全 文 ：·栽培与育种·
蛇床种内变异的 RAPD分析
张巧艳　秦路平　郑汉臣　黄宝康　年　华　陈　磊
(第二军医大学药学院 ,上海 200433)
　　摘要　目的:从 DNA分子水平上探讨不同地区产蛇床的种内变异。方法:用随机扩增多态性 DNA(RAPD)技
术分析 9个产地的蛇床基因组 DNA多态性 ,并构建树状聚类图。结果:从20 个10bp随机引物中筛选出12 个有效
引物 , 共扩增出 75条 DNA 带 ,其中 64 条表现出多态性。结论:地理分布距离越小 , 蛇床的遗传差异越小 , 反之越
大 ,但生态环境对蛇床遗传变异的作用也不可忽视。
关键词　蛇床　种内变异　RAPD
　　伞形科蛇床 Cnidium monnieri Cusson.的果实
为常用中药蛇床子 ,具有清热燥湿 、杀虫的作用。文
献报道不同产地蛇床果实的形态 、化学成分及同工
酶存在明显的变异 。目前 , RAPD 分析已广泛应用
于种质资源分析 、品种鉴定 、遗传连锁图谱的构建及
基因定位等领域〔1 、2〕 。本研究通过不同产地蛇床
RAPD的分析 ,探讨蛇床种内的遗传变异 ,为进一步
发掘和充分利用蛇床资源提供理论依据 。
1 　材料和方法
1.1 　材料来源　实验所用材料为 1999年 6 ～ 8月
采自上海佘山 、江苏句容 、江苏徐州 、江苏大丰 、山东
商河 、陕西大荔 、河北正定 、辽宁瓦房店及黑龙江肇
东等地的蛇床果实 , 2000 年 10月种植于第二军医
大学药用植物园 , 2001 年 3 月采收栽培的新鲜叶
子。
1.2 　药品试剂　液氮 、CTAB 缓冲液(50 mmol/L
Tris-HCl ,pH 8 ,0.7mol/L NaCl , 10mmol/L EDTA ,
pH 8 , 1%CTAB , 20mmol/L 2-巯基乙醇)、RNase A
(灭活 ,无 DNase活性)、TE 缓冲液 、琼脂糖 、溴化乙
啶 、凝胶上样缓冲液 、10×TBE 缓冲液购自华舜生
物工程公司;寡核苷酸引物 、TaqDNA 聚合酶 、dNTP
购自上海生工生物工程有限公司。
1.3 　仪器设备　PCR扩增仪(PE 公司 480型热循
环仪),琼脂糖凝胶电泳槽 ,紫外透射仪 ,离心机等 。
1.4 　方法
1.4.1 　DNA 提取:采用 CTAB 法〔3〕 ,将 2g 经去淀
粉处理的新鲜蛇床叶子用液氮速冻 ,在研钵中磨碎 ,
化冻前转移至 10 ml离心管中 , 加入 4 ml预热至
90℃的 2×CTAB提取缓冲液 ,轻轻转动离心管 ,混
匀 ,置 65℃水浴90min ,放置 ,使冷至室温 ,加入等体
积的氯仿-异戊醇(24∶1)。颠倒离心管几次 ,使管内
混合物呈乳浊液 , 5000g 离心 10 min ,将上 层水相
转移至另一离心管中 ,加入 1%体积 RNase A 储液 ,
混匀 。37℃保温 30 min ,加入0.7体积的异丙醇 ,室
温放置 15 min沉淀 DNA 。离心 ,分离 DNA ,分别用
76%乙醇 、0.2 mol/L 乙酸钠洗涤沉淀 DNA。空气
干燥 15 min ,将 DNA 溶解于尽可能少的 TE缓冲液
中 。
1.4.2 　基因组 DNA 的扩增:PCR反应总体积为
20 μl ,其组成为:引物 0.2μmol/L ,Taq DNA聚合酶
1u , dN TP 200μmol/L , MgCl2 2mmol/L , 基因组
DNA10 ng ,反应液上加矿物油 30μl。扩增采用 3步
PCR法:a.94℃4 min ,36℃1.5 min , 72℃1.5 min ,
1个循环;b.94℃1min , 36℃1.5min , 72℃1min , 38
个循环;c.最后 72℃延伸 5 min ,4℃保温。
1.4.3 　电泳及 DNA 多态性观察:将基因组 DNA
的扩增产物在 1.5%琼脂糖凝胶中电泳 , EB 直接加
在凝胶中 ,终浓度为 0.5 mg/L , 5V/cm ,电泳 1 h。
PCR扩增产物长度与100bpDNA ladder标记物进行
比较 ,在紫外检测仪上观察扩增产物的多态性 ,并记
录 、照相 。
1.4.4 　数据统计分析:每个样品按琼脂糖凝胶同
一位置上 DNA 带的有无进行统计 , 有带(包括弱
带)的计为“1” ,无带的计为“0” ,根据 Nei和 Li的方
法计算样品间的简单遗传相似系数 F , F=2×mxy/
(mx +my),其中 mx 、my为两样品的总扩增带数 , mxy
为两样品共有的扩增带数〔4〕 。利用 Neiborgh-Joint
软件 ,按非加权算术平均数聚类方法(UPGMA)计
算产地间的遗传距离 ,建立产地间的聚类图。
2 　结果与分析
2.1 　DNA 提取　提取的蛇床基因组 DNA ,通过琼
脂糖凝胶电泳 , 可见不同产地蛇床的基因组 DNA
片段大小一致 ,分子量为 20Kb ,说明提取到了较完
整的基因组 DNA。
2.2 　引物筛选　从 20个 10 bp随机引物中筛选出
12个有效引物 ,共扩增出 75条 DNA带 ,其中 64条
表现出多态性 ,占总带数的 85.3%(表)。不同引物
·469·中药材第 27 卷第 7 期 2004 年 7 月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2004.07.001
得到蛇床 9个产地的基因组 DNA 指纹图谱。图 1
是利用随机引物所得的不同产地蛇床的基因组
RAPD扩增图谱 。
　表 引物及其序列和扩增结果
引物 序列 总扩增带数 多态性扩增带数
S1304 AGGAGCGACA 7 7
S1323 CCAAGAGGCT 4 4
S1300 TCATGCGCAC 7 7
S1238 GTTGCGCAGT 6 6
S1239 TGACAGCCCC 4 4
S228 GGACGGCGTT 8 6
S346 TCGTTCCGCA 8 8
S238 TGGTGGCGTT 9 9
S326 GTGCCGTTCA 5 3
S330 CCGACAAACC 5 3
S220 GACCAATGCC 7 6
S296 GGGCCAATGT 5 1
总计 　　 12 75 64
图 1　不同产地蛇床样品的 RAPD指纹图谱
A.引物 S228 　B.引物 S1304 　C.引物 S238 　D.引物
S1323　E.引物 S1300　F.引物 S1238
1.江苏句容　2.河北正定　3.上海佘山　4.江苏徐州　
5.山东商河　6.辽宁瓦房店　7.江苏大丰　8.陕西大荔
9.黑龙江肇东
图 2　不同产地蛇床的 RAPD 分析系统聚类图
2.3 　不同产地蛇床之间的遗传差异　用 Nei和 Li
的遗传相似系数建立不同产地蛇床的遗传关系聚类
图(图 2)。不同产地蛇床 RAPD分析的相似系数在
0.63 ～ 0.86之间 ,表明生长在不同地区的蛇床具有
较近的遗传关系 ,同时其 DNA 也发生了一定的变
异 。
由图 2可以看出次序 1为江苏句容和江苏徐州
首先聚为一组 ,次序 2为陕西大荔与次序 1的聚类 ,
次序 3 为上海佘山和辽宁瓦房店聚为一组 ,次序 4
为河北正定与次序 2聚为一组 ,次序 5 为江苏大丰
与次序 4聚为一类 ,次序 6 为黑龙江肇东与次序 5
聚为一类 ,次序 7为次序 3与次序 6聚为一类 ,次序
8为山东商河与次序 7聚为一类。
3 　讨论
蛇床为广布种 , 我国除西藏外各个省区均有。
由于地理位置和生态环境的差异 ,其果实中所含的
化学成分发生了较大的变化。据报道分布于浙江 、
江苏等地的蛇床含有简单香豆素和线型呋喃香豆素
类物质;分布于黑龙江 、辽宁等地的蛇床主要含有角
型呋喃香豆素类物质;分布于陕西 、河北等地的蛇床
果实既含有线型呋喃香豆素 ,又含有角型呋喃香豆
素 ,为两者的混合过渡类型〔5〕。
本研究结果的聚类分析可以看出 ,江苏句容和
江苏徐州首先聚为一类 ,表明两者的亲缘关系较近。
接着陕西大荔 、上海佘山 、辽宁瓦房店 、河北正定 、江
苏大丰及黑龙江肇东依次与他们聚类 ,说明因地理
位置的不同 ,植物的生长环境发生了变化 ,其体内的
代谢过程发生了一定的改变 ,其遗传物质 DNA 发
生了一定的变异。特别是黑龙江肇东的样品与江苏
句容和徐州的相比 ,距离较大。这一结果与蔡金娜
等〔6〕对不同地区蛇床的 rDNA 和 I TS 的 DNA序列
测定的结果基本一致。
值得注意的是上海佘山与辽宁瓦房店的样品聚
为一类 ,山东商河与其它地区样品距离较远 ,其原因
可能有两方面:(1)上海佘山 、江苏大丰和山东商河
·470· 中药材第 27 卷第 7期 2004 年 7 月
这几个地区的样品 ,因所在地区的整体生态环境不
相一致 。在蛇床资源的调查过程中 ,发现同一个地
区 ,生长在湿润环境下和生长在较干旱环境下的蛇
床 ,其果实的大小和形状有较大的差别;(2)与
RAPD这一研究方法的局限性有关 ,因为 RAPD 所
用的随机引物是 10寡聚体核苷酸 ,扩增反应还会受
到模板 DNA 用量 、dN TP 用量 ,Mg2+、及 Taq 酶的
浓度等诸多因素的影响 ,同时还与实验所用的引物
数目有关 ,本研究注重扩增反应条件和体系的相对
固定一致 ,但所用的引物数目较少 ,可能是产生结果
差异的原因之一 。
参 考 文 献
1 　Wei J Z , et al.Genome and species-specific markers and
genome rela tionships of diploid perennial species in T rit-
icease on RAPD analyses.Genome , 1997 , 38∶1230
2 　Wei J Z , e t al.Gene tic v ariability in Russian wild-rye
(Psathyrostachys juncea assessed by RAPD.Genetic Re-
sources and Crop Evolution , 1997 , 44∶117
3 　Murray M G , et al.Rapid isolation of high molecular w eight
plant DNA.Nucleic Acid Res., 1980 , 8∶4321
4 　Nei M , et al.Mathematical model fo r studying genetic vari-
a tion in terms o f restriction endonuclease.Proc Natl Acad
Sci , 1979 , 76∶5269
5 　蔡金娜 , 等.蛇床果实中香豆素类成分的变异及其规
律.药学学报 , 1999 , 34(10)∶767
6 　蔡金娜 ,等.中国不同地区蛇床的 rDNA、ITS 序列分析
.药学学报 , 2000 , 35(1)∶56
(2003-10-28收稿)
Analysis on Intraspecific Variation of Cnidium monnieri by RAPD
Zhang Qiaoyan , Qin Luping , Zheng Hanchen , Huang Baokang , Nian Hua , Chen Lei
(College o f Pharmacy , Second M ilitary Medical University , Shanghai 200433)
Abstract　Objective:To study the genetic varia tion of Cnidium monnieri from different regions.Methods:Random amplified
polymophic DNA technique was used to analyze genetic polymorphy o f Cnidium monnieri from 9 different regions , and dendrog ram
w as constructed by UPGMA.Results:20 random primers were used fo r polymorphic selection.A total of 75 bands were amplified , 64
of w hich were polymo rphism.Conclusion:The smaller the geog raphic distances between two Cnidium monnieri , the smaller genetic
differences.How ever , it should no t be overlooked that natural environment , especially the local ecological conditions may also show
some influences on the genetic variations among different C.monnieri samples.
Key words　Cnidium monnieri ;I ntraspecific variation;RAPD
半夏总生物碱含量的动态变化
曾建红1　彭正松1　宋经元2　马小军2　魏淑红1　罗雍成3
(1.西华师范大学生物系 ,南充 637000;2.中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所 , 北京
100094;3.南充顺康原药业有限公司 ,南充 637002)
　　摘要　目的:测定半夏不同生长期总生物碱的含量 , 为确定合理的采收期提供依据。方法:采用氯仿提取 , 依
据酸性染料比色法的原理 ,在 417 nm 波长下测定 ,并作方差分析。结果:获得良好的线性关系(r=0.9989)和回收
率(100.1%), RSD为 2.3%。半夏不同生长期总生物碱含量差异显著(F=12.789 , P<0.01)。结论:测定方法简
单快速;半夏不同生长期总生物碱含量以全苗期最高 , 每株平均总生物碱产量以集中倒苗期最高 ,半夏最佳采收期
以集中倒苗期为宜。
关键词　半夏　总生物碱　动态变化　生长期
　　天南星科半夏 Pinellia ternate (Thunb.)Breit
在我国大部分地区以及朝鲜半岛和日本均有分布 。
半夏块茎主要含有生物碱 、β-谷甾醇 、多糖 、半夏蛋
白 、氨基酸 、挥发油及无机元素等多种化学成
分〔1 、2〕 ,具有燥湿化痰 、降逆止呕 、消痞散结之功效 。
目前市售镇咳类中药复方制剂中多含有半夏 ,而生
物碱在众多的化学成分中具有明显的生物活性和药
理学活性 ,是中药半夏中主要有效成分 ,其含量高低
直接影响药材的质量与疗效 。国内外对半夏生物碱
含量的研究已做了大量工作〔3 ～ 8〕 ,但半夏不同生长
期生物碱含量的研究尚未见报道 。本研究采用酸性
染料比色法测定半夏不同生长期总生物碱的含量 ,
·471·中药材第 27 卷第 7 期 2004 年 7 月