全 文 ：收稿日期: 2004-02-12;　修订日期: 2004-05-18　
作者简介:周小龙 ( 1976-) ,男 (汉族 ) ,浙江诸暨人 ,现在读中国药科大学
研究生 ,主要从事中药药理与理论研究工作 .
蛇莲方免疫抗癌作用研究
周小龙 , 窦昌贵
(中国药科大学 ,江苏 南京　 210038)
摘要:目的: 研究蛇莲方的抗肿瘤和免疫调节作用。 方法: 采用体内移植性肿瘤和体外拒染法 ,观察蛇莲方的抗肿瘤作用
和免疫调节作用。 结果: SLF能显著抑制 S180、 Heps和 H22等实体瘤的生长 ;延长 EAC腹水瘤、肝癌 HepA小鼠的生存时
间 ;增强幼稚小鼠的胸腺、脾脏指数 ;增强小鼠炭粒廓清功能 ,提高巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力 ;促进荷瘤小鼠或正常
小鼠溶血素抗体的生成 ;增强二氯硝基苯 ( DNCB)诱导正常小鼠和 CTX所致免疫低下小鼠的迟发性超敏反应 ( DT H)能
力。体外实验表明 , SLF对 S180、 HL60细胞生长影响不大。结论:蛇莲方具有抗肿瘤作用 ,其作用并非通过细胞毒作用 ,而
与增强机体免疫等多方面有关。
关键词:蛇莲方 ;　抗肿瘤 ;　免疫活性 ;　肉瘤 180实体型 ;　艾氏腹水瘤 ;　肝癌腹水型 22;　肝癌 ;　早幼粒细胞白
血病细胞
中图分类号: R285. 5　　文献标识码: A　　文章编号: 1008-0805( 2004) 09-0547-03
Experimental Study of Anti- tumor and Immunomodulating Activities of Shelian-Fang
ZHOU Xiao-long, DOU Chang-gui
(China Pharmaceutical University , Nanjing 210038, China)
Abstract: Objective: To investig ate the anti- tumor and immunomodula ting activities o f Shelian-Fang. Methods: The anti-
neoplastic activity and immunomodula ting effects of SLF were tested bo th in viv o experiment ( using transplantable animal
tumors) and in vitro assa y.Results: SLF had obv iously inhibitory effects on the g row th o f S180 , Heps and H22 , a nd prolonged
the life of mice bearing EAC o r Hep A. SLF could incr ease the index of spleen and thymus of young mice and resto re phago-
cy tic function o f the macrophage and the forma tion of serum h emo lysin antibody. Experiment in v itro demonstrated that SLF
had no dir ect killing effects on tumor cells. Conclusion: SLF w as shown to have a definite antineoplastic effect. It could pro-
mote the immune function o f mice.
Key words: SLF;　 Anti- tumor effect;　 Im mune functions;　 S180;　 EAC;　 Heps;　 H22;　 HL60
　　蛇莲方是在临床抗癌验方的基础上 ,结合现代抗肿瘤药物筛
选手段 ,进行精简、重组而得到 ,该处方主要由白花蛇舌草、半枝
莲、半边莲、丹参、苡仁等中药组成 ,具有清热解毒 ,活血利尿等作
用。本文主要研究蛇莲方的体内体外的抗肿瘤作用及其免疫调节
活性。
1　材料
1. 1　药物 蛇莲方 (简称 SLF) ,中药材按处方量 ,水提浓缩 ,制成
浸膏 ,计算产率 ,并用蒸馏水配制成所需浓度 ;注射用环磷酰胺
( C TX ) ,上海华联制药有限公司 ,批号 011104;氟尿嘧啶注射液
( 5- Fu) ,南通制药总厂 ,批号 021210; RMPⅠ - 1640, Gibco公
司 ;小牛血清 ,杭州四季青生物技术材料公司。
1. 2　动物和瘤株 昆明种小鼠、豚鼠 ,均由中国药科大学实验动
物 中心提供 ;小鼠肉瘤 180实体型 ( S180 )、小鼠艾氏腹水瘤
( EAC)、小鼠肝癌腹水型 22( H22 )、小鼠肝癌 ( Heps)和人早幼粒
细胞白血病细胞 ( HL60) ,由上海医药工业研究院提供 ,按常规传
代培养。
2　方法
2. 1　 SLF对荷瘤小鼠实体瘤生长的影响 [1 ] 取雌性小鼠 50只 ,
随机分为 5组:空白对照组予 NS、阳性对照组予 CTX 25 mg /kg
or 5- Fu 25 mg /kg , SLF各剂量组分别予 SLF 2, 5, 10 g /kg。 无
菌条件下抽取生长至第 7 d的荷瘤小鼠腹腔瘤液 ,用无菌生理盐
水按 1∶ 4稀释后 ,于小鼠右腋下接种 0. 2 ml /只。 接种 24 h后 ,
灌胃受试药物 ,连续 10 d。末次给药后 24 h,小鼠称重 ,脱颈椎处
死 ,剥离肉瘤 ,电子天平称重 ,计算瘤重抑制率。 瘤重抑制率 (% )
= (给药组平均瘤重 -对照组平均瘤重 ) /对照组平均瘤重× 100。
2. 2　 SLF对腹水瘤小鼠生存时间的影响 [1 ] 按 2. 1实验 ,小鼠腹
腔接种瘤液 0. 2 ml /只。 接种 24 h后 ,灌胃受试药物 ,连续 10 d。
以后观察和记录小鼠死亡的时间 ,计算生存天数和生命延长率。
生命延长率 (% )= (对照组平均生存天数 - 给药组平均生存天
数 ) /对照组平均生存天数× 100。
2. 3　体外抑制细胞增殖作用 [1] 取小鼠 40只 ,随机分成 5组:空
白对照组予 NS,给药组予 SLF 0. 4, 2, 5, 10 g /kg ,按每鼠给药 1
ml。给药 2 h后 ,小鼠摘眼球取血 ,分离血清 ,合并同组血清 ,冷冻
保存备用。 用 RM PⅠ - 1640培养液 (含 10%小牛血清 ,青霉素、
链霉素各 100 u /ml)将细胞悬成 5× 104 /ml,在 24孔板每孔加入
1 ml,并加入不同浓度含药血清各 100μl /孔 ,空白对照组加空白
血清 100μl,阳性对照组加 25 mg /ml 5- Fu 10μl,最后用 RM PⅠ
- 1640液调至终体积 2 ml,每一样本均设 3复孔 ,置 5% CO2的
37℃培养箱 ,孵育 48 h后 ,取 80μl细胞 ,加 20μl 0. 4%台盼蓝
液 ,染色 5 min后 ,计数拒染活细胞数。
2. 4　 SLF对幼稚小鼠免疫器官重量的影响 [2] 取幼稚小鼠 60
只 ,体重 11～ 15 g ,随机分成 4组: 空白对照组予 NS, SLF各剂量
组分别予 SLF 2, 5, 10 g /kg ,按 0. 2 ml /10 g体重给药 ,连续 7 d。
末次给药后 24 h ,摘眼球放血处死 ,摘取胸腺和脾脏 ,电子天平称
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重 ,并计算胸腺指数和脾脏指数。
2. 5　 SLF对小鼠炭粒廓清功能的影响 [2] 取雄性小鼠 50只 ,随
机分成 5组 :正常对照组予 H2O,空白对照组予 NS, SLF各剂量
组分别予 SLF 2, 5, 10 g /kg ,连续 7 d。 末次给药后 24 h ,按 0. 1
ml /10 g体重尾静脉注射印度墨水 ( 1∶ 4) ,静注后第 2, 10 min眼
眶取血 20μl,注洗入加 2 ml 0. 1% Na2 CO3溶液的小试管中 ,即时
摇匀。静置 1 h后 ,用 721型分光光度计在 650 nm波长处测吸收
度 OD值。同时摘取肝、脾 ,电子天平称重 ,计算廓清指数 K、吞噬
指数α。
K= ( lo gOD1- logOD2 ) /( t1- t2 ) ,α= K1 /3×体重 /(肝重+ 脾
重 )
2. 6　 SLF对小鼠鸡红细胞 ( CRBC)吞噬功能的影响 [2] 取雄性小
鼠 60只 ,随机分成 4组: 空白对照组给予 NS, SLF各剂量组分别
予 SLF 2, 5, 10 g /kg ,按 0. 2 ml /10 g给药 ,连续 7 d。末次给药后
2 h ,腹腔注射 4% CRBC液 0. 4 ml /只 , 5 h后 ,小鼠脱颈椎处死 ,
腹腔注射 N S 2 ml,轻揉小鼠腹部后抽出腹水 0. 3 ml,分滴于两
片载玻片 ,放入垫有湿布的瓷盘内 ,置 37℃孵箱温育 30 min。 孵
毕 ,在生理盐水中漂洗去未吞噬 CRBC和其他未贴壁细胞。冷风
吹干 ,以甲醇 -丙酮液 ( 1∶ 1)固定 5 min,再用 4%姬姆萨液染色 3
min,用生理盐水漂洗 ,晾干。在油镜下计数 200个巨噬细胞 ,并计
数其中吞噬 CRBC的吞噬细胞数及被吞噬的 CRBC数。 计算吞
噬百分率和吞噬指数。 吞噬百分率 (% ) = 吞噬 CRBC的巨噬细
胞数 /200个巨噬细胞× 100% ,吞噬指数 = 被吞噬的 CRBC总数
/200个巨噬细胞。
2. 7　 SLF对荷瘤小鼠和正常小鼠溶血素抗体生成的影响 [2] 按
2. 1实验 ,小鼠右腋下接种 S180瘤液 0. 2 ml /只。 接种 24 h后 ,灌
胃受试药物 ,连续 10 d。第 2次灌胃后每鼠腹腔注射 0. 2 ml SR-
BC(绵羊红细胞 )稀释液致敏 ,末次给药后 24 h ,眼眶取血 0. 5
ml, 2 000 r /min离心 10 min,分离血清 ,吸取 3μl,用 1 ml N S稀
释 ,再加 0. 5 ml SRBC稀释液和 1 ml豚鼠血清稀释液 (豚鼠血清
∶ NS= 1∶ 10) ,于 37℃水浴中保温 30 min后 ,冰浴终止反应 ,
2 000 r /min离心 10 min,取上清液 1 ml,加都氏试剂 3 ml于试
管内 ,同时取 SRBC稀释液 0. 25 ml加都氏试剂至 4 m l于另一支
试管内 ,充分摇匀 ,放置 10 min后 ,于 721型分光光度计在 540
nm波长处 ,以对照管作空白 ,分别测定各管吸收度 OD值 ,计算
样品半数溶血值 HC50。另取正常小鼠 60只 ,不接肿瘤 ,随机分成
4组 ,空白对照组和 SLF各剂量组 ,同法进行半数溶血值 HC50测
定。样品 HC50= 样品吸收度值 /绵羊红细胞半数溶血时吸收度值
×稀释倍数。
2. 8　 SLF对二氯硝基苯 ( DNCB)诱导小鼠迟发性超敏反应
( DTH)的影响 [2] 取雄性小鼠 104只 ,随机分成 8组:空白对照组
予 NS, SLF各剂量组分别予 SLF 2, 5, 10 g /kg , CTX组予 CTX
25 mg /kg, CTX+ SLF各剂量组分别予 CTX 25 mg /kg+ SLF 2,
5, 10 g /kg ,按 0. 2 ml /10 g给药 ,连续 7 d。第 1次给药后 ,小鼠腹
部去毛 ,约 3 cm× 3,用 5% DNCB麻油丙酮液 ( 1∶ 1)均匀涂抹致
敏。次日再强化 1次。 6 d后 ,用 5% DNCB液 20μl均匀涂抹于小
鼠右耳两面 ,进行攻击。攻击 24 h后 ,小鼠脱颈椎处死 ,打孔器取
下直径 8 mm的耳片 ,电子天平称重 ,计算耳廓肿胀度 ;同时摘取
胸腺及脾脏 ,称重计算胸腺及脾脏指数。耳廓肿胀度= (右耳重 -
左耳重 ) /左耳重× 100%。
3　结果
3. 1　 SLF对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响 SLF 2, 5, 10 g /kg 3个剂
量连续给药 10 d。结果显示 , 3个剂量均能明显抑制 S180、 Heps和
H22肿瘤的生长 ,与 NS对照组比较有显著性差异 (P < 0. 01)。 结
果见表 1。
表 1　 SLF对 S180、 Heps和 H22荷瘤小鼠的抑瘤作用 ( x-± s)
瘤株 组别 剂量 C /g· kg-1 瘤重 m / g 抑瘤率 (% )
S180 N S - 　　 2. 588± 0. 446
CTX 0. 025 0. 936± 0. 308* * 63. 8
SLF 2 1. 707± 0. 291* * 34. 0
5 1. 623± 0. 265* * 37. 3
10 1. 497± 0. 245* * 42. 2
Heps N S - 2. 564± 0. 430
5- Fu 0. 025 0. 995± 0. 415* * 61. 2
SLF 2 1. 739± 0. 429* * 32. 2
5 1. 705± 0. 306* * 33. 5
10 1. 670± 0. 287* * 34. 9
H22 N S - 2. 761± 0. 494
CTX 0. 025 0. 871± 0. 359* * 68. 5
SLF 2 1. 784± 0. 253* * 35. 4
5 1. 728± 0. 261* * 37. 4
10 1. 698± 0. 239* * 38. 5
　　注:与相应 NS组比较: * * P < 0. 01,n= 10
3. 2　 SLF对荷瘤小鼠生存时间的影响 SLF 2, 5, 10 g /kg连续
给药 10 d后 ,各组小鼠的存活时间明显长于 NS对照组 ,但生命
延长率不大。 结果见表 2。
3. 3　 SLF体外对瘤株生长的影响 SLF各剂量组对 S180和 HL60
细胞增殖仅有轻度的抑制作用 (P> 0. 05)。 结果见表 3。
3. 4　 SLF对幼稚小鼠免疫器官的影响 SLF各剂量均能增强幼
稚小鼠胸腺指数和脾脏指数 ,其中 SLF 2, 10 g /kg组 ,与 N S对照
组比较 ,均有显著性差异。 结果见表 4。
表 2　 SLF对荷瘤小鼠 EAC、 HepA生存时间的影响 (x-± s )
瘤株 组别 剂量 C /g· kg-1 生存时间 t /d 生命延长率 (% )
EAC N S - 　　　 14. 0± 1. 7
CTX 0. 025 21. 3± 3. 6* * 52. 1
SLF 2 16. 0± 2. 3* 14. 3
5 16. 4± 2. 0* * 17. 1
10 16. 8± 2. 1* * 20. 0
HepA N S - 12. 9± 2. 7
5- Fu 0. 025 24. 8± 2. 8* * 92. 2
SLF 2 16. 0± 2. 3* * 30. 2
5 16. 8± 2. 1* * 30. 2
10 16. 4± 2. 0* * 27. 1
　　注:与相应 NS组比较: * P < 0. 05, * * P < 0. 01,n= 10
表 3　 SLF体外对 S180和 HL60细胞生长的影响 (x-± s )
瘤株 组别 剂量 C /g· kg-1 活细胞数 C /104· ml-1 抑制率 (% )
S180 N S - 　　 17. 6± 2. 2
5- Fu 0. 025 5. 5± 1. 6* * 　 68. 6
SLF 0. 4 16. 1± 1. 9 8. 3
2 15. 8± 1. 4 10. 1
5 14. 3± 2. 6 18. 9
10 15. 4± 2. 2 12. 4
HL60 N S - 13. 9± 1. 9
5- Fu 0. 025 2. 9± 0. 9* * 78. 9
SLF 0. 4 13. 8± 1. 7 0. 8
2 13. 0± 2. 9 6. 0
5 11. 5± 1. 4 17. 3
10 11. 6± 2. 6 16. 5
　　注:与相应 NS组比较: * * P < 0. 01,n= 10
3. 5　 SLF对小鼠炭粒廓清功能的影响 SLF各剂量组 K、α值均
高于 NS对照组 ,尤其 SLF 2, 10 g /kg组 K值 ,与 NS对照组比
较 ,有显著性差异 (P < 0. 01, P < 0. 05)。表明 SLF能增强小鼠炭
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粒廓清功能。 结果见表 5。
表 4　 SLF对幼稚小鼠免疫器官的影响 ( x-± s)
组别 剂量 C /g· kg-1 胸腺指数 C /mg· g-1 脾脏指数 C /mg· g- 1
N S - 　　 3. 78± 1. 07 　　 5. 27± 0. 72
SLF 2 4. 96± 1. 00* * 5. 89± 0. 77*
5 3. 92± 0. 72 5. 44± 0. 53
10 4. 48± 0. 74* 5. 86± 0. 89*
　　注:与 NS组比较: * P < 0. 05, * * P < 0. 01, n= 15
表 5　 SLF对小鼠炭粒廓清功能的影响 ( x-± s)
组别 剂量 C /g· kg-1 K α
N S - 　　 0. 032 7± 0. 011 0　　 4. 748± 0. 752
SLF 2 0. 045 6± 0. 013 2* * 5. 115± 0. 770
5 0. 039 0± 0. 011 6 5. 060± 0. 785
10 0. 041 9± 0. 013 0* 4. 957± 0. 757
　　注:与 NS组比较: * P < 0. 05, * * P < 0. 01, n= 10
3. 6　 SLF对小鼠吞噬鸡红细胞能力的影响 尤其 5, 10 g /kg作
用明显 ,与 N S对照组比较有显著性差异 (P < 0. 05)。 结果见
表 6。
表 6　 SL F对小鼠吞噬鸡红细胞能力的影响 ( x-± s)
组别 剂量 C /g· kg-1 吞噬百分数 (% ) 吞噬指数
N S 　　　 17. 1± 5. 2 　　　 0. 281± 0. 068
SLF 2 20. 1± 5. 4 0. 314± 0. 085
5 21. 3± 5. 5* 0. 327± 0. 070
10 20. 9± 4. 4* 0. 313± 0. 071
　　注:与 NS组比较: * P < 0. 05, n= 15
3. 7　 SLF可促进荷瘤小鼠和正常小鼠溶血素抗体的作用 无论
荷瘤小鼠还是正常小鼠 , SLF各剂量组 HC40均高于 N S对照组 ,
与 N S对照组比较 ,有显著性差异 ( P < 0. 01) ,尤其对荷瘤小鼠
SLF的促抗体生成作用更强。 表明 SLF可促进荷瘤小鼠和正常
小鼠溶血素抗体的生成 ,提高体液免疫功能。 结果见表 7。
表 7　 SLF可促进荷瘤小鼠和正常小鼠溶血素抗体的生成作用 (x-± s )
瘤株 组别 剂量
C /g· kg-1 HC50
Improved
rate(% )
S180 NS - 　　 62. 2± 31. 1
C TX 0. 025 14. 4± 4. 7* * 　　 - 76. 8
SLF 2 143. 2± 41. 9* * 130. 5
5 103. 3± 40. 7* 66. 3
10 111. 4± 36. 5* * 109. 1
Normal NS - 387. 4± 91. 5
C TX 0. 025 134. 7± 33. 3* * - 65. 2
SLF 2 566. 8± 70. 6* * 46. 3
5 497. 7± 71. 2* * 28. 5
10 501. 1± 81. 4* * 32. 3
　　注:与相应 NS组比较: * * P < 0. 01,n= 10
3. 8　 SLF对 DNCB诱导小鼠 DTH反应能力的作用 对正常小
鼠 , SLF各剂量组耳廓肿胀度均明显高于 N S对照组 ,与 N S对照
组比较 , SLF 5, 10 g /kg有显著性差异。 表明 SLF能增强 DNCB
诱导小鼠 DTH反应能力 ;对 CTX所致的免疫低下小鼠 , SLF亦
能增强 DT H反应。提示 , SLF可能增强 T细胞免疫功能。结果见
表 8。
4　讨论
传统医学认为癌的发生主要由“癌毒”和“正虚”互为作用的
结果。 “癌毒”内生是癌症的始动之因 ,正气不足是癌症的内在依
据。 SLF方中白花蛇舌草、半枝莲、半边莲均能清热解毒 ,利尿消
肿 ,化瘀定痛 ,再加苡仁渗湿 ,丹参化瘀 ,针对癌毒产生的直接原
因: 热毒、痰凝和气滞血瘀 ;苡仁健脾 ,丹参养血 ,补中有散 ,可资
实中之虚。实验结果也表明 , SLF能抑制小鼠 S180、 Heps和 H22肿
瘤的生长 ,延长荷瘤 EAC、 Hep A小鼠的生存时间 ,但体外对
S180、 HL60细胞生长影响不大 ,表明 SLF无细胞毒作用 ,其抑瘤
作用主要通过其他方式实现。
表 8　 SLF对 DNCB诱导小鼠 DTH反应能力的作用 ( x-± s)
组别 剂量
C /g· kg-1 耳重差 (% ) 胸腺指数 脾指数
N S - 　 97. 1± 30. 0 　 3. 16± 0. 73 　 6. 68± 1. 30
SLF 2 112. 1± 42. 4 3. 39± 0. 82 7. 44± 1. 89
5 144. 7± 56. 5* * 3. 36± 1. 29 7. 54± 1. 27
10 143. 4± 73. 2* 3. 30± 0. 81 6. 64± 1. 10
CTX 0. 025 64. 1± 31. 3 2. 22± 0. 62 3. 62± 0. 63
CTX+ SLF 0. 025+ 2 88. 6± 46. 5 2. 41± 0. 29 4. 01± 0. 70
0. 025+ 5 94. 9± 43. 8△ 2. 23± 0. 50 4. 09± 0. 65
0. 025+ 10 85. 8± 31. 3 2. 05± 0. 42 3. 53± 0. 70
　　注:与 NS组比较: * P < 0. 05,* * P < 0. 01,n= 13
巨噬细胞的吞噬功能、迟发性超敏反应、体液免疫中的溶血
素抗体形成以及非特异性免疫中的免疫器官重量基本反应了机
体的细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫水平 ,从而体现了整个
机体免疫系统的功能水平。实验结果显示 , SLF能增强幼稚小鼠
胸腺指数和脾脏指数 ,增强小鼠炭粒廓清功能和吞噬鸡红细胞的
能力及增强 DN CB诱导小鼠 DTH反应能力。表明 SLF可增强机
体的免疫功能。
综上所述 , SLF具有一定的抗癌作用 ,其作用并非通过细胞
毒作用 ,而与增强机体免疫等多方面有关。
参考文献:
[1 ]　韩　锐 .抗癌药物研究与实验技术 [M ].北京:北京医科大学中国协
和医科大学联合出版社 , 1998: 281-281, 298-298.
[2 ]　陈　奇 .中药药理研究方法学 ,第 1版 [ M ].北京:人民卫生出版社 ,
1993: 747-757.
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