全 文 ：收稿日期:2015-01-25
基金项目:国家自然科学基金资助项目(81100957，81374001);湖北省自然科学基金创新群体项目(2013CFA014)
作者简介:邓丽丽(1985-)，女，在读硕士研究生，专业方向:中药药理学;E-mail:denglili3748@ 163. com。
* 通讯作者:王婷，E-mail:tingting0301@ 126. com。
竹节参总皂苷通过线粒体途径保护 H2 O2
诱导的 SH-SY5Y神经细胞损伤
邓丽丽，万静枝，袁 丁，张长城，李 更，王 婷*
(三峡大学医学院，湖北 宜昌 443002)
摘要 目的:探讨竹节参总皂苷对 SH-SY5Y 细胞的保护作用机制。方法:SH-SY5Y 细胞随机分为正常对照
组，H2O2 模型组(600 μmol /L H2O2)，药物干预组(600 μmol /L H2O2 + 0. 1、1、5、20 μg /mL竹节参总皂苷)。竹节参
总皂苷预处理 12 h后，再加入 H2O2 继续培养 12 h。JC-1 法检测线粒体膜电位变化，Western blotting 检测 Sirt1、
PGC-1α、Foxo3a、LC3-Ⅱ和 Beclin1 的表达。结果:600 μmol /L H2O2 与 SH-SY5Y共同孵育 12 h后，线粒体膜电位下
降，Sirt1、PGC-1α、Foxo3a、LC3-Ⅱ和 Beclin1 的蛋白表达下调，预孵育竹节参总皂苷能明显提高细胞线粒体的膜电
位，增强 Sirt1、PGC-1α、Foxo3a、LC3-Ⅱ和 Beclin1 的蛋白表达。结论:竹节参总皂苷对 H2O2 致 SH-SY5Y神经细胞损
伤具有保护作用，其机制可能与调节线粒体功能及自噬相关蛋白有关。
关键词 竹节参总皂苷;SH-SY5Y细胞;过氧化氢;线粒体
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2015)08-1690-04
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2015. 08. 032
Protective Effects of Total Saponins from Panax japonicus on H2O2
Induced Injury via Mitochondia Pathway in SH-SY5Y Cells
DENG Li-li，WAN Jing-zhi，YUAN Ding，ZHANG Chang-cheng，LI Geng，WANG Ting
(Medical College，China Three Gorge University，Yichang 443002，China)
Abstract Objective:To investigate the protective mechanism of total saponins from Panax japonicus(SPJ)on H2O2 induced injury
in SH-SY5Y cells. Methods:SH-SY5Y cells were divided into three groups:blank control group，model group(600 μmol /L H2O2)and
drug treatment groups. Different concentrations of SPJ(0. 1，1，5 and 20 μg /mL)were incubated with SH-SY5Y cells for 12 hours prior
to exposing to 600 μmol /L H2O2 for another 12 h. Mitochondrial membrane potential(MMP)was detected by JC-1 method. Protein ex-
pressions of Sirt1，PGC-1α，Foxo3a，LC3-Ⅱ and Beclin1 were detected by Western blotting. Ｒesults:Compared to the H2O2 model
group，SPJ pretreatment significantly increased MMP level and enhanced the protein expressions of Sirt1，PGC-1α，Foxo3a，LC3-Ⅱ and
Beclin1. Conclusion:SPJ exerts protective effect on H2O2 induced SH-SY5Y cell injury through mitochondria pathway.
Key words Total saponin from Panax japonicus C. A. Mey. ;SH-SY5Y cell;Hydrogen peroxide;Mitochondria
竹节参为五加科植物竹节参 Panax japonicus
C. A. Mey. 的干燥根茎，别名竹节三七、白三七、竹
节人参等，是我国西南地区民间常用中草药，在土家
族、苗族被誉为“草药之王”，属中国药典多年收载
的中药材品种。现代药理研究表明，竹节参具有抗
炎、抗氧化、免疫调节、保护心肌缺血、抗衰老等多种
药理作用〔1，2〕。由于其兼具北药人参滋补强壮和南
药三七活血化瘀之功效，近年来特别是在神经系统
方面受到了广泛关注。竹节参中主要含有皂苷类、
糖类、多炔类、氨基酸、挥发油及无机元素 6 类化学
成分，皂苷类成分是竹节参中研究最多的成分，也是
主要活性成分，分为齐墩果烷型、达玛烷型和奥寇梯
木醇型〔1〕。研究表明，竹节参皂苷可增强人神经母
细胞瘤来源 SK-N-SH 神经细胞株的轴突及树突生
长，从而活化神经元形成新的突触连接，也可改善由
Aβ诱导的记忆障碍和突触连接损伤〔3，4〕。大量研
究表明，神经退行性疾病的发生与线粒体功能障碍
密切相关，如在阿尔茨海默病(Alzheimer s disease，
AD)的动物模型中发现线粒体分裂和融合异常会引
起神经元损失和死亡〔5〕。本课题组前期研究表明，
竹节参总提物对 D-半乳糖致衰老小鼠认知功能障
碍有明显的改善作用，且竹节参总皂苷对 H2O2 诱
导的 SH-SY5Y细胞损伤具有良好的保护作用，但具
体保护机制是否与减轻细胞线粒体损伤相关尚未见
报道。因此，本研究拟在前期研究基础上，进一步观
察竹节参总皂苷对 H2O2 诱导的神经细胞损伤的保
护作用机制，为推广其临床应用提供理论基础和实
验依据。
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1 材料与仪器
1. 1 细胞株 人神经瘤母瘤细胞(SH-SY5Y)，由
华中科技大学同济医学院惠赠。
1. 2 药物与试剂 竹节参药材购于湖北省恩施椿
木营竹节参种植基地，经三峡大学天然产物研究与
开发重点实验室邹坤教授鉴定为五加科人参属植物
竹节参 Panax japonicus C. A. Mey. 的干燥根茎;竹
节参总皂苷的制备参照课题组前期研究进行〔2〕。
高糖 DMEM培养基，Gibico公司;双氧水(H2O2)，北
京化工厂生产;胰蛋白酶，Gibico 公司;胎牛血清，杭
州天杭生物科技有限公司;线粒体膜电位试剂盒，南
京建成生物工程研究所;Western blotting marker，美
国 invitrogen公司;牛血清白蛋白(BSA)、PMSF、ＲI-
PA裂解液，北京普利莱生物技术有限公司;Tris、甘
氨酸、SDS，美国 Sigma 公司;Sirt1 抗体，Millipore 公
司;PGC-1、LC3-Ⅱ、Beclin 及 actin 抗体，Santa Cruz
公司;Foxo3a，abcam公司;化学发光剂 ECL，碧云天
生物技术研究所。
1. 3 主要仪器 SW-4T-2F 洁净工作台，上海江莱
生物科技有限公司;NU-4750E 型二氧化碳培养箱，
美国 Nu Aire公司;DMＲ 型多功能显微镜及图像分
析系统，英国 Syngne公司;NIKON TP1020 荧光倒置
显微镜，日本 Olympus 公司;JA2003 电子分析天平，
上海天平仪器厂。
2 方法
2. 1 细胞培养 SH-SY5Y细胞用含 10%胎牛血清
DMEM培养基，置于 37 ℃，饱和湿度，5% CO2 培养
箱中培养。待细胞生长至 80% ～ 90%时，用 0. 25%
胰酶消化传代，选择对数生长期细胞进行试验。
2. 2 实验分组及给药 实验分为 3 组:正常对照
组，H2O2 模型组(600 μmol /L H2O2)，竹节参总皂苷
药物干预组(0. 1、1、5、20 μg /mL)。SH-SY5Y 细胞
孵育 24 h后，除正常对照组和模型组外，其余各组
加入相应的药物浓度处理 12 h，除正常对照组外，其
余各组加入相同浓度的 H2O2 处理 12 h，检测各项
实验指标。
2. 3 线粒体膜电位检测 取对数生长期的 SH-
SY5Y细胞接种于 6 孔培养板中按“2. 2”项下方法
对其进行相应的处理后，利用 JC-1 探针检测线粒体
膜电位，按照说明书进行操作，在荧光显微镜下观察
并拍照。
2. 4 Western blotting 分析 各实验组细胞培养中
止后，收集细胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解 15 min，
每隔 5 min震荡 30 s，4°C，12 000 × g 离心 10 min，
取上清液加入 5 ×的上样缓冲液，于 95 ℃加热变
性，SDS-PAGE 凝胶电泳并转 PVDF 膜，一抗 4 ℃孵
育过夜，二抗室温孵育 1 h，ECL化学发光法显影。
2. 5 统计学处理 实验数据采用 SPSS 13. 0 软件
进行统计学处理，Western 数据采用 Image J 软件分
析，数据以 珋x ± s 表示，多组间差异比较用单因素方
差分析，以 P ＜ 0. 05 为差异有统计学意义。
3 结果
3. 1 竹节参总皂苷对 H2O2 作用下 SH-SY5Y 细胞
线粒体膜电位的影响 结果如图 1 所示，与正常对
照组比较，模型组 SH-SY5Y细胞线粒体膜电位显著
降低(P ＜ 0. 01)。与模型组比较，竹节参总皂苷 1、
5、20 μg /mL组 SH-SY5Y细胞线粒体膜电位显著升
高(P ＜ 0. 01)。
图 1 竹节参总皂苷对 H2O2 作用下 SH-SY5Y
细胞线粒体膜电位的影响
A. 正常对照组 B. 模型组 C. 竹节参总皂苷 0. 1 μg /mL
组 D. 竹节参总皂苷 1 μg /mL组 E. 竹节参总皂苷 5 μg /
mL组 F. 竹节参总皂苷 20 μg /mL组
注:与正常对照组比较，＊＊P ＜ 0. 01;与模型组比较，##P ＜ 0. 01
3. 2 竹节参总皂苷对 H2O2 作用下 SH-SY5Y 细胞
Sirt1、PGC-1α 和 Foxo3a 蛋白表达的影响 结果如
图 2 所示，与正常对照组相比较，模型组 SH-SY5Y
细胞中 Sirt1、PGC-1α 及 Foxo3a 蛋白表达均显著降
低(P ＜ 0. 01)。与模型组比较，竹节参总皂苷各剂
量组 SH-SY5Y细胞中 Sirt1、Foxo3a蛋白表达显著升
高(P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01)，竹节参总皂苷 5、20 μg /
mL组 SH-SY5Y细胞中 PGC-1α 蛋白表达显著升高
(P ＜ 0. 01)。
3. 3 竹节参总皂苷对 H2O2 作用下 SH-SY5Y 细胞
线粒体自噬相关基因蛋白表达的影响 结果如图 3
所示，与正常对照组比较，模型组 SH-SY5Y 细胞中
LC3-Ⅱ、Beclin1 蛋白表达显著降低(P ＜ 0. 01)。与
模型组比较，竹节参总皂苷 5、20 μg /mL 组 SH-
SY5Y细胞中 LC3-Ⅱ、Beclin1 蛋白表达显著升高(P
＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01)。
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图 2 竹节参总皂苷对 H2O2 作用下 SH-SY5Y细胞 Sirt1、PGC-1α和 Foxo3a蛋白表达的影响
A. 正常对照组 B. 模型组 C. 竹节参总皂苷 1 μg /mL组 D. 竹节参总皂苷 5 μg /mL组 E. 竹节参总皂苷 20 μg /mL组
注:与正常对照组比较，＊＊P ＜ 0. 01;与模型组比较，#P ＜ 0. 05，##P ＜ 0. 01
图 3 竹节参总皂苷对 H2O2 作用下 SH-SY5Y细胞线粒体自噬相关基因蛋白表达的影响
A. 正常对照组 B. 模型组 C. 竹节参总皂苷 1 μg /mL组 D. 竹节参总皂苷 5 μg /mL组 E. 竹节参总皂苷 20 μg /mL组
注:与正常对照组比较，＊＊P ＜ 0. 01;与模型组比较，#P ＜ 0. 05，##P ＜ 0. 01
4 讨论
线粒体是细胞中一个非常重要的细胞器，为细
胞的活动提供能量，从而维持细胞的正常功能，过量
的自由基损伤线粒体，影响呼吸功能并且由此增加
电子流和活性氧生成，加重氧化应激和线粒体氧化
损伤。当细胞内的自由基增加时可使线粒体电子传
递链活性相关酶遭受氧化损伤，进而导致线粒体呼
吸链复合物活性下降和线粒体功能障碍。线粒体膜
电位的降低是细胞凋亡早期的不可逆事件，本实验
结果显示，竹节参总皂苷能显著升高 SH-SY5Y细胞
线粒体膜电位，说明竹节参总皂苷能通过调节线粒
体功能来修复氧化应激导致的 SH-SY5Y 细胞的氧
化损伤。
研究表明，线粒体自噬是调控线粒体质量和减
少线粒体自由基生成的重要途径，且其可被 Sirt1 直
接或间接调控。Sirt1 是 NAD +依赖的组蛋白去乙
酰化酶，可调控线粒体自噬或细胞内转录因子如
PGC-1α、p53、Ku70、Foxo3a等的去乙酰化作用，因此
在减轻机体氧化应激和调节线粒体功能方面具有重
要作用〔6，7〕。活化的 PGC-1α 通过诱导核呼吸因子
(nuclear respiratory factors，NＲF-1 /NＲF-2)和线粒体
转录因子 A(mitochondrial transcription factor A，
TFAM)的表达，调节线粒体 DNA 复制、转录等，从
而促进线粒体生物合成，增强不同组织细胞有氧呼
吸功能〔8，9〕。Foxo3a 是 FOXO 家族中的重要成员，
其参与细胞周期调控，修复受损的 DNA，调节氧化
应激和衰老等多种生物学功能〔10〕。研究表明，在受
到氧化应激的细胞内，Sirt1 与 Foxo3a结合形成复合
体使 Foxo3a 去乙酰化从而增加机体对氧化应激的
抵抗力〔11〕。Fujino K 等〔12〕研究表明，Sirt1 去乙酰
化 Foxo3a 后可减轻葡萄糖剥夺导致的细胞氧化应
激损伤从而发挥神经细胞保护效应。本研究也表
明，经 H2O2 处理的细胞 Sirt1、PGC-1α 和 Foxo3a 的
表达量均下调，竹节参总皂苷预给药保护后能上调
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Sirt1、PGC-1α和 Foxo3a表达，表明竹节参总皂苷能
通过调节 Sirt1 表达进而促进线粒体生物合成从而
增强细胞的抗氧化能力。
当机体受到外界环境有害刺激时，自噬会对细
胞内一些破损或多余的细胞器或局部细胞质进行降
解，实现再循环，以维持细胞自身的稳定。微管相关
蛋白轻链 3 (microtubule-associated protein 1light
chain 3，LC3)和 Beclin1 基因是被确认的自噬基因，
对自噬体的形成至关重要。LC3 是自噬泡形成过程
中的关键蛋白，具有 LC3-Ⅰ和其蛋白水解衍生物
LC3-Ⅱ两种形式。LC3-Ⅰ定位于胞浆，LC3-Ⅱ定位
于自噬双层膜上。一旦自噬体与溶酶体融合，自噬
体内的 LC3-Ⅱ便被溶酶体中的水解酶降解，所以
LC3-Ⅱ含量或 LC3-Ⅱ /LC3-Ⅰ比值的增高反映了自
噬活性的增强〔13，14〕。同样，Beclin1 也是自噬形成过
程中的关键基因，代表了自噬活性。过华蕾等〔15〕研
究发现 D-半乳糖诱导的心肌细胞衰老伴随着氧化
应激的增强及自噬水平的下降，而激动剂白藜芦醇
能减轻 D-半乳糖诱导的心肌细胞衰老的程度，其保
护效应可能与白藜芦醇抗氧化应激效应及上调自噬
相关基因 LC3-Ⅱ水平有关。本实验结果也显示，模
型组细胞的 LC3-Ⅱ和 Beclin1 蛋白表达下降，竹节
参总皂苷预孵育后能上调 LC3-Ⅱ和 Beclin1 的蛋白
表达，由此推测竹节参总皂苷可通过诱导自噬来修
复 SH-SY5Y细胞内的氧化损伤，改善细胞的氧化应
激状态从而提高细胞的抗氧化能力。
综上所述，竹节参总皂苷能明显改善由 H2O2
刺激 SH-SY5Y细胞引起的氧化损伤，其机制可能与
调节线粒体生物合成和自噬有关。
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