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蒲公英糖蛋白的体外抗氧化研究
钟!洁!段玉峰!陈!双
!陕西师范大学食品工程与营养科学学院陕西西安 $&’-#
摘%要目的&提取$纯化并研究蒲公英糖蛋白的体外抗氧化作用% 方法&经热水浸提$脱脂$纯化等方法得到蒲公英糖
蛋白’通过W0- . $.WR自由基清除体系以及还原力分析体系研究了蒲公英糖蛋白的体外抗氧化活性% 结果&蒲公
英糖蛋白能够清除W0- . $.WR自由基具有一定的还原能力% 结论&蒲公英糖蛋白具有明显的体外抗氧化活性但
其抗氧化活性小于bG%
关键词蒲公英纯化糖蛋白体外抗氧化
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中图分类号?1-&+-%%%%文献标识码I%%%%文 章 编 号&-0!’#-J$J0&H-0!
收稿日期-K0&-0!%通讯联系人
作者简介钟洁!&JK&0#硕士研究生研究方向&食品功能成分开发
与利用%
%%蒲公英(5-,-G-)$%%’(.’#*)$%H-(C+0(*OO+)别
名黄花地丁婆婆丁黄花三七!属菊科植物# 蒲公
英营养丰富!药用价值高!现代药理研究表明!其具
有抗氧化$&% 清热解毒$-%等多种药用功效!还具有抗
肿瘤降血脂免疫调节$!%及抗氧自由基等作用$#% #
蒲公英既可作为全草入药!又可作为佳蔬食用!是一
种珍贵的菜药兼用型植物# 据*本草纲目+记载’,蒲
公英嫩苗可食!生食治感染性疾病尤佳#-蒲公英有
丰富的营养价值!含有蛋白质脂肪碳水化合物微
量元素及维生素等$H% # 但目前对蒲公英的研究仅涉
及到总黄酮绿原酸色素等方面# 本文研究了蒲公
英粗糖蛋白的纯化以及体外抗氧化活性!旨在为蒲
公英药品和功能食品的开发提供参考#
;!材料与方法
;<;!材料与仪器
蒲公英%来源于西安市中药材市场!经鉴定&
eiIi0H- 纤维素三羟基甲基氨基甲烷(?E=F)铁氰
化钾$4!:3(GB) ’)%三氯乙酸(?GI)邻苯三酚(焦
性没食子酸)三氯化铁(:3GA!)双氧水硫酸亚铁
乙酸葡萄糖水杨酸浓盐酸无水乙醇%均为国产
分析纯试剂#
?’- 可见紫外分光光度计%北京普析通用仪器
有限责任公司&)R1-#G?酸度计%上海康仪仪器有
限公司&)6-! 电子天平%梅特勒0脱利多仪器(上
海)有限公司&RR_0-&GC0’ 电热恒温水槽eQ:0&
型真空冷冻干燥机%上海福玛实验设备有限公司&
?e6-#离心机%上海安亭科学仪器厂&Mi0H-II旋转
蒸发器%上海亚荣生化仪器厂&$KR_0& 恒温加热磁
力搅拌器%杭州仪表电机有限公司&4m!-‘型超声
波清洗机%昆山市超声仪器有限公司&4eT0JK& 凯
氏微量定氮仪%上海贝特仪电设备厂&透析袋(分子
截留量 K[&#)%美国 1=/,*公司#
;<=!实验方法
&+-+&%蒲公英的预处理%将蒲公英在 ’Y下烘干!
粉碎至 - 目# 依次用石油醚和 KV乙醇回流至无
色!风干得脱色脱脂原料粉!在干燥皿中贮存备用#
&+-+-%蒲公英糖蛋白的提取
&+-+-+&%热水浸提%准确称取经预处理的蒲公英 H/!
置于 &,6烧杯中!于电热恒温水槽中’Y提取 H@!
(*#
真空抽滤!重复提取 -次!弃去残渣!合并滤液!浓缩#
&+-+-+-%脱蛋白%将浓缩液移入 H,6的烧杯中!向
烧杯中加入 13D*/$’%试剂(三氯甲烷X正丁醇(b.b) ^
HX&)!放到磁力搅拌器上搅拌 -,=>!然后移至分液
漏斗中静置 -@!分离界面以下的液体# 按此方法重
复 ’ 次# 在除蛋白的提取液中加入无水乙醇!产生
沉淀!将沉淀物装入预处理过的透析袋里!用自来水
透析 #K@!再用蒸馏水透析 &-@!然后冷冻干燥后可得
到淡黄色粉末!即为粗糖蛋白#
&+-+!%糖蛋白的纯化%蒲公英糖蛋白的纯化依照文
献$$%中的方法稍作修改!用 eiIi0H- 纤维素柱层
析对粗糖蛋白进行纯化# eiIi0H- 纤维素 &/于
-HY环境中!用 & 倍体积的蒸馏水浸泡 -#@!充分溶
胀后!依 ,碱酸碱-的顺序处理纤维素!使纤维素
带WR0离子!可与带负电荷的糖蛋白阴离子进行交
换# 湿法装柱(离子交换柱规格 -+’ a#<,)!再用蒸
馏水平衡 &;# 提取得到的粗糖蛋白用蒸馏水配成浓
度为 !V(_.b)的样液后!上样量为 &,6!分别用蒸
馏水+&,8A.6B*GA+-,8A.6的B*GA洗脱&洗脱速度
为 +H,6.,=>!每管 &,6分管收集!紫外可见分光光
度计仪检测 -K>,处的蛋白质吸收峰!同时用苯酚0
硫酸法检测 #J>,处的糖吸收峰# 收集多糖和蛋白质
重叠的对称峰!浓缩透析冷冻干燥得糖蛋白纯品#
&+-+#%糖含量及蛋白含量的测定%糖含量’苯酚0硫
酸法$K% !以葡萄糖为标品&蛋白含量’凯式定氮法$J% #
&+-+H%糖含量测定中标准曲线的绘制
&+-+H+&%标准溶液的配制%精确称取 #,/葡萄糖标
准品!加蒸馏水溶解!定容至 &,6!得到浓度
#!/.,6的葡萄糖标准溶液#
&+-+H+-%标准曲线的绘制%分别移取葡萄糖标准溶
液 +#+’+K&+&+-&+#&+’&+K ,6置于 K 支试管
中!加水至 -,6!再加 HV的苯酚 &,6!摇匀!同时迅
速加入浓硫酸 H+,6!摇匀后置室温下反应 !,=>!于
#J>,处测吸光值!以吸光度为纵坐标!以葡萄糖的
浓度为横坐标!绘制标准曲线!并计算得出回归方
程’T ^+&-Kjd+&’!M- ^+JJ#J#
&+-+’%抗氧化活性的检测
&+-+’+&%清除超氧阴离子自由基(W0- 1)能力的测定
%采用邻苯三酚自氧化法$&% # 取 PR为 K+&- 的 ?E=F
0RGA缓冲液 ’,6和 +H,6蒸馏水!混匀!!$Y水浴
&,=>!加入 !$Y预热过的 $,,8A.6邻苯三酚盐酸溶
液()M) &,6!迅速摇匀!混匀后精确反应 #,=>!用
+H,6浓盐酸终止反应!测 !-H>,处吸光度值 I#
取 PR为 K+&- 的 ?E=F0RGA缓冲液 ’,6!分别加入不
同质量浓度的蒲公英糖蛋白溶液 +H,6!!$Y水浴
&,=>!最后加入 !$Y预热过的 $,,8A.6邻苯三酚盐
酸溶液()M)&,6!迅速摇匀!混匀后精确反应 #,=>!
用 +H,6浓盐酸终止反应!测 !-H>,处吸光度值 I#
清除率(;)计算公式如下’
超氧阴离子自由基 (W0- 1)清除率 ; (V) ^
(I0I).I a&V
&+-+’+-%对羟自由基(1WR)的清除作用%采用水杨
酸法$&&% !在 &,6的试管中依次加入 ’,,8A.6的
:31W# -,6以及 -,6不同浓度的糖蛋白溶液!
’,,8A.6的R-W- 溶液 -,6!摇匀!静置 &,=>!再加
入 ’,,8A.6的水杨酸溶液 -,6!摇匀!静置 !,=> 后
于 H&>,处测定吸光值!以 bG作阳性对照!按下式
计算羟自由基的清除率(;)’
1WR自由基的清除率(;V) I^0(I10Ij).I
a&V
式中’I0不加样品溶液的吸光值&IF0加入样
品溶液反应后的吸光度&Ij0不加水杨酸溶液时蒲
公英糖蛋白的吸光度#
&+-+’+!%还原能力的测定%一般情况下!样品的还原
能力与抗氧化活性之间有显著的相关性# 样品反应后
的生成物在 $>,处的吸光度的大小即反映了其抗
氧化能力的大小!吸光度值越大!则样品的还原能力越
强# 蒲公英糖蛋白的还原力测定依照文献$&-%进行!
于 &,6不同浓度的蒲公英糖蛋白溶液中加入 -+H,6!
+-,8A.6!PR’+’的磷酸盐缓冲液和 -+H,6!&V的铁氰
化钾溶液!HY水浴 -,=>!加入 -+H,6!&V的三氯乙
酸(?GI)溶液!!E.,=> 离心 &,=>!取 -+H,6的上
清液!加入 -+H,6蒸馏水和 +H,6:3GA!(+&V)!以bG
为阳性对照!于 $>,处测定吸光值#
&+-+’+#%糖蛋白的稳定性实验$&!%%取待测样品溶液!
按样品溶液测定方法操作!用紫外0可见光分光光度
计测定其吸光度!所测定时间间隔为 &!H$J
&-@# 以所得的吸光度作为考察因素!以此衡量蒲公
英糖蛋白的稳定性#
=!结果与分析
=<;!样品中多糖含量的测定
吸取蒲公英糖蛋白样品液 &,6(+&,/.,6)!按
照 &+-+H 中的步骤操作!以不加样品的溶液为空白对
照!于 #J>,处测吸光值!代入回归方程即可计算出
多糖的含量!测定值为 #$+&#V#
=<=!样品中蛋白质含量的测定
利用凯氏定氮法测定糖蛋白中的蛋白含量!结
果为 -+!$V#
=<>!清除超氧阴离子自由基#UG=($能力的测定
由表 & 可见!蒲公英糖蛋白能够明显地清除
W0- 1!且呈量效关系!其 LGH ^+--JH,/.,6!在质量
浓度为 +H,/.,6时!bG的清除能力为 -H+H#V!蒲
公英糖蛋白的清除能力为 &!+JV!说明蒲公英糖蛋
白具有一定的体外抗氧化活性!但比bG低#
表 &%蒲公英糖蛋白清除W0- 1的能力(; f1e)
样品名称 浓度(,/.,6) 清除率(V)
阴性对照 0 0
蒲公英糖蛋白
+H &!+J f+K
+& -!+&- f+&K
+&H !-+’ f+K&
+- %#J+’J f+- --
+-H H$+-K f+&-
+! ’#+&# f+!-
+!H $!+-$ f+#
+# K+&J f+#H
bG +H -H+H# f+$
!下转第 &H$ 页#
($#
究(U)+食品与药品-$J!&-#&&&0&-+
(’)张剑波时春娟付杰 +茁霉多糖生物合成的研究进展
(U)+天然产物研究与开发-’&K&&#&0&#$+
($)陈波蒲刚军+出芽短梗霉的发酵性能研究(U)+食品科技
--!&&#&&H0&$+
(K)周文化唐冰钟秋平+短梗霉多糖的微生物发酵及其在
食品工业中的应用(U)+食品与机械-#-!H#&H’0HJ+
(J)付湘晋童群义+短梗酶多糖的研究(U)+食品研究与开发
-H-’!-#&&’0-&+
(&)鞠宝陈永珉林剑等+二价阳离子对短梗霉多糖发酵
的影响(U)+生物技术-&!##&!&0!!+
(&&)贺红星张霁红赵瑛等+苯酚0硫酸法测定普鲁兰含量
(U)+农产品加工.学刊-$!&-#&&H0&J+
(&-) 王长海李艳红+短梗霉发酵液变黄原因研究(U)+烟台
大学学报&自然科学与工程版&JJK&-!##&&H0&J+
(&!)康建雄唐赢中+普鲁兰的研究与开发进展(U)+武汉城市
建设学院学报&JJ’&!!!#&
$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$
’0’’+
!上接第 &H! 页#
=
-d ^:3!d dWR0 d
1WR!产生羟基自由基!若在反应体系中加入水杨
酸!就能有效地捕捉1WR!并产生有色产物 -!!0二
羟基苯甲酸!该产物在 H&>,处有强吸收!以1WR
氧化水杨酸钠所得产物的吸光值表示1WR的大小!
吸光值越大!1WR越多# 结果如表 - 所示!在
+H[&+$,/.,6的质量浓度范围内!其清除羟自由基的
能力随着浓度的增大而增强!其LGH &^+-#,/.,6!由
此可见!蒲公英糖蛋白有较强的清除羟自由基的能
力!在质量浓度为 +H,/.,6时!对羟自由基的清除
能力为bG的 &.&+K& 倍#
表 -%蒲公英糖蛋白对羟自由基的清除能力(; f1e)
样品名称 浓度(,/.,6) 清除率(V)
阴性对照 0 0
蒲公英糖蛋白
+H &’+J! f+&-
+$ -$+#& f+&&
+J !K+$ f+&$
&+& #$+KH f+&’
&+! H#+-J f+-H
&+H ’-+’K f+&#
&+$ $&+$& f+--
bG +H !+#J f+&$
=
原能力!但要在较大浓度(+&H,/.,6)时才能有较强
的还原力!与bG相比较!其还原能力较弱#
表 !%蒲公英糖蛋白的还原能力(’If1e)
样品名称 浓度(,/.,6) I$>,
蒲公英糖蛋白
+H +’$ f+&&
+$ +K& f+-&
+J +KK f+&
+&& +JJ f+&!
+&! +&K f+J
+&H +&&- f+-
bG
+H +JH f+--
+$ +&#- f+&!
+J +&J f+&-
+&& +--J f+-&
+&! +!-& f+&
+&H +!’J f+!
=
种稳定性较高的活性物质#
表 #%蒲公英糖蛋白的稳定性
时间(@) & ! H $ J &-
吸光度 +&-K +&-$ +&-$ +&-K +&-$ +&-’ +&-$
>!结论
体外抗氧化活性测定结果显示!蒲公英糖蛋白
对羟基自由基(1WR)超氧阴离子自由基(W0- 1)
均有较好的清除能力&半数清除率 LGH 分别为
+--JH,/.,6和 &+-#,/.,6# 在一定的浓度范围内
对二者的清除作用呈现良好的量效关系!且有一定
的还原能力&蒲公英糖蛋白的体外抗氧化活性低于
bG&蒲公英糖蛋白有较强的清除自由基和抗氧化活
性!是一种稳定性较高的活性物质!作为抗氧化剂和
保健食品进行开发利用具有较高的研究价值#
参考文献
(&) 赵守训杭秉倩+蒲公英的化学成分和药理作用(U)+中国
野生植物资源-&-!!#&&-!+
(-) 齐仁立张慧茹崔斓斓+蒲公英抑菌成分提取工艺的优
化(U)+安徽农业科学-$!H!&$#&H!K0H!J+
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学院学报&JJ$--!-#&&!$+
(#) 金政金松竹李相伍+蒲公英对衰老大鼠脑组织氧自由
基相关指标的影响(U)+中国医药科技--J!-#&JJ+
(H) 袁瑾钟华姚宗仁等+野生植物蒲公英营养成分的研究
(U)+氨基酸和生物资源-’-K!-#&--0-!+
(’) 闫巧娟韩鲁佳江正强+酶法脱除黄芪多糖中的蛋白质
(U) +食品科技-#!’#&-!0-’+
($) 丁青芝马海乐骆琳等+山药糖蛋白的分离纯化与鉴定
(U)+食品科学-K-J!$#&-&$0-&J+
(K) 罗毅潘细贵刘刚等+苯酚0硫酸法测定多糖含量显色方
式的优选(U)+中国中医药信息杂志 -H&-!&#&#H0#’+
(J) 宗留香肖青苗康怀彬+半微量凯氏定氮法测定蛋白质
消化工艺的改进(U)+食品工业科技-$!H#&-!-0-!#+
(&) 刘锡建+沙棘果渣总黄酮的提取$精制和抗氧化性能的
研究(e) +北京&北京化工大学-#+
(&&) 1,=E8>9B GN,73Fm U+R5E8j5AE*;=<*AF<*D3>/=>/
*<2=D=2589<8,P*2=7A3F8AN23F(U) +)@528<@3,=F2E5&JKJ-K&&H$0
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*A/*i
&’H0&$#+
(&!) 王东林力袁昌鲁等+车前子多糖含量的分析(U)+中
草药--!&#&KJ’0KJ$+