全 文 ：生 物 工 程 学 报 8(4 ): 35 3 一5 6 3 , 1 9 9 2
C九` 汽。 e J ou r ” a乙of B `o t ` c h 拄。忿o g y
滇紫草培养细胞中色素合成的代谢调节
周立刚 郑光植 王世林 甘烦远
(中国科学院昆明植物研究所 , 昆明 )
培养基中分别加入浓度为 1。一 5 m ol / L 的铜离子 , 滇紫草愈伤组织中色素含量提高了 5 . 5
倍 , 悬浮细胞中色素含量提高 8 . 1倍 。 细胞培养第 21 天 , 加入浓度为 1-0 , m ol / L的 L 一 P he , 色
素的合成量最大 。 浓度为 10 一 ` m ol / L 的抗坏血酸 , 能明显地促进培养细胞中色素的合成 。
关 . 询 滇紫草 , 培养细胞 , 色素 , 代谢
滇紫草 ( O , 0 5明 a 夕a n i c o l a t o m B u r .
et F r
.
)系紫草科的一种常用中草 药 , 主
产云南 , 药理研究表明 , 其主要有效成分
为蔡配色素 , 具有抗炎 、 抗肿瘤等多种作
用 , 此外还广泛应用于染料 、 食品和化妆
品中。 应用现代生物技术 , 借助植物细胞
培养的方法工业化生产紫草色素 , 具有许
多优越性 。 日本已成功地进行了与上述滇
紫草同科不 同属植物紫草 ( L ` th os P cr m 。二
er yt hr or ih oz n) 细胞培养工业化生产色素
的研究 川 。我们从 1 9 8 8年着手进行滇紫草
细胞培养与色素生产的研究 `“ 一 “ ’ 。 本文是
在过去的研究基础上 , 首次报道滇紫草培
养细胞中色素合成的代谢调节 , 探讨适合
于滇紫草细胞培养与色素生产 的 最 佳 条
件 , 为将来大量培养创造条件 。
( I A A ) 1 0
一 。
m o l / L
、 细 胞 激 动 素 ( K T )
2 0
一 “
m o l /L 的 L S 「7 ’ 液体 培 养 基 中 。
2 50 m l 三角瓶内装培养液 50 m l 。 愈伤组织
培养 40 天 , 悬浮细胞培养 30 天收获 。
(三 ) 培养物产 , 、 色众含 , 和产 .
的浦定
愈伤组织或悬浮细胞培养 一段 时 间
后 , 收获 , 经冰冻干燥至恒重 , 以培养物
(包括愈伤组织和悬浮细胞 )产量代表其生
长 , 单位为 g d( . w . ) /L 。 将培养物粉碎 ,
色素含量测定同呱 z uk a m i等 ` . ’ 的方法 ,
将色素含量乘以培养物产量即 得 色 素 产
量 , 单位为 m g / L 。 本文所得结果均为四
次重复平均值 。
结 果 与 讨 论
材 料 与 方 法
洲 , (一 ) 实脸材料
供试材料为云南产滇紫草茎愈伤组织
无性系 ` , , 。
(二 ) 培养方法
愈伤组织培养同前文 【 3 ’ 。 细胞悬浮培
养采用旋转式摇床 , 转速 1 1 o r /m in , 振
幅 2 , co m 。 细胞暗培 养 于添加叫噪 乙 酸
(一 ) 铜离子的影晌
据报道 , 铜离子在合适浓度下能明显
地促进烟草 (N f o o t i a , a t a b a c 。沉 )细 胞 中
生物碱 、 黄连 ( C o P t` 5 j a P o n i c a ) 细胞中
小孽碱的形成 ` “ ” 。 ’ 。 由此可见 , 铜离子
能激活次级代谢过程中某些酶系统 。 在生
长培养基中 , 分别加入不同浓度的铜离子
本文于 l。。 1年 10月 10日收到 ,
DOI : 10. 13345 /j . cjb. 1992. 04. 008
生 物 工 程 学 报 : 8卷
作单一因子试验 , 培养滇紫草愈伤组织和
悬浮细胞 , 结果如图 1 和图 2 所示 。 对于
愈伤组织培养 (图 1 ) , 所试验的五个浓度
梯度 , 对色素合成均有不同程度的促进作
用 。 铜离子浓度为 1 0 ~ 6 m of / L时 , 对愈伤
组织生长和色素合成的促进作 用 最 为 明
显 , 色素产量 为 16 1 . 29 m g / L , 是 对 照
(2 4
.
s7 m g L/ )的 6 . 5倍 , 愈伤组织产量为
l 〕 . 6 59 ( d w t ) /L , 是对照的 2 倍 。 铜离子
浓度大于 1 0 一 “ m of /L , 愈 伤组织产量和
色素含量将不再继续增加。 铜离子对悬浮
细胞影响的结果与愈伤组织大体 一 致 (图
2 )
,
1 0
’ ` m of /L时 , 色素产量达最大值 ,
为 3 2 1 . 6 8m g / L , 是对照 ( 3 5 . 2 8m g / L )的
、守à二、目日万加二节习卜期响:l0时树a
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图 1 钥离于对演萦草盘伤组织堵养的形响
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图 2 钥离子对演紫草细胞悬 浮培养的影响
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1倍 。 从图 l 和图 2 可以看出 ,铜离子浓
度虽然成百倍的增加 (小于 1。一 ` m of /L ) ,
但培养物产里 、 色素含量和产量均呈上升
的趋势 , 这说明铜离子作用的浓度范围很
大 , 对愈伤组织和悬浮细胞色素合成的最
道作用浓度均为 1 0 “ ` m of / L , 此外 , 铜离
子对滇紫草悬浮细胞的影响效果要比愈伤
组织明显 。 关于铜离子对色素合成的具体
作用机理还有待于进一步研究 。
(二 ) 笨丙奴 . 的形晌
4期 周立刚等 :滇紫草培养细胞中色素合成的代谢调节
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一苯丙氨酸 (Ph e)加入 P la夕` ob ot-
h r y:a r eZ o nsc公 细胞中培养 , 能有效 地
促进阿卡宁 ( A lk an i)n 的形成 【’ ` ’ , 这说
明 P he 可能是蔡配化合物合成的前 体 。
培养 不 同 时 间 后 , 分 别 加 入 浓 度 为
1-0
`
m of /L 的 L 一 P he ,结果如表 1 所示 。
不同时期加入 L 一 Phe 对细胞生长均无 明显
影响 , 培养第 1 、 7 、 1 4 、 2 1天 加 入 L -
P h e
, 色素含量和产量依次增加 , 培养第
21 天加入 L 一 P he 色素含量和产量达最大
值 。 这是由于在培养开始时 , 培养液中生
长素和氮源较高 , 从而导致 L 一 P h e转化成
衰 2 不阅浓应的 L · P七e 对成. 草… 娜幼养的形晌
T a b l e 2 fE f e C t S o f L
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10一 ` 1 3 。 0 5 1 。 2 0 6 15 7 。 3 6
1 0一 3 12 。 10 0 . 0 0 0 ! 0 8 。 0 0
1 0一 , 1 2 。 9 7 0 。 6 9 6 9 0 。 2 9
衰 1 不 同时期加入 L 一 P h e对演旅草细脑 . 浮
培葬的影晌
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蛋白质 。 到培养后期 , 生长素和氮源一旦
消耗殆尽 , 则蛋白质合成终止 , L 一 P he 便
向生成蔡醒色素的方向进行转化 。 到培养
末期 (第 2 8天 )加入 L 一 P h e , 色素含量和产
量并没有增加 , 是由于加入 L 一 P挽后培养
时间太短 (第 30 天收获 ) 。 以上结果表明 ,
加入L 一 P h e亦能有效地促进滇紫草培养细
胞中色素的合成 ,培养第 lz 天加入 L 一 P h e ,
色素合成量最大 。
培养第 21 天分别加入不同浓 度 的 L -
外 e , 结果如表 2所示 。 L 一hP e 浓 度 为
1 0
一 ’一 1 0 一 ` m ol / L时 , 对色素合成有明显
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图 _ 3 抗坏血徽对城策草细胞悬浮培养的形响
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36 5生 物 工 程 学 报 8卷
的促进作用 , 浓度为 1。 ~ ’一 1 0~ “ m of /L ,
色素含最并没有增加 。 综合表 1 和表 2 ,
第 3 周加入 1-0 “ m of / L的 L 一 P h e 能较好地
促进色素的合成 。
(三 ) 筑坏血 , 的形晌
加入不同浓度的抗坏血酸 , 对滇紫草
悬浮细胞培养的影响 , 结果如图 3所示 。
1-0
’一 1-0 Om of / L的抗坏血酸 , 能不同程
度地促进色素的合成 , 浓度继续加大时则
抑制色素的合成 。 由于抗坏血酸参与细胞
的氧化还原反应 , 这表明它在蔡配色素生
物合成途径的氧化还原过程中 , 起着较为
重要的作用 。
综上所述 , 培养液中加入适宜浓度的
铜离子 、 L 一hP e和抗坏血酸 , 均能有效地
影响滇紫草培养细胞中色素的合成 , 这为
建立滇紫草细胞两步培养系统 , 选择合适
的生长和生产培养基提供了可靠的科学依
据 。
, 考 文 献
〔 l 〕 uF ji饭 , Y 。 an d aT ba t a , M . : I n “ P la n t T i s su e a n d C e l l uC l t u r e ” , P P
.
z e 7一 5 5 , N e w OY r k
A lan R
。
U s s
,
Icn
. , 1 0 5 7 。
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t ` 〕 周立附等 . 云南植物研究 , 1 4 ( 2 ) : x o s一 20 7 , 1。。 2 .
( s 〕 月立用峪 : 天然产物研究与开发 , 2 ( 2 ) 一2 2一 2 5 , l 。。 o 。
〔 6 〕 周立月娜 : 天然产钧研究与开发 , 3 ( 2 ) : s `一 s吕 , 2 9 0 1 .
〔 7 〕 U n s m成 e r , E . F . a n d S k o g , F . : hP y s f o lo g i “执 p 勿” t a r u m , 15 ( l ) : 10 0一 1 2 7 , 20 6 5 .〔 s 〕 M iuz k印滋1 , H . e t a l . : hP 升云o hC em 乞s t r甘 , 18 ( s 川 15 3一 l l s e , 2 0 7 7 .〔 o 〕 T so , T . C . et 目 . : P la ” t hP 百5 10肠g对, 5 1 ( ` ) : 5 0 `一 s l e , 10 7 5 .
( 1 0〕 翻仍 r lm ot o , T . : A g r i c u 扮u f a正a 论 d B i o 勿g i ca 正C hem i s亡护甘 , 5 2 ( 7川 5 3 5一 l s s e , 10 58 . “
( 1 1〕 cS h m i d t , H 。 V . a n d Z e n k , M . H 。 : T时 r a h e d r o n L以 t er s , 4 4 : 4 1 6 1 , 20 7一
M e t a b o li c R e g u l a t i o n
.
o f P ig m e n t F o r m a t i o n o f
O n o s m a P a n i e u不a t u m C u ! t u r e d C e !15
Z h on L ig an g Z h
e n g G u a n g z h i W an g S h l i
n G a n F a n y u a n
(K “ 砚m i ” 9 I n s t京t “亡e o f OB 亡a 砚 g , A e a d e m主a s 云” i ca , K “ 月 tn i n g )
T h e P ig me lt y le ld
o f O n o s m a P a n i c : l a t o m e a l lus a n d s us ep sn io n e u l t u
-
er d ce ls 、 v a s in e r e a s e d s
。
5 a dn 8
.
1 f o kl o f t h a t o f t he e o爪 r o l r e s Pe ct iv -
e ly w he n 1 0
一 ` m of /L e o P碑 r io n w as a d d e d int o t he me d in m . T he P ig me 就s
s y n t h e is
、甘a , s t加 lu a t e d g r e a t l y if 1 0一 ” m o l / L L 一 P ho n y l a l a苗 n e w as a d d e d
加 t o 服 d iu m w h en t he ce l ls 、 v e er e lu t u er d f o r t w e nt y 一 o ne d a y s . T h e
Pi g m e lt s r e ac 加 d t he m ax im u m y le dl w be n 1 0一 “ m o l /L as e o r b ie a e id w as
ad d
e d i n t o t h e 幻n e id u m 。
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