全 文 ：6农吉利硷对人体肝癌体外培养细胞系( B EL 一 740 2) 的某些影响
青岛医学院肿瘤研究室 杜翠芝执笔
长期以来 , 研 究 证 明〔 `一 ` ”〕农 吉 利硷
( 野百合硷 、 m o n o e r o t a l i n e ) 对动物实验
性 肿 瘤 有 较高的抑制率 , 对人体皮肤癌 、
宫颈癌等恶性肿瘤疗效颇佳 , 对肝脏有一定
损害 , 人体皮肤 、 小白鼠子宫 、 肝 、 肾对该
硷都有较高的利用率 , 对人胚肝细胞 、 大鼠
再生肝细胞以及实验动物肝组织 的形态 、 机
能 、 生化等方面都有显著影响 。 但是 , 尚未
见这类生物硷对人体肝癌细胞系的影响以及
用它来治疗肝癌的报导 。 为进一步探讨其抗
癌 、 致毒作用 , 我们应用农吉利对人体肝癌
体外培养细胞系的某些影响进行了研究 , 介
绍如下 。
材料和方法
农吉利硷为济南人民制药厂 生 产 的粉
剂。 用 o . 0 0 0 o 1N H C I配成 l o m g /m l 储备
液 , 备用 。
B E L 一 7 4 0 2人肝癌体外培养细胞系由 上
海细胞生物学研究所提供 。
培养液 由 R P M一 1 6 4 0 (按配方自行配制)
80 %和 20 %小牛血清组成 , 另加适量青霉素和
链霉素 。
培养操作按陈瑞 铭 等 报 导 的方 法 进
治研究所免疫室 : 启东肝癌研究 65 页 , 1 9 7 7 。
6
、 吴中一等 : 江苏医药 ( 。 ) : s 。 1 9 7 8
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料 ) 。
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.
P r o z e , k y O
.
W
。 : L i v e r P
。
3 5 5 L o n
d o n P i t m a n M e d i e a l 1 9 7 3
1 2
。
D o i l
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: G A N N 6 6 ( 4 )
: 3 8 5一
39 2
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1 9 7 5
1 3
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m e r C e l l s i n V i t r o P
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1 4
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M a e n a b G
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3 4 ( 5 )
. 5 2 9 19 7 6
1 5
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A l e x a n d e r J
。 e t a l . P r e v e n t i o n a n d
D e t e e t i o n o f C a n e e r P
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3 2 1 M e r e a l D e k k
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。
1 9 7 7
1 6
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1 1 5 1 9 5 8
1 7
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C e l l s i n V i t r o P
.
3 9 5 P l e n u m P r e s s N e w
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1 9
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s e o P y i n H u m a n M e d i e i n e V
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: 1 0 7 1 9 7 5
( 收稿 日期 : 1 9 7 9年 5月 2 日 )
肿 瘤 防 治 研 究
行。 c` 3〕
实验 时 , 细 胞 于 计 数 后 , 按 9 万 细
胞 / 3 m l培养液 分装于加有两张小玻片的培
养瓶中 ( 用于细胞生长率计数者不加玻片 ) 。
接种后 4 8小时 , 随机将培养瓶分为对照组和
实验组 。 实验组又按每毫升培养液所含农吉
利硷最终浓度分为 10 0林 g 、 3 0 0林g , 5 0 0卜g三
种剂量组 , 和秋水仙硷 ( o . 6 u g / m l ) 组 。 按
上述分组接液后 , 再置于 37 O C温箱 内 继 续
培养。 第三天和第五天 , 分别取出瓶内的两
张小玻片 。 其中一张用 1。%福尔马林生 理 盐
水固定 , 苏木紫一伊红染色 ( H . E ) , 另一
张小玻片用 C a : n o y 固定 , 甲绿一派罗 宁 染
色 。 对未加玻片的各组进行细胞计数 , 其对
照组计数则逐 日进行。
观察与结果
一 、 H . E染色玻片光学显微 镜 的 .态 形
观察
在光镜下见到对照组细胞绝大多数为多
边形上皮细胞 ,生长旺盛 ,排列紧密而规则 ,
边界清晰 , 大小均匀 ( 图片 1 ) 。 加药 10 o u g
组第三天与对 照 组 比较 无 变 化 。 此 时 ,
30 o u g组显示细胞之间的亲合力减 低 , 细 胞
体积较对照组为大 , 细胞大小也不均匀 , 排
列较乱 , 巨细胞和畸形细胞有所增多 ( 图片
2 )
。
s o o u g组中这些变化更为显 著 。 加药
l o o u g组第五天与 3 0 0 u g组第三天的 变 化类
似 。 此时 , 3 0 o u g组和 s o o u g组则显 示 细胞
体积明显增大 , 排列很乱 , 大小差异大 , 巨
细胞和畸形怪状细胞 占 优 势 , 其中 S O0 u g组
的变化尤为突出 ( 图片 3 、 4 ) 。 这两组 H 、 E
染色片在高培镜下见有许多细胞含有大小不
等 , 多少不一的空泡 ( 图片 5 ) , 有些细胞
含有嗜伊红小体 ( 图片 6 ) , 有 些 细胞 变
园 、 核固缩 、 深染 ( 图片 7 ) , 此外 , 还可
见到无丝分裂 ( 图片 8 ) 和异常有丝分裂以
及大量的各种巨细胞和畸形怪状的细胞 ( 图
片 6 、 9 、 1 0 ) 。
由上述可见 , 人体肝癌细胞系的形态改
变随药物剂量的增加及其作用时间的延长而
加剧 。
二 、 细胞形态指数
各组染色玻片在高倍镜下随机计数 10 0
个细胞 ( 分裂细胞和衰老细胞除外 ) , 按其
形态分为多边形上皮细胞 、 巨细胞和畸形细
胞 ( 包括非上皮样细胞 、 非典型巨细胞和梭
形细胞 ) 三类 。 结果见表 I 。 ·
谈李~一之坚铡最 加 药 后 三 天 加 药 后 五 天细癫~ \ 、户分厂 对 照 1 0 0 u g 3 0 0 u g 50 0 u g 对 照 1 0 0 u g 3 0 0 u g 50 0 u g
多边形细胞 9 3 . 9 0 8 8 . 8 8 78 . 4 1 69 . 6 4 8 9 . 9 7 6 6 . 0 4 4 2 . 4 7 2 0 . 2 4
畸 形 细 胞 4 . 8 5 8 . 3 6 1 3 . 83 1 8 . 9 3 7 . 4 3 2 7 . 56 盯 . 6 0 4 6 . 3 0
巨 细 胞 1 . 2 5 2 . 7 6 7 . 7 6 1 1 . 4 3 2 . 6 0 6 . 4 0 1 9 . 93 3 3 . 4 6
表 I 可见 , 巨细胞和畸形细胞随或物剂
量的增加及其作用时间延长而增多 , 而多边
形上皮细胞则见减少 。
三 、 药物对多边形上皮细胞及其核最小
径的影响
各组染色玻片在高倍镜下随机选取 10 个
视野 , 每一视野用显微镜测微尺分别测量 10
个多边形上皮细胞及其核的最小径 , 求取平
均值 。 结果见表 I 。
表 l 可见 , 细胞及其核的最小径都随药
注 . 观察结果所得数据为三次实验平均值
表 I药物对细胞及其核最小径的影响
阵二粤遭 j弃一蒸一 一…, 花粤些垄粤耳一 .·— 卜竺~竺 一 }竺坚兰 }鲤竺}里塑竺~卜里 -兰 - }婴 {坚…婴细粤最小径 ( u , } ` 5 · 。 } ` 6 · 5 } 2` · 5 1 3 3· 3 } ` 5 · 5 } 2 2 · “ { 3` · 8 { ` “ · `核最 ,J、 径 ` u , { `“ · 2 } ` 2 · 5 】` 5 · 6 { “ · 8 { `” · 5 { `“ · 7 } `” · ` 1 2 3· 5物剂量的增加及其作用时间的延长而增加 ,胞质与核的比例也有较大改变 。四 、 药物对细胞有丝分裂指数的影响
在高倍镜下用 目镜网格分别计数各组染
色玻片上 1 0 0。个细胞 ( 衰老细胞除外 ) , 记
录其中有丝分裂指数 , 其结果见图 1 。
图 1可见 , 细胞有丝分裂指数随药物剂
量的增加及其作用时间的延长而下降 。
加一
} 二 「
,祝硼
`。
111 比弱川
图 2 可见 , 细胞生长率随药物剂量的增
加及其作用时间的延长而下降。
六 、 药物对 细胞 D N A和 R N A 组织化学
的影 响
另一小玻片在用 甲绿一派罗宁染色后 ,
发现其核的浅绿色和胞质的粉红色都随药物
剂量的增加及其作用时间的延长而变浅 。
七 、 秋水仙硷对人肝癌细胞系的影响
细胞在加入秋水仙硷 24 小时后 , 有大量
细胞群处于有丝分裂中期 ( 图片 1 1 ) ; 至第
三天处于分裂中期的细胞大部脱落 , 且见一
些间期细胞 ( 图片 12 ) ; 至第五天 , 只见少
数残存的 、 形状不规则的细胞 。也。只9临30户\D腿吕O杯9惨理渗姆犯沁协
喊砂令娇军十司吐敏令。吕一
。 药后三天 砂 力。药石五夭
五 、 药物对细胞生长率的影响
对照组细胞数逐 日用白血球 计 数 盘 计
数 , 而各实验组则在加药后第三天和第五天
时进行计数 , 其结果如图 2 。
对嘛组
一0 0叼够
瓣
讨 论
通过药物对癌细胞与正常细胞作用的比
较 , 对癌症化疗提供了实验资料 , 同时 , 对
探讨药物的抗癌 、 致毒作用及其原理也具有
重要意义 。 本实验证明 , 农吉利硷对人肝癌
细胞系有显著影 响 , 与文献中〔 7一 ,幻关于 农
吉利硷及其同类化合物对人胚肝细胞系 、 大
鼠肝再生细胞以及体内给药对实验动物肝组
织的有关影响一致 。 它表明 , 农吉利硷对人
肝癌细胞的影响及其对正常肝细胞的作用可
能是同一 的 。
农吉利硷对人肝癌细胞影响的一个重要
表现是细胞形态发生显著改变 。 这可能与其
直接损害细胞亚微结构及其代谢过程有关 。
A r m “ tr o n g 〔 8 、 ”〕用电镜观 察 到 在 向 阳紫
草硷 ( L a s i o e a r p i n e ) 的作用 2 小时 后 ,
人胚肝细胞核内及核膜均有小块状染色质聚
集 , 有些细胞核仁消失 , 线粒体肿胀 ; 4 小
的.和即二走刁健思分.
oxrl)价洲拍书浓
2 3 斗 5
肿 瘤 防 治 研 究
时后线粒破碎 、 高尔基复合体和 内 质 网 肿
胀 , 核膜不完整 。 大 鼠给予猪屎豆属植物提
取物 3 小时后 , 肝小叶中心区细胞开始失去
糖原 , 9 小时后细胞线粒体肿胀 并 出 现 脂
滴 , 14 一 20 小时后某 些 以N A D ( 辅酶 I )
为辅酶的酶活性消失 , 出现细胞坏死 。 我们
曾给小自鼠腹腔注射 3 / S L D 。 。农 吉 利 硷 9
天后 , 其肝组织谷丙转氨酶活性较对照组高
一倍以上 , 其耗氧量也显著 增 加 。 由 此 看
来 , 这类生物硷对肝细胞及其代谢过程有直
接毒害作用 。 很可能大剂量时即 引 起 细 胞
坏死 , 较小剂量时导致肝细胞慢性退行性损
害 。
巨细胞是农吉利硷及其同类化合物对人
肝癌细胞损害的另一种主要表现〔“ 、 “ 、 2 6〕这
类化合物不仅能使体外培养的细 胞 系 产 生
巨细胞 , 而且不论是小剂量多次重复注射还
是大剂量一次给药一般 都 在 给 药 3 一 4 周
后 , 实验动物肝组织可出现 巨 细 胞 。 关于
巨细胞的成因有三种说法 , 即细胞融合 、 核
分裂胞质不分裂和 D N A再复制。 人肝 癌 细
胞可经多极有丝分裂细胞相互融合成为巨细
胞 〔’ 4〕 , 但是在药物作用下有丝分裂减 少 而
生成的巨细胞却比对照组高 26 . 7倍 。 因此细
胞融合并非农吉利硷引起 巨细胞 的 主 要 原
因 , 巨 细 胞 也 不是 由于核分裂所致 。 产生
巨细胞最可能的原因是由于 D N A 的再复制 。
A l le n等发现巨细胞中 R N A和蛋白质的含量
与对照组相同。 而其 D N A 的含量却比 对照
组高 2 0 0%〔 `“ 〕 。 S u l lxn a n等 C`。〕证明向阳紫草
硷几乎能完全抑制细胞的有丝分裂 , 但不抑
制D N A 合成 。 他们用选择性抑制剂 和同位
素标记证明 , 封阻细胞有丝分裂的位置位于
D N A 合成后期 , 即 S期末或 G : 早 期 , 表明
这类生物硷不影响或不直接 影 响 D N A 的合
成 , 而只是阻止 S期合成的 D N A 不能或不完
全能进入 M期而成为 巨细胞 。
农吉利硷另一主要影响是抑制细胞有丝
分裂及其生长率 。 这些影响固然 与 上 述 作
用原理相关 , 但是在生物硷的作 用 下 细胞
R N A 蛋 白质合成障碍以及它们与 D N A 分子
相互作用可能是基本原因 。 H ar r is 等〔 2 ,〕证
明给实验动物一次口 服 或 腹 腔 注 射 近 于
L D
。 。的向阳紫草硷 15 分 钟 后 , 其 肝 组 织
R N A 和蛋白质 的合成 即降至对照组的 30 % ,
一小时后只有对照组的 6%。 在农吉利硷哟咯
衍生物的作用下人胚肝细胞D N A 、 R N A 、
蛋白质的合成均被抑制 , 对后二者的作用出
现得迅速而明显 , 对前者的作用则出现得缓
慢而微弱 。 本工作中 D N A 和 R N A组织化学
的结果似乎 一也支持这种观点 。
农吉利硷及其同类化合物转变为相应的
哟咯衍生物 ( 即其脱氢产物 ) 已为许多工作
所证实 c Z、 3 、 “ 2 、 2 3 、 2 5 、 2 7〕。 这种衍生 物 可
选择性地烷化细胞 D N A 分子上的特定区域 ,
而 阻止细胞 由S期进入M期〔“ 了〕 ; 也可以烷化
N A D分子 (辅酶 D上的尼克酞胺 , 而导致细
胞生物氧化障碍 〔“ “ 〕 ; 还 可作用于核糖体以
干扰蛋 白质的生物合成以及嵌入 D N A 分 子
的特定部位与之形成复合体 ,从而抑制D N A
复制和 D N A 转录 。
值得注意的是在农吉利硷及其同类化合
物的作用下人胚肝细胞 、 人肝癌细胞的上述
改变一般出现得迅速而明显 。 这可能是由于
这些细胞对药物有较高的敏感性所致。 如果
是这样 , 那么就不能排除利用正常细胞和肝
癌细胞二者对药物敏性的差异来治疗肝癌的
可能性 。
( 本工作承蒙上海细 胞生物 学研 究所 、
北京市肿瘤研完所支持和指导 , 谨致谢忱 l)
主要参考文献从略
习交稿 日期 : 1 9 7 9年 7 月 2 日
图 1对照组 , 绝大多数为多边形上皮细胞 , 排列规则 , 大 小 比 较均 匀 , 边 界 清 晰
( H
.
E x 10 0 火 3 )
图 2 加农吉利硷 3 O 0u g第三天 , 与对照组相比 , 细胞增大 , 排列较 乱 , 大 小 也 不 均
匀 , 细胞间亲合力减弱 , 畸形细胞和巨 细胞增多 ( H . E x l 0 x 3 )
图 3 加农吉利硷 3 0 0 u g第五 天 , 与图片 2 比较细胞更增大 、 排列更乱而松疏 , 细胞 界
限不清 , 大小差异更大 , 巨细胞和畸形细胞更大更多 ( .H E x l 。。 x 3 )
图 4
图 5
加农吉利硷 5。 。 u g 第五天 , 巨细胞和畸形细胞 已占多数 , 还可见到变园深染的 细
胞 ( 日 . E x 10 0 x 3 )
加农吉利硷 5 。 。 u g第五天 , 细胞呈蜂窝状空泡 ( H ` E x 4 0 x 3 )
图 6 加农吉利硷 3。 。 u g 第五天 , 示细胞畸形怪状和细胞质内 有 园 形 的 嗜 伊 红 小 体
( H
.
E x 4 0 0 X 3 )
图 7 加农吉利硷 5 0 u g第五天 , 示有些细胞变园 , 核浓缩 、 深染 ( H . E 火 4 。。 火 3 )
图 8 加农吉利硷 5 。。 u g第三天 , 示细胞无丝分裂 ( H . E X 40 。 欠 3 )
图 9 、 1。 加农吉利硷。 o o u g第五天 , 示 巨细胞 ( H . E x 4 ` 9 x 3 )
图 一]
图 .咚
加秋水仙硷 ( 。 . 6 u g / m l ) 2 4 小时 , 示有丝分裂中期细胞群 ( H . E x 40 o x 3 )
加秋水仙硷第三天 , 有丝分裂中期细胞已大部脱落 ( H . E 义 40 O X 3 )