全 文 ：酶标仪测定不同产地、不同组织部位紫花地丁总糖和还原糖
何 芳， 王 钦， 张 春*
(泸州医学院药学院，四川 泸州 646000)
收稿日期:2013-02-17
基金项目:国家自然科学基金项目 (81001700) ;四川省教育厅科研项目 (11ZB124) ;四川省卫生厅科研项目 (120385)
作者简介:何 芳 (1987—) ，女，硕士生，从事化学生物学。Tel:15228277067，E-mail:624175710@ qq． com
* 通信作者:张 春 (1983—) ，女，副教授，理学博士，从事分子生药学、药用植物资源与利用等。Tel:15196088137，E-mail:
zc83good@ 126． com
摘要:目的 比较不同产地、不同组织部位紫花地丁中多糖和还原糖量，为指导采收和进一步利用提供依据。方法
采用 L9(3
4)正交试验，以料液比、提取温度和盐酸浓度为影响因素，通过蒽酮硫酸法结合全功能酶标仪，在 628 nm
处测定，计算其总糖和还原糖的量。结果 最佳水解条件为 15% (W /V)的盐酸，1 ∶ 50 的料液比，100 ℃水解。紫
花地丁根部位的总糖和还原糖量最高，叶中量最低。泸州产紫花地丁中含有具生物活性的糖类物质高于自贡产地。结
论 以紫花地丁中的具生物活性的糖类物质为指标，果期采收质量较佳。
关键词:紫花地丁;不同产地;总糖;还原糖;酶标仪
中图分类号:Ｒ284. 1 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2013)11-2480-04
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2013. 11. 038
Determination of total sugar and reducing sugar in Viola yedoensis from different
parts and habitats by microplate spectrophotometer
HE Fang， WANG Qin， ZHANG Chun*
(School of Pharmacy，Luzhou Medical College，Luzhou 646000，China)
KEY WOＲDS:Viola yedoensis Makino;habitats;total sugar;reducing sugar;microplate spectrophotometer
紫花地丁 Viola yedoensis Makino 为堇菜科堇菜
属植物，广泛分布于全国大多数地区。早在 《本
草纲目》就有紫花地丁药用记载，其味苦、辛、
寒。具有清热解毒，凉血消肿，清热利湿的作用。
紫花地丁化学成分丰富，全草含苷类、黄酮类、挥
发油、蜡酸、内酯及不饱和酸等［1-4］。糖也是紫花
地丁中主要成分之一，其多糖具有广泛的药理及生
物活性，如免疫促进、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、调
节巨噬细胞功能等作用［5-9］。其所含的磺化聚糖能
抑制艾滋病毒活性而备受关注［10］。以往虽有对紫
花地丁中总糖及还原糖定量测定的报道［11］但并没
有探讨不同产地的紫花地丁中糖的含有量情况。由
于紫花地丁分布广泛，且不同生态环境下其外形特
征稍有变化，因此本实验对不同产地紫花地丁各部
位的总糖及还原糖测定，对指导紫花地丁合理采收
和开发利用紫花地丁药用资源提供一定的依据。
蒽酮-硫酸法测定植物总糖是常用方法，该法
操作简单、迅速、重复性好，但由于其稳定性较
差，而限制其应用［12］。采用紫外分光光度计进行
操作，试剂用量大、消耗时间长，使得其测定存在
较大误差［13］。本实验利用蒽酮-硫酸法，使用全波
长酶标仪，高效、快速地测定了自贡和泸州两个产
地紫花地丁不同组织部位的总糖及还原糖的量。实
验中使用随行标准曲线，使得测定的数据更加真实
可靠。通过正交试验，确定了蒽酮-硫酸法测定紫
花地丁中总糖的最佳提取和测定条件。
1 材料与仪器
材料采自泸州和自贡 2012 年 3 月份产的紫花
地丁，经泸州医学院生药教研室税丕先教授鉴定。
其根、叶、花、果实经烘干后，磨粉过 60 目筛
备用。
Infinite M200 全 功 能 酶 标 仪 (TECAN) ;
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Biofuge Stratos 高速冷冻离心机 (Heraeus) ;GL-
SSB漩涡混合器 (海门市其林贝尔仪器制造有限公
司) ;移液枪 (eppendorf) ;ES-120 电子天平 (沈
阳龙腾电子仪器有限公司) ;HH—W420 数显三用
恒温水箱 (金坛市医疗仪器厂) ;Elix3 /Milli-Q
Biocel 超纯水仪 (MILLIPOＲE) ;SIM—F140 制冰
机 (SANYO)。
使用试剂均为分析纯 (AＲ 试剂)。蒽酮-硫酸
溶液的配置:称取0. 080 0 g蒽酮于 50 mL 的棕色
锥形瓶中，加 98%浓硫酸定容至刻度，超声混匀，
现配现用。
2 方法与结果
2. 1 吸收光谱波长的选择 精密称取 105 ℃干燥
至恒定质量的无水葡萄糖 0. 025 0 g于 250 mL量瓶
中配制成 0. 1 mg /mL 的葡萄糖标准液。葡萄糖标
准液与蒽酮-硫酸试剂显色稳定以后在 Infinite M200
全功能酶标仪上从 800 ～ 200 nm波长范围内自动扫
描。葡萄糖标液与显色剂反应后在 628 nm 处有最
大吸收峰，故本实验采用 628 nm为吸收波长。
2. 2 标准曲线的绘制 分别吸取 0、0. 1、0. 2、
0. 3、0. 4、0. 5、0. 6 mL葡萄糖标准液，再分别加
入 1、0. 9、0. 8、0. 7、0. 6、0. 5、0. 4 mL 蒸馏水，
冰水浴下分别加入 4 mL 蒽酮-硫酸溶液，煮沸 10
min进行显色测定。以葡萄糖质量浓度 C 对吸光度
A作回归处理。为克服蒽酮-硫酸法测定的稳定性
问题，本实验分别在提取条件的确立、验证试验、
加样回收率试验、总糖及还原糖的测定及重复性试
验、精密度试验中，做了 4 条随行标准曲线。
2. 3 提取条件的确立 采用 L9(3
4)正交试验，
考察 3 个影响因素 ［料液比、盐酸浓度 (W /
V)%、水解温度℃］对试验的影响，因素水平见
表 1。随行标准曲线 1 的回归方程:A = 3. 385C +
0. 063，r2 = 0. 996 3，糖质量浓度在 0 ～ 0. 1 mg /mL
范围内，线性关系良好。正交试验结果见表 2，方
差分析见表 3。
表 1 紫花地丁水溶性总糖提取因素水平
Tab. 1 Factors and levels of total sugar extraction in Viola
yedoensis
水解温度 /℃ 盐酸浓度 /% 料液比
30 5 1 ∶ 30
60 10 1 ∶ 50
100 15 1 ∶ 70
实验结果可知，影响总糖量条件的主次关系为
料液比 ＞提取温度 ＞ 盐酸浓度，其中提取温度和
表 2 正交试验结果
Tab. 2 Ｒesults of orthogonal test
编号
提取
温度 /℃ 料液比 盐酸
/% 空白列 含糖
量 /%
1 30 1 ∶ 30 5 1 12. 24
2 30 1 ∶ 50 10 2 13. 20
3 30 1 ∶ 70 15 3 7. 08
4 60 1 ∶ 30 10 3 15. 40
5 60 1 ∶ 50 15 1 19. 84
6 60 1 ∶ 70 5 2 8. 28
7 100 1 ∶ 30 15 2 22. 12
8 100 1 ∶ 50 5 3 18. 12
9 100 1 ∶ 70 10 1 9. 80
k1 10. 840 16. 587 12. 880 13. 960
k2 14. 507 17. 053 12. 800 14. 533
k3 16. 680 8. 387 16. 347 13. 533
Ｒ 5. 840 8. 666 3. 547 1. 000
表 3 方差分析 (α =0. 05)
Tab. 3 Analysis of variance (α =0. 05)
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性
提取温度 52. 273 2 34. 595 19. 000 *
料液比 142. 569 2 94. 354 19. 000 *
盐酸浓度 24. 603 2 16. 283 19. 000
误差 1. 51 2
料液比对提取效果有显著影响，实验最佳提取条件
为提取温度 100 ℃，料液比 1 ∶ 50，盐酸浓度 15%
(W /V)。
2. 4 验证试验 按优选出的紫花地丁总糖提取工
艺，制备样品溶液:精密称量泸州紫花地丁叶
0. 250 0 g，按 1 ∶ 50 加入 15% (W /V)盐酸，100
℃，反应 30 min 后，将反应瓶置于冰水中，冷却
后离心，吸取上清，用 20% NaOH，pH 调至 5 ～
7。将提取液稀释 20 倍后，取 1 mL，冰水浴下加
入 4 mL 蒽酮溶液，煮沸 10 min，冷却后，吸取
200 μL反应后溶液于 96 孔板中，用酶标仪测定
A628。随行标准曲线 2 的回归方程:A = 3. 534C +
0. 043，r2 =0. 997 9，糖质量浓度在 0 ～ 0. 1 mg /mL
范围内，线性关系良好。共测定 6 次，总糖含有量
分别 为 15. 47%、 15. 39%、 15. 87%、 15. 43%、
15. 20% 和 15. 55%，含总糖量平均值 15. 48%，
ＲSD =1. 43%，表明该方法符合要求。
2. 5 重复性试验 精确称量自贡叶各0. 125 0 g，
共 5 份，按 15% (W /V)盐酸 25 mL，100 ℃条件
下提取其总糖。按 2. 4 项方法进行测定，利用随行
标准曲线 3 计算。共测定 5 次，总糖量分别为
16. 21%、15. 90%、15. 64%、16. 04%和 15. 80%，
总糖平均量 15. 92%，ＲSD为 1. 38%，表明重复性
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较好。
2. 6 稳定性试验 取泸州采集叶片提取液和 0. 1
mg /mL葡萄糖标准液各 1 mL，冰水浴下加入 4 mL
蒽酮溶液，煮沸 10 min，用酶标仪每隔 10 min 测
定 A628，共测时间 140 min。测定结果显示，提取
液和葡萄糖标准液吸光度值在 10 ～ 40 min 较稳定，
平均吸光度值分别为 0. 598 6 与 0. 341 1;50 ～ 100
min分别在 0. 614 2 ～ 0. 543 0 与 0. 368 1 ～ 0. 317 3
范围内出现较大波动;100 min 以后，吸光度值都
明显降低 0. 100 0 左右。因此提取液显色后应在
10 ～ 40 min内测定吸光度，以减少误差。
2. 7 精密度试验 精确称量泸州样品的叶 0. 250 0
g，共 5 份，于 100 mL 锥形瓶中，按 2. 4 项方法，
用酶标仪测定 A628，随行标准曲线 4 的回归方程为
A = 4. 1446C + 0. 196 2，r2 = 0. 994 0，糖质量浓度
在 0 ～ 0. 1 mg /mL范围内，线性关系良好。共测定
5 次，总糖量分别为 15. 20%、14. 91%、14. 98%、
15. 07%、15. 26%，ＲSD =0. 97%，精密度良好。
2. 8 水溶性总糖的提取与测定 精确称量自贡和
泸州的紫花地丁根、叶、花、果实各 0. 250 0 g，
共 8 份，根据确定的最佳提取结果:15% (W /V)
盐酸 50 mL，100 ℃，反应 30 min 后，按 2. 4 项方
法进行测定。随行标准曲线 3 的回归方程为 A =
3. 840 6C + 0. 203 3，r2 = 0. 9962，糖质量浓度在 0
～ 0. 1 mg /mL范围内，线性关系良好。结果见表 4。
表 4 不同产地紫花地丁总糖测定
Tab. 4 Determination results of total sugar from
different habitats
样品
总糖 /%
根 叶 花 果实
自贡 35. 86 15. 82 16. 01 21. 60
泸州 53. 63 14. 90 21. 43 19. 38
2. 9 水溶性还原糖的提取和测定 精确称量自贡
和泸州紫花地丁根、叶、花、果实各 0. 250 0 g，
共 8 份，提取条件:加水 50 mL，100 ℃，反应 30
min后，将反应瓶置于冰水中，离心，吸取上清，
用 20% NaOH调 pH至 5 ～ 7。将提取液稀释 20 倍
后，取 1 mL，冰水浴下加入 4 mL蒽酮溶液，煮沸
10 min，冷却后，吸取 200 μL反应后溶液于 96 孔
板中，用酶标仪测定 A628。利用随行标准曲线 3 计
算结果见表 5。自贡和泸州两个产地紫花地丁中还
原糖占总糖量的百分比见表 6。
2. 10 加样回收率测定 精确称量已知总糖含有量
的泸州样品叶 0. 250 0 g，共 9 份，于 100 mL锥形
表 5 不同产地紫花地丁还原糖测定
Tab. 5 Determination results of reducing sugar from dif-
ferent habitats
样品
还原糖 /%
根 叶 花 果实
自贡 32. 85 10. 71 14. 12 13. 29
泸州 23. 61 8. 49 12. 62 8. 712
表 6 不同产地紫花地丁还原糖含量占总糖的百分比
Tab. 6 Percentage of reducing sugar and total sugar from
different habitats
样品
(还原糖 /总糖) /%
根 叶 花 果实
自贡 91. 61 67. 70 88. 19 61. 53
泸州 44. 02 56. 98 58. 89 44. 95
瓶中，按 2. 4 项方法，分别精密吸取提取液 500
μL，共 5 份，按测定提取液含有量的 80%、
100%、120%吸取。加入 0. 1 mg /mL 葡萄糖标准
液 160、200、240 μL，冰水浴下按样品与蒽酮体
积比 1 ∶ 4 加入蒽酮溶液，煮沸 10 min，冷却后，
吸取 200 μL反应后溶液于 96 孔板中，用酶标仪测
定 A628。利用随行标准曲线 2 计算结果见表 7。
表 7 加样回收率试验 (n =9)
Tab. 7 Ｒesults of recovery tests (n =9)
样品中
量 /mg
加入
量 /mg
实测
量 /mg
回收
率 /%
平均回
收率 /%
ＲSD /%
0. 019 9 0. 016 0. 035 5 97. 50
0. 020 0 0. 016 0. 035 7 98. 13 98. 96 2. 03
0. 020 1 0. 016 0. 036 3 101. 25
0. 019 5 0. 020 0. 040 0 102. 50
0. 020 3 0. 020 0. 040 1 99. 00 101. 33 1. 99
0. 020 0 0. 020 0. 040 5 102. 50
0. 020 5 0. 024 0. 044 2 98. 75
0. 019 7 0. 024 0. 044 1 101. 67 100. 56 1. 57
0. 019 6 0. 024 0. 043 9 101. 25
3 讨论
糖类是中药紫花地丁中重要的化学成分，因具
有磺化聚糖而具有抗艾滋病毒的生物活性，因此对
其研究备受关注［10］。还原糖大多为单糖或双糖的
简单糖类，而具有广泛药理作用的多糖和磺化聚糖
等需经过水解后方能和蒽酮试剂反应，因此还原糖
和总糖量的比例，可在一定程度上反应紫花地丁中
含有具有生物活性糖类的多少。本研究采集了四川
东南部两个产地的紫花地丁植株，利用酶标仪结合
蒽酮硫酸法测定不同产地和不同组织部位紫花地丁
中多糖及其还原糖的量，其结果表明不同产地紫花
地丁中水溶性总糖量差别较大，泸州紫花地丁根明
显高于自贡紫花地丁根中水溶性总糖;自贡紫花地
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丁根还原糖量高于泸州紫花地丁根。泸州产地紫花
地丁各部位还原糖占总糖比例均低于自贡产地。说
明泸州产地紫花地丁中含有具生物活性的糖类物质
较高，其品质优于自贡产地。在紫花地丁的根、
叶、花、果实四个不同部位中，总糖量为根中最
高，花和果实次之，叶中含有量最少。果实中还原
糖占总糖比例相对较少。因此若利用紫花地丁中的
多糖或磺化聚糖等糖类物质，在果期采收质量
较佳。
用 L9 (3
4)正交试验测定紫花地丁总糖，发
现有效控制反应温度和适合的料液比是实验的关
键，当两者控制得当可使实验误差减少。同时在实
验中发现采用冰水浴比冰浴效果好，这与浓硫酸与
水剧烈放热，冰有孔隙对散热不利，导致蒽酮与糖
反应由于温度差别出现显色误差加大。蒽酮硫酸法
测定糖的含有量较为简单、方便，但由于采用普通
分光光度计测定，在测定过程中时间无法控制，导
致其显色不稳定［13-15］。利用酶标仪结合蒽酮硫酸
法测定紫花地丁中总糖和还原糖，可以在 96 孔酶
标板上对多个样品点样，并在短时间内测定多个样
品，有效克服显色不稳定而导致的吸光度值随时间
延长而下降的问题［16］。在酶标仪 96 孔板上同时完
成标准曲线和多组样品的测定，使数据更准确，有
效减少因不同步进行，显色剂一天中随时间温度的
变化，及显色剂每天需重新配制时的差异。此外也
减少了实验人员操作上的误差。使用酶标仪结合蒽
酮硫酸法测定紫花地丁总糖及还原糖的量，具有操
作简便、重复性好、精密度高，适合大批量样品的
测定以及产品生产的质量控制及检测。
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