全 文 ：化 学 研 究 与 应 用 第 24 卷
第 24 卷第 5 期
2012 年 5 月
化 学 研 究 与 应 用
Chemical Research and Application
Vol． 24，No． 5
May，2012
文章编号:1004-1656(2012)05-0722-04
鸡足山耳蕨总黄酮的提取及抗氧化性研究
文美琼* ，徐成东，管春平，杨红卫，徐沧声，王显蛟
(云南楚雄师范学院化学与生命科学系，云南 楚雄 675000)
摘要:研究鸡足山耳蕨中总黄酮的提取及其抗氧化性。采用 70%乙醇提取鸡足山耳蕨中总黄酮，用 NaNO2-
Al(NO3)3 -NaOH分光光度法测定黄酮含量，将提取液采用 Fenton 体系、普鲁士蓝法进行体外抗氧化活性研
究，用硫代巴比妥酸(TBA)分光光度法研究其对羟自由基·OH 引发 DNA 氧化损伤的抑制作用。结果表明
样品中总黄酮含量为 4. 98%，回收率 99. 78%(RSD= 1. 06%，n = 5)。总黄酮浓度为 90μg /mL 时，对·OH 的
清除率可达 36. 2%;浓度为 87. 5μg /mL时，对羟自由基引发 DNA损伤的抑制率可达 93. 0%。说明鸡足山蕨
中总黄酮对羟自由基有较好的清除能力，对 DNA氧化损伤有显著抑制作用。
关键词:鸡足山耳蕨;总黄酮;抗氧化性;DNA损伤;还原能力
中图分类号:O629 文献标识码:A
Extraction of total flavonoids and studies on the anti-oxidative
activity in Polystichum jizhushanense
WEN Mei-qiong* ，XU Cheng-dong，GWAN Chun-ping，YANG Hong-wei，XU Cang-sheng，WANG Xian-jiao
(Department of Chemistry and Life Science，Chuxiong Normal University，Chuxiong 675000，China)
Abstract:The extraction method and anti-oxidative activity of the total flavonoids in Polystichum jizhushanense has been studied. For
the purpose，the flavonoids were ex-tracted with 70% ethanol，its content determined by NaNO2-Al(NO3)3 -NaOH spectro-photome-
try，the antioxidative activity of the extraction solution evaluated with Fenton and Prussian blue systems，the inhibitory effects in
Polystichum Jizhushanense on demage of DNA chain induced by hydroxyl free radical was observed by thiobarbituric acid spectrpho-
tometry. Experiments demonstrated that the content of the total flavonoids in Polystichum jizhushanense was 4. 98% and recovery
99. 78%(RSD=1. 06%，n=5) ;when the concentration of total flavonoids was 90μg /mL，it could purged 36. 2% hydroxyl free radi-
cal away;and with 87. 5μg /mL the DNA damage due to hydroxyl free radical could be decreased by 93. 0% . Polystichum jizhush-
anense can scavenge hydroxyl free radical efficiently，and it has the protective function to the demage of DNA caused by hydroxyl
free radical.
Key words:Polystichum jizhushanense;total flavonoids;anti-oxidative activity;DNA damage;reduction ability
黄酮类化合物(flavonoids)是一类重要的广泛
存在于自然界的天然有机化合物，在植物体中通
常以游离或与糖形成苷的形式存在。由于它具有
许多有益的生物学活性，如抗肿瘤作用，抗心血管
病作用，抗氧化抗衰老作用，抗菌、抗病毒作用，免
疫调节作用，抗炎镇痛作用，抗糖尿病作用，抗辐
射作用，酶抑制剂作用，影响神经中枢系统作用，
激素样作用等［1］，日益引起人们的重视，尤其是其
收稿日期:2011-08-10;修回日期:2011-10-29
基金项目:国家自然科学基金项目(30760040)资助
联系人简介:文美琼(1963-) ，女，副教授，主要从事分析化学教学及天然产物的开发利用研究工作。E-mail:ynwmq@ yahoo. com. cn
第 5 期 文美琼等:鸡足山耳蕨总黄酮的提取及抗氧化性研究
抗氧化活性。近年来研究表明，黄酮类化合物在
食品上的应用也越来越广泛，如天然色素，甜味
剂，抗氧化剂等［2］。
黄酮类化合物在蕨类植物中广泛分布，已发
现有 11 大类黄酮类化合物分布在蕨类植物中［3］。
鳞毛蕨科蕨类植物中具有生物活性的主要成分之
一亦即黄酮类化合物(尤其是黄酮醇及双氢黄酮
在鳞毛蕨科蕨类植物中广泛存在) ，它在药理及临
床有着重要的作用，如具有驱虫及抗日本血吸虫
作用;有抗菌和抗病毒作用;有宫缩、抗早孕及堕
胎作用;抗肿瘤作用;可加强巴比妥类药物的中枢
抑制作用;具有抗炎作用;抗凝血作用及降血压作
用等［4］。云南哀牢山具有世界上面积最大、保存
最完整的常绿阔叶林，蕴藏着丰富的蕨类植物区
系。其植物区系以鳞毛蕨科(Dryopteridaceae)和耳
蕨属(Polystichum)为主体［5］。有人对云南哀牢山
蕨类植物─鸡足山耳蕨(Polystichum jizhushanense，
鳞毛蕨科，耳蕨属)的抑菌活性作过研究，表明其
对大肠杆菌，枯草芽孢菌，金黄色葡萄球菌有抑制
作用［6］。
本文对云南哀牢山国家级自然保护区蕨类植
物─鸡足山耳蕨中总黄酮含量进行测定，并对其
抗氧化活性进行研究。旨在对云南哀牢山蕨类植
物的开发应用提供理论依据。
1 实验部分
1. 1 材料、仪器与试剂
鸡足山耳蕨(Polystichum jizhushanense)地上部
分由楚雄师范学院化学与生命科学系生物学教授
徐成东采自云南哀牢山并鉴定。
754 型紫外可见分光光度计(上海第三分析仪
器厂制造) ;PHS-3C型酸度计;HH-S2 型恒温水浴
锅(金坛市大地自动化仪器) ;CP214C型电子天平
(奥豪斯仪器有限公司制造) ;SHZ-IIIA 型循环水
式真空泵;DHG-85 型电热恒温鼓风干燥箱等。
芦丁(日本和光纯药工业株式会社) ;鲱鱼精
DNA(Sigma 公司) ;Tris(生化试剂) ;硫代巴比妥
酸(生化试剂) ;其余试剂均为国产分析纯。水为
实验室自制超纯水。
1. 2 总黄酮成分提取［7］
将鸡足山耳蕨地上部分晾干，粉粹。准确称
取 3 g样品，经石油醚脱脂后用 70%乙醇于 85℃
索式提取至溶液将近无色(4 h)。浓缩，定容于
100 mL容量瓶得样品液。
1. 3 提取液总黄酮成分的鉴别［8］
取样品液 1 mL 于试管中，用 Al(NO3)3、
NaOH、浓 H2SO4、FeCl3、浓氨水、HCl-Zn 等进行显
色反应。结果见表 1。
1. 4 总黄酮含量测定
1. 4. 1 标准曲线的绘制 准确称取已经过干燥
的芦丁标准品 0. 0200 g，加 70%乙醇溶解，定容到
100 mL容量瓶中，摇匀，得对照品溶液。
准确吸取芦丁标准液 0. 00，0. 50，1. 00，1. 50，
2. 00，2. 50，3. 00，3. 50，4. 00 mL 分别置于 10 mL
比色管中，加 0. 30 mL 5%亚硝酸钠溶液，混匀，放
置 6 min;加 0. 30 mL 10%硝酸铝溶液，混匀，放置
6 min;加 4. 00 mL 4%氢氧化钠溶液，再加 70%乙
醇至刻度，摇匀，放置 15 min，在 510 nm 波长处以
试剂空白为参比测吸光度，绘制标准曲线。
1. 4. 2 稳定性试验 将提取液稀释 10 倍后，准
确移取样品溶液 1. 00 mL，置于 10 mL 比色管中，
同 1. 4. 1 操作显色后，于 510 nm 处每隔 5 min 测
定一次吸光度，寻找络合物的显色稳定时间。
1. 4. 3 总黄酮含量的测定［9］ 将提取液稀释 10
倍后，准确移取样品溶液 1. 00 mL，置于 10 mL 比
色管中，同 1. 4. 1 操作显色后，放置 15 min，在 510
nm 波长处以同浓度提取液为参比测定吸光度。
根据标准曲线计算出样品液中黄酮的含量，同时
进行精密度试验和回收率试验。最后求出样品中
总黄酮含量。
1. 5 总黄酮提取物抗氧化活性研究
1. 5. 1 总黄酮提取物对羟自由基清除作用［10］
利用 Fenton 反应产生羟自由基·OH。在 10
mL比色管中加 9 mmol /L FeS042. 00 mL，9 mmol /L
水杨酸-乙醇溶液 2. 00 mL，不同浓度的总黄酮提
取液 1. 00 mL，加 8. 8 mmol /L H2022. 00 mL 启动
反应，加蒸馏水定容至刻度，37℃反应 0. 5 h，以蒸
馏水为参比，以试剂空白作比较，在 510 nm 处测
定各浓度的吸光度，考虑到提取液本身的吸光度，
在 10 mL比色管中加 9 mmol /L FeS04 2. 00 mL，9
mmol /L水杨酸-乙醇溶液 2. 00 mL，不同浓度的总
黄酮提取液 1. 00 mL，蒸馏水定容至刻度，37℃反
应 0. 5h，作为样品液的本底吸收。
·OH清除率(%)=
A0 － (Ax － Ax0)
A0
× 100
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化 学 研 究 与 应 用 第 24 卷
式中，Ao 为空白对照溶液吸光度;Ax 为样品
液吸光度;Axo 为不加 H202 样品液的本底吸光度。
试验以 Vc为对照，结果见图 1。
1. 5. 2 对羟自由基引发 DNA 损伤的抑制作用
参照文献［11］方法，有改进。准确移取 1. 00mL
0. 1mol /L Tris-HCl(pH7. 0)于 10mL 比色管中，加
入 1. 00mL 20μg /mL 的 DNA，1. 00mL 不同浓度的
总黄酮提取液，1. 00mL 25 mmol /L 的 FeSO4-ED-
TA，1. 00mL 3% 的双氧水，摇匀，37℃水浴保温
1. 5h后，用硫代巴比妥(TBA)法检测 532nm 波长
处测定吸光度 A，空白管以 1. 00mL 蒸馏水代替样
液测定 A0，计算抑制率。试验以芦丁为对照，结果
见图 2。
抑制率% = A0 － A /A0 × 100
1. 5. 3 还原能力的测定［12］ 用普鲁士蓝法测定。
取黄酮浓度分别为 0. 00，0. 01，0. 02，0. 03，0. 04，
0. 05，0. 06，0. 07 mg /mL 的提取液各 2. 00 mL，加
入 2. 50 mL 磷酸缓冲液(pH 6. 6，0. 2 mol /L) ，
2. 50 mL铁氰化钾溶液(质量分数 1%) ，在 50℃水
浴中反应 20 min，迅速冷却，并加入 2. 50 mL 三氯
乙酸(质量分数 10%) ，以 3000 r /min 离心 10
min，取上清液 2. 50 mL，并加入 2. 50 mL水及 0. 50
mL三氯化铁溶液(质量分数 0. 1%) ，混合均匀，
10 min后在 700 nm 处测其吸光度。反应物的吸
光度越大，表明还原能力越强。试验以 Vc 作对
照。结果见图 3。
2 结果与讨论
2. 1 提取液总黄酮成分的鉴别
显色反应结果由表 1 可以说明，提取物的主
要成分是黄酮类化合物。
2. 2 鸡足山耳蕨中总黄酮含量测定
回归方程为 A = 18. 083c + 0. 0045，R2 =
0. 9995，表明在 0. 01 g /L ～ 0. 081 g /L 实验测定范
围内，芦丁浓度与吸光度有良好的线性关系。黄
酮提取液显色稳定时间为 5 ～ 40 min。试验测得
鸡足山耳蕨地上部分总黄酮含量为 4. 98%(RSD
=2. 71%，n=5) ，回收率 99. 78%(RSD=1. 06%，n
=5)。
2. 3 总黄酮提取物对羟自由基清除作用
由图 1 可知，鸡足山耳蕨总黄酮对·OH 清除
作用有量效关系，清除率随着浓度增大而增大。
体系中黄酮浓度为 90 μg /mL 时，对·OH 的清除
率可达 36. 2%，同时可看出鸡足山耳蕨总黄酮对
·OH清除作用弱于 Vc。
图 1 鸡足山耳蕨对·OH的清除效果
Fig. 1 Scavenging effect of Polystichum jizhushanense
on·OH
2. 4 总黄酮提取物对羟自由基引发 DNA 损伤的
抑制作用
由图 2 可看出，加入样品后，DNA氧化损伤受
到抑制。抑制率随着黄酮浓度的增加而增大。与
芦丁标准品对照，反应体系中总黄酮对由羟自由
基引发 DNA 损伤半抑制率为 50%的浓度 IC50 =
0. 45 μg /mL，而对照品芦丁的 IC50 = 1. 1 μg /mL。
且当反应体系中总黄酮浓度小于 7. 5μg /mL时，总
黄酮对由羟自由基引发 DNA 损伤的抑制作用强
于芦丁。
图 2 鸡足山耳蕨对·OH引发 DNA
产生 MDA的抑制作用
Fig. 2 Inhibitory effect of Polystichum jizhushanense on
MDA generated by DNAinduced by·OH
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第 5 期 文美琼等:鸡足山耳蕨总黄酮的提取及抗氧化性研究
2. 5 总黄酮提取物还原能力
从图 3 中可看出，所加黄酮浓度在 0. 02 mg /
mL以下时，鸡足山耳蕨总黄酮显示出比 Vc 更强
的还原能力，且还原能力随黄酮浓度增大而线性
上升。以 Vc 作标准品作标准曲线(A = 10. 12c-
0. 00997 R2 = 0. 9993)来计算鸡足山耳蕨总黄酮的
还原能力。测定结果为每克鸡足山耳蕨干粉的还
原能力与 48. 72mgVc相当(48. 72mg /g)。 图 3 鸡足山耳蕨及 Vc的还原能力
Fig. 3 Reduction ability of Polystichum jizhushanense and Vc
表 1 70%乙醇提取液中黄酮的颜色反应
Table 1 Colour reaction of flavones in 70% ethanol extract solution
试剂 Al(NO3)3 NaOH 浓 H2SO4 Fe3+ 浓氨水 HCl-Zn
现象 黄色 亮黄色 橙黄色 墨绿色 黄色 橙红色
3 结 论
本文实验测得鸡足山耳蕨地上部分总黄酮含
量为 4. 98%(RSD= 2. 71%，n = 5) ，加标回收率为
100. 6%(RSD=1. 06%，n=5) ，说明该仪器精密度
高，回收率好，适合于总黄酮含量的测定。
实验表明鸡足山耳蕨总黄酮提取液对羟自由
基具有较强的清除作用;在一定浓度范围内，对由
羟自由基引发 DNA 损伤的抑制作用强于芦丁，有
比 Vc还强的还原能力。
综上所述，鸡足山耳蕨作为天然抗氧化剂，具
有较高的开发利用价值。
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(责任编辑 李 方)
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