic diversity o f 9 Tibet populations wi th 8 control g roups were studied by micro satelli te
method.The amplified results by di fferent primers w ere recorded , the genetic distance analy zed , Nei s g e-
netic ident ity of 9 E lymus L.populations of T ibet analy zed and UPGMA Dendrogram cluster analy sis o f 17
Elymus L.populations made.【Result】Thirty-Tw o primer pairs w ere used fo r po lymo rphic select ion ,
with14 prime r pai rs obtained amplified products , eight primer pai rs produced speci fically po lymo rphic prod-
ucts.A to tal of 69 alleles w ere observed , the ave rage number of alleles per locus w as 8.6.Genetic ident ity
ranged from 0.27 to 0.90 among the 9 populations.Cluster analysis wi th UPGMA show ed that w hen ge-
netic identi ty w as 0.59 , the 9 accessions could be divided into 3 g roups.【Conclusion】The w ild E lymus L.
＊[收稿日期] 　2007-12-13
[基金项目] 　西藏自治区 2006年度全区重点科研项目
[作者简介] 　张文妤(1981-),女 ,内蒙古通辽人 ,在读硕士 ,主要从事草业技术研究。 E-mai l:zhangw enyu1001@126.com
[通讯作者] 　曹社会(1954-),男 ,陕西礼泉人 ,副教授 ,主要从事草业科学和饲料科学研究。 E-m ail:shehuicao@yah oo.com.cn
of T ibet germplasm resources had a high genetic diversity.
Key words:Tibet;E lymus L.;genetic diversi ty ;SSR;UPGMA cluster
　　披碱草属(E lymus L .)是禾本科(Poaceae)小
麦族(Tri ticeae)中的一个多年生属 ,据《中国植物
志》记载 ,该属在中国有 12 种和 1变种 ,而西藏地区
有 5种 ,分别是披碱草(E.dahuricus Turcz.)、老芒
麦(E.sibiricus L)、垂穗披碱草(E.nutans G riseb)、
黑紫披碱草(E.atratus Hand)和麦宾草(E.tang u-
torum Hand)。披碱草属植物具有较高的经济价
值 ,不仅是优良的牧草 ,而且还具有麦类作物所缺乏
的高产 、优质 、抗病 、抗虫和抗逆等优良基因 ,是改良
和育成麦类作物新品种的宝贵资源[ 1] 。因此 ,常被
作物育种家选作麦类作物远缘杂交及进行转基因研
究的对象[ 2] 。国内外的牧草研究者们从分类学 、形
态学 、栽培技术 、引种驯化 、染色体核型 、同工酶 、等
位酶及分子水平 ,对该属植物的遗传多样性和系统
演化进行了大量的研究[ 3-7] ,但尚未见从分子水平研
究西藏地区野生披碱草种质资源遗传多样性的报
道。
DNA 分子标记技术具有遗传稳定 、不受环境影
响和检测迅速准确的优点 ,可以鉴定一些外形很难
区分的种群[ 8] 。目前 ,用于作物遗传多样性研究的
DNA 分子标记主要有限制性片段长度多态性
(RFLP)、随机扩增片段多态性 DNA(RAPD)、扩增
片段长度多态性(AFLP)和微卫星 DNA (SSR)等。
SSR标记由于其数量丰富 ,广泛分布于整个基因组;
具有较多的等位性变异;试验重复性好 ,结果可靠等
优点而被广泛用于动 、植物的遗传多样性研究 。
西藏是我国传统的五大牧区之一 ,披碱草属植
物是青藏高原高寒草甸的主要建群种或优势种 ,也
是营养价值较高的优良牧草之一。本试验以采自西
藏 9个不同居群的披碱草为研究对象 ,并以采自青
海 、内蒙古和黑龙江的 8份材料为对照 ,从分子水平
对其进行了鉴定和遗传多样性分析 ,以期了解其在
西藏天然草地的数量 、分布和质量 ,为西藏地区披碱
草属植物种质资源的保护和利用提供科学依据。
1　材料与方法
1.1　供试材料
试验所用材料的来源和编号详见表 1。来源于
西藏的 9个居群材料均于 2006年 9月下旬采自西
藏的不同地区 ,采样时每隔约 50 m 采集生长良好的
植株种子 ,每个居群采种子约 2 kg 。种子带回实验
室发芽 ,取萌发的幼嫩叶片作为试验材料 。
表 1　供试披碱草属植物材料的种类与采集地
Table 1　E lymus L.species and its co llection sites used in experiment
编号
Number
种类
Species
采集地
Collect ion site
编号
Number
种类
Species
采集地
C ollection si te
1 披碱草属 E lymus L. 当雄 Dangxiong 10 老芒麦 E.sibiricus 青海 Qin ghai
2 披碱草属 E lymus L. 山南 Shannan 11 披碱草 E.dahur iu s T ur. 青海 Qin ghai
3 披碱草属 E lymus L. 鲁琼 Luqiong 12 垂穗披碱草 E.nu tans Griseb 青海 Qin ghai
4 披碱草属 E lymus L. 那曲 Naqu 13 老芒麦 E.sibir icus＊ 内蒙古 Inner mongolia
5 披碱草属 E lymus L. 堆龙 Dui long 14 披碱草 E.dahur iu s T ur.＊ 内蒙古 Inner mongolia
6 披碱草属 E lymus L. 仁布县 Renbuxian 15 加拿大披碱草 E.canadensis＊ 内蒙古 Inner mongolia
7 披碱草属 E lymus L. 浪卡子 Langkazi 16 披碱草 E.dahur iu s T ur. 甘肃 Gansu
8 披碱草属 E lymus L. 申扎 Shenzh a 17 披碱草 E.dahur iu s T ur. 黑龙江 H ei longjiang
9 披碱草属 E lymus L. 拉萨 Lasa
　　注:标＊者为栽培种 ,其余为野生种。
Note:Maker＊ represent cu lti vated species , the others are w ild species
1.2　供试披碱草属植物的微卫星分析
1.2.1　基因组 DNA 的提取 　每个居群随机选取
20个单株的幼苗叶片等量混合 ,取 3 ～ 5 g 用无菌水
清洗 ,吸干多余水分后置于预冷的研钵中 ,倒入适量
液氮 ,迅速研磨成粉末 ,然后采用 CTAB-氯仿抽提
法提取 DNA[ 6] 。采用 ND-1000 核酸蛋白检测仪
(Biphotomete r)检测所提取 DNA 的浓度和纯度 ,用
10 g/ L 琼脂糖检测基因组 DNA 的质量。采用 Gel
DOC-1000凝胶分析系统进行成像[ 9] 。
1.2.2　SSR引物筛选　试验共筛选出引物 32对 ,
其中 10对为披碱草属引物 , 22 对为小麦属引物。
32对引物均由上海生工生物工程有限公司合成 ,最
终筛选出效果较好的 8对引物及其序列见表 2 。
1.2.3　PCR扩增　分析采用的 PCR反应体系为
20μL ,内含 10×扩增缓冲液 2.0 μL , 25 mmo l/L
MgC l2 1.6 μL , 2.5 mmol/ L dN TP 1.2 μL , 10
40 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 36 卷
μmol/L 微卫星上 、下游引物各 0.5μL ,50 ng/μL 模
板DNA 1.0μL ,5 U/μL Taq DNA 聚合酶 0.2μL ,
加灭菌 ddH2O至 20 μL。
表 2　8 对具多态性的微卫星引物及其序列组成
Table 2　Eight pair s o f po lymorphism SSR prime r and it s sequence
引物
Primer
引物序列
S equence
核心重复
Repeat
退火温度/ ℃
Annealing tem perature
ECGA22
5′-GAAGG TGACT AGGTCCAAC-3′
5′-A TAGTCTCGG TCAGGCTC-3′ (CT)27 54
EAGA22a
5′-GAAATGCAAGCGT ATGGTGAAG-3′
5′-AGGGCCGGAAGG TCCAT AT-3′ (AGCT)3 TAG 3 T3G(AAGGG)2A 3 52
EAGA5-1 5′-TCCACTG TGCTACTT CTAGCT-3′
5′-AACTGAATGAATG TGTGCAGT-3′ (AG)15 52
EAGA103
5′-GACTGCTAAACTAACAACAAAACT -3′
5′-A TC TCA CAC TGG CTC ATG TC-3′ (GA)21 52
WMS43
5′-CACCGACGGT TTCCCTAGAGT-3′
5′-GGTGAGTGCAAA TGTCA TGTG-3′ (CA)22 60
WM S44
5′-CTGT TCT TGCGTGGCAT TAA-3′
5′-AA TAAGGACACAATT GGGATGG-3′ (GA)28 60
WMS47
5′-TTGCTACCATGCA TGACCAT-3′
5′-TTCACCTCGAT TGAGGTCCT-3′ (CT)7 T T(CT)16 60
C FD168
5′-CTTCGCAAA TCGAGGA TGAT-3′
5′-TTCACGCCCAG TAT TAAGGC-3′ (CTG)20 60
　　PCR扩增在 PTC-200TM 扩增仪(MJ 公司)上
进行 。PCR反应程序为:94 ℃预变性 3 min;94 ℃
60 s , x ℃60 s , 72 ℃90 s ,35个循环;最后 72 ℃延
伸 10 min。其中 x 代表不同引物的退火温度。在
反应程序中 ,由于不同引物的退火温度不一样 ,故试
验中先对每对引物的退火温度进行了优化 ,优化结
果见表 2。扩增产物在 80 g/ L 的聚丙烯酰胺
(PAGE)凝胶上电泳(恒定电压为200 V),电泳 3 ～
4 h 后 ,按文献[ 6]的方法银染后观察记录并照相 ,
选择扩增效果较好的 8对微卫星引物进行统计与分
析。
1.2.4　数据处理　选择扩增强且具有代表性的条
带进行统计[ 10] , 有带赋值 1 ,无带赋值 0 ,缺项赋值
9 ,利用 NTSYS-PC version-2.1 软件进行数据处
理。以简单配对参数(Simple matching coeff icient)
计算遗传相似系数 , 用 U PGMA 方法(Unweight
pair g roup method using arithric averages)进行聚
类分析 。
2　结果与分析
2.1　供试披碱草基因组 DNA的提取
供试披碱草基因组 DNA 的提取结果见图 1。
从图 1可以看出 ,DNA 提取效果较好 ,无降解 ,且无
蛋白 、酚类等杂质残留的影响 ,可用于披碱草基因组
DNA 的 SSR分子标记分析。
图 1　披碱草基因组 DNA 的琼脂糖凝胶电泳分析
Fig.1　10 g/ L agaro se gel elect rophoresis o f
g enomic DNA of E lymus L.
图 2　引物 WMS47对 17 份披碱草样品的扩增结果
1～ 17.供试披碱草编号;M .100 bp Marker
F ig.2　Profile produced in 17 Elymus L.by the primer
WMS47
1-17.Number of E lym us L.species;M.100 bp Marker
2.2　供试披碱草属植物的 SSR标记
用具有多态性且扩增效果较好的 8对引物对供
试材料进行SSR标记 ,将产生多态性的 SSR引物的
所有扩增产物均用于分析 ,并将每条扩增带看作 1
个等位位点 。由表 3可见 ,8 对引物共检测出 69个
等位位点 ,片段大小集中在 98 ～ 488 bp ,其中 59个
等位位点有多态性 ,占 85.5%,每对引物可扩增出
4 ～ 12个位点 ,平均每个引物产生 7.4 个多态性位
点。表明西藏披碱草属植物具有较高的遗传多样
性。利用引物WMS47 对 17个居群的扩增结果见
41第 6 期 张文妤等:西藏披碱草属野生牧草种质资源的遗传多样性分析与分子聚类研究
图 2 。从图 2可以看出 ,亲缘关系较近的居群间带
型差异较小 ,反之带型差异较大 ,这可以作为利用
SSR分子标记鉴定披碱草种类的依据 。
表 3　披碱草属植物 SSR分析所选用的引物及其遗传变异特征
Table 3　P rimer combina tions and their g ene tic v ariations in the analysis of Elymus L.by SS R marker
引物
Primer
扩增位点数
Amplif ied site
多态性位点数
Polymorphic
site
多态性位点比例/ %
Rat io of polymorphic
site
引物
Primer
扩增位点数
Am plifi ed site
多态性位点数
Polym orphic
site
多态性位点比例/ %
Ratio of
polymorphic si te
ECGA22 12 9 75.0 WM S47 6 5 83.3
EA GA22a 12 10 83.3 WMS328 5 4 80.0
EA GA5-1 6 6 100 C FD168 11 9 81.8
EA GA103 7 7 100 合计 Total 69 59 85.5
WM S44 10 9 90.0 平均 Mean 8.6 7.4 85.5
2.3　西藏 9个披碱草属植物居群间的遗传变异分
析
遗传相似系数是度量生物群体间遗传变异程度
的指标 ,是基因频率的函数 ,能够表示群体间的相似
程度 ,也能够反映出居群的遗传多样性程度[ 11] 。遗
传相似系数越大 ,说明居群间的亲缘关系越近;反
之 ,说明居群间的亲缘关系越远 。本研究根据
Nei[ 12] 的遗传相似性公式 , 用 N TSYS-pc version-
2.1求得西藏 9个披碱属植物居群间的相似性指数
如表 4 所示 。从表 4可以看出 ,山南卡多乡居群与
浪卡子居群之间的遗传相似性指数最小(0.273),说
明这 2 个居群的亲缘关系较远 ,那曲居群与堆龙居
群之间的遗传相似性指数最大(0.900),说明这两个
居群的亲缘关系较近 。9个居群间的遗传相似性指
数介于 0.273 ～ 0.900 ,可见这 9个居群的遗传差异
很大 ,具有丰富的遗传多样性。一个物种的遗传多
样性越高 ,其对环境变化的适应能力就越强 ,越容易
扩展其分布范围和开拓新的生存环境。
表 4　西藏 9 个披碱草属植物居群的相似性指数
Table 4　Nei s genetic identity o f 9 E lymus L.populations o f T ibet
居群
Populat ion
当雄
Dan gxiog
山南
Shannan
鲁琼
Luqiong
那曲
Naqu
仁布县
Renbuxian
浪卡子
Langkazi
申扎
Shenzha
拉萨
Lasa
堆龙
Duiong
当雄 Dangxiong 1.000
山南 Shannan 0.721 1.000
鲁琼 Luqiong 0.434 0.382 1.000
那曲 Naqu 0.370 0.345 0.854 1.000
仁布县 Renbuxian 0.411 0.362 0.800 0.881 1.000
浪卡子 Langk a zi 0.333 0.273 0.548 0.600 0.545 1.000
申扎 Shenzha 0.296 0.280 0.714 0.842 0.744 0.714 1.000
拉萨 Lasa 0.345 0.321 0.727 0.762 0.756 0.524 0.707 1.000
堆龙 Duilon g 0.407 0.407 0.814 0.900 0.884 0.585 0.800 0.689 1.000
2.4　17个披碱草居群的 UPGMA 聚类分析
利用 NTSYS-PC version-2.1软件对17个披碱
草属植物居群的统计数据进行 UPGMA 聚类分析 ,
并作二维 Mantel相关检测(2-way M antel test),计
算相关系数 。根据 Mantel[ 13] 的结论:相关系数 r值
大于 0.9表明进化树符合很好;如 r值为 0.8 ～ 0.9 ,
表明进化树符合较好;r值为 0.7 ～ 0.8 ,表明进化树
符合一般;如小于 0.7 ,表明进化树符合不好 。将相
关系数与聚类分析相结合才能准确反映居群间的遗
传关系。
从图 3可以看出 ,当相似系数阈值为 0.59时 ,
17个居群可大致划分为 5类 ,其中西藏当雄和山南
居群与青海垂穗披碱草居群聚为一类 ,青海老芒麦
和内蒙老芒麦聚为一类 ,加拿大披碱草单独为一类 ,
浪卡子居群独自为一类 ,其余 10 个居群聚为一类。
由此可以初步判断西藏地区 9个居群的种类为:当
雄和山南居群为垂穗披碱草居群 ,浪卡子居群可能
为黑紫披碱草或者麦宾草居群 ,其他 6个居群均为
披碱草居群 。
3　讨　论
3.1　浪卡子居群种类的判定
由 UPGMA聚类分析可知 ,浪卡子居群在相似
系数阈值为 0.59时独自聚为一类 ,因此其不是披碱
草 、老芒麦或垂穗披碱草中的任何一种 ,而据《西藏
植物志》记载 ,西藏地区有 5 种披碱草属植物 ,因此
浪卡子居群可能为黑紫披碱草或者麦宾草。由于没
有搜集到可以作为对照的已知种类的黑紫披碱草和
麦宾草 ,所以尚不能准确判定其种类 ,还需要从形态
和核型等方面作进一步研究。
42 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 36 卷
3.2　引物的选择
SSR分子标记是根据微卫星 DNA 两端的单拷
贝序列设计的特异引物 ,可通过 PCR技术将其核心
微卫星 DNA 序列扩增出来 ,因此引物的设计和选
择对试验的成功与否至关重要 。
本试验在选择引物时 ,参考了国内外许多学者
在研究披碱草微卫星时所选择的扩增效果较好的引
物[ 1 , 14-15] ,同时又筛选了一些披碱草属的近缘属-小
麦属的引物进行扩增 ,取得了比较理想的结果。因
此 ,在研究生物的微卫星标记时 ,引物可以选择本属
的引物 ,也可以选择近缘属的微卫星引物 。
图 3　17 个披碱草居群 SSR分子标记的 UPGM A 聚类
F ig.3　UPGMA Dendrog ram generated by cluster analy sis of SSR fo r 17 Elymus L.populations
3.3　披碱草属植物遗传多样性的分子标记
对披碱草属植物的分子生物学研究 ,国外科研
工作者开展得比较广泛而且深入[ 1 , 6 , 16-17] 。 Sun
等[ 16]研究了 3个挪威披碱草(E.alaskanus)居群的
微卫星多态性 ,多态性位点为 81%,每个多态性位
点的平均等位基因数为 5.7个 ,与等位酶标记相比 ,
微卫星标记表现出更高的遗传变异 。Diaz 等[ 17] 用
RAPD和微卫星方法研究 E.f ibrosus 的遗传多样
性时发现 ,居群内的遗传多样性较低。
国内对披碱草属植物分子生物学的研究虽然起
步较晚 ,但也已经取得了大量的研究成果[ 4 , 14-15 , 18] 。
孙建萍等[ 18] 利用微卫星分子标记研究了我国 16 份
披碱草的遗传多样性 ,用 6对引物共检测出 26 个等
位基因 ,平均每对引物所产生的平均等位基因数为
4.3个。李永祥等[ 19] 用 ISSR和 SSR两种分子标记
方法 ,研究了我国披碱草属 12 个物种的遗传多样
性。本试验用微卫星标记研究西藏野生披碱草的遗
传多样性 ,也得到了较好的结果。
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44 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 36 卷