全 文 ：［生化与农业 ］
三种滇龙胆叶片总ＲＮＡ提取方法的比较①
张 海 晨　张 晓 东②
（玉溪师范学院 资源环境学院，云南 玉溪６５３１００）
［关键词］滇龙胆；总ＲＮＡ；提取方法；异硫氰酸胍法；试剂盒法
［摘　要］分别使用传统异硫氰酸胍法和 Ｔａｋａｒａ公司的两种试剂盒来提取滇龙胆幼叶的总
ＲＮＡ，比较所提取ＲＮＡ质量和纯度．结果表明，三种方法各有优缺点，但 ＭｉｎｉＢＥＳＴ　Ｐｌａｎｔ　ＲＮＡ
Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ试剂盒提取的ＲＮＡ质量好、纯度高、提取效率高，且无基因组污染，优于其他两
种方法，而异硫氰酸胍法从经济的角度考虑则最为实惠．
［作者简介］张海晨，研究方向：植物分子生物学．
［中图分类号］Ｏ１５７．１［文献标识码］Ａ［文章编号］１００９－９５０６（２０１５）０８－００２６－０３
滇龙胆是多年生草本植物，主要产自云南、四川、湖南、广西等地［１］．滇龙胆具有悠久的药用历史，始载
于《神农本草经》：“主骨间寒热，惊痫邪气，续绝伤，定五脏，杀蛊毒”．龙胆野生于海拔４００～１　７００ｍ的山
坡草甸、山坡及灌木从中，喜阳光充足，较湿润的地方，喜凉爽气候，耐寒［２，３］．文献检索结果表明，目前在
分子方面对滇龙胆的研究很少．然而，要从分子生物学角度研究滇龙胆，首先要对滇龙胆的总ＲＮＡ进行
提取，获得纯度高、完整性好的ＲＮＡ．本研究分别采用三种方法提取滇龙胆叶片中的总ＲＮＡ，并通过琼脂
糖凝胶电泳进行检测，比较三种方法的优缺点．
１　材料与方法
实验材料　滇龙胆无菌苗培养采用 ＭＳ培养基培养，光周期为１６ｈ光照、８ｈ黑暗．取滇龙胆幼叶，于
天平中准确称量０．１ｇ进行总ＲＮＡ的提取．实验所用研钵、研杵、离心管、枪头等均用０．１％ＤＥＰＣ（焦碳
酸二乙酯）进行处理．
实验方法　采用异硫氰酸胍法、试剂盒法１、试剂盒法２三种方法来提取滇龙胆叶片中的总ＲＮＡ．
（１）异硫氰酸胍法提取总ＲＮＡ．其提取步骤如下：①称取０．１ｇ叶片，迅速放入预先预冷的研钵中，加
液氮研磨，直到研磨成粉末状．②加入０．９ｍＬ异硫氰酸胍提取液（４Ｍ 异硫氰酸胍，２５ｍＭ 柠檬酸三钠，
０．５％（ｗ／ｖ）十二烷基肌氨酸，２％（ｗ／ｖ）聚乙烯吡咯烷酮），继续研磨成水状，转移至１．５ｍＬ离心管，轻轻
摇动离心管使混合均匀．③加入１／１０体积的２Ｍ 醋酸钠（ｐＨ＝４．２）、氯仿０．３ｍＬ，合盖后剧烈震荡
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玉溪师范学院学报（第３１卷）２０１５年第０８期　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｙｕｘｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．０８Ａｕｇ．２０１５
①
②
基金项目：云南省大学生创新项目，编号：２０１４１１３９０００１．
通信作者：张晓东，博士，研究方向：植物代谢基因工程．Ｅｍａｉｌ：ｚｘｄ９５＠１２６．ｃｏｍ．
２ｍｉｎ，然后冰浴５ｍｉｎ．④４℃、１２　０００ｒｐｍ离心１５ｍｉｎ后，将上清转移至新的离心管中；⑤加入等体积氯
仿，合盖后剧烈震荡２ｍｉｎ，然后冰浴５ｍｉｎ．⑥４℃、１２　０００ｒｐｍ离心１５ｍｉｎ后，将上清转移至新的离心管
中；⑦加入等体积异丙醇，在－２０℃沉淀 ＲＮＡ　３０ｍｉｎ，４℃、１２　０００ｒｐｍ 离心２０ｍｉｎ．⑧ＲＮＡ 沉淀经
７５％乙醇清洗两次后，常温干燥５ｍｉｎ；⑨加入２０μｌ　ＤＥＰＣ处理水彻底溶解ＲＮＡ．⑩采用１．２％的琼脂糖
凝胶电泳检测ＲＮＡ．
（２）试剂盒法１：ＲＮＡｉｓｏ　ｆｏｒ　Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｒｉｃｈ　Ｐｌａｎｔ　Ｔｉｓｓｕｅ，提取步骤如下：①取０．１ｇ样品，使用液
氮研磨至粉末状．②加入１ｍＬ提取液，继续研磨至水状，转移至１．５ｍＬ离心管中．③４℃、１２　０００ｇ离心
５ｍｉｎ．④吸取上清液至新的１．５ｍＬ离心管中．⑤向上述上清液中加入１／５体积的５ＭＮａＣｌ和３／５体积
的氯仿．盖紧离心管盖，用手剧烈振荡１５ｓ，室温静置５ｍｉｎ．⑥４℃、１２　０００ｇ离心１５ｍｉｎ．⑦吸取上清液转
移至另一新的离心管中，加入１／２体积的异丙醇和１／２体积的高盐溶液，颠倒混匀后，室温静置１０ｍｉｎ．
⑧４℃、１２　０００ｇ离心１５ｍｉｎ．⑨弃上清，加入７５％乙醇１ｍＬ清洗沉淀．⑩室温干燥沉淀５ｍｉｎ后，使用
２０μｌＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ水溶解沉淀，再采用１．２％的琼脂糖凝胶电泳检测ＲＮＡ．
（３）试剂盒法２：Ｔａｋａｒａ　ＭｉｎｉＢＥＳＴ　Ｐｌａｎｔ　ＲＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，实验步骤如下：①称量０．１ｇ样品，使
用液氮研磨成粉末状，加入到４５０μｌ　Ｂｕｆｆｅｒ　ＲＬ继续研磨成水状，然后转移至１．５ｍＬ离心管中．②４℃、
１２　０００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ，将上清转移至新的１．５ｍＬ离心管中，加入上清液１／２体积的无水乙醇，混匀．
③立即将混合液转入到ＲＮＡ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎ中，常温１２　０００ｒｐｍ离心１ｍｉｎ，弃滤液．④将５００μｌ的Ｂｕｆｆｅｒ
ＲＷＡ加入ＲＮＡ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎ中，常温１２　０００ｒｐｍ离心３０ｓ，弃滤液．⑤将６００μｌ的Ｂｕｆｆｅｒ　ＲＷＢ加入
ＲＮＡ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎ中，常温１２　０００ｒｐｍ 离心３０ｓ，弃滤液．⑥向 ＲＮＡ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎ膜中央加入５０μｌ
ＤＮａｓｅ　Ｉ反应液，室温静置１５ｍｉｎ．⑦向 ＲＮＡ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎ膜中央加入３５０μｌ的Ｂｕｆｆｅｒ　ＲＷＢ，常温
１２　０００ｒｐｍ离心３０ｓ，弃滤液．⑧重复步骤⑤，将ＲＮＡ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎ重新安置于２ｍＬ　Ｃｏｌｅｃｔｉｏｎ　Ｔｕｂｅ上，
常温１２　０００ｒｐｍ离心２ｍｉｎ．⑨将ＲＮＡ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎ安置于１．５ｍＬ离心管上，在ＲＮＡ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎ膜
中央处加入３０μｌ的０．１％ＤＥＰＣ处理水，室温静置５ｍｉｎ．⑩常温１２　０００ｒｐｍ离心２ｍｉｎ洗脱总ＲＮＡ，采
用１．２％的琼脂糖凝胶电泳检测ＲＮＡ．
２　结果和分析
使用１．２﹪琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如附图．由附图可知，三种方法提取植物的总ＲＮＡ在质
量方面都不错，条带清晰，２８Ｓ的亮度是１８Ｓ的亮度的两倍以上，证明所提取的ＲＮＡ完整度较好．
附图　１．２﹪琼脂糖凝胶电泳检测结果
但是，三种方法都有各自的优缺点．（１）使用异硫氰酸胍法提取总ＲＮＡ时，其步骤比较繁琐，稍有操
作不当就可能前功尽弃，粗提的总ＲＮＡ中含有较多的基因组ＤＮＡ（附图Ａ），需要进一步除去基因组的
步骤，耗时费力．但异硫氰酸胍法的优点是成本低、提取量可大可小．（２）ＲＮＡｉｓｏ　ｆｏｒ　Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ｒｉｃｈ
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张海晨　张晓东：三种滇龙胆叶片总ＲＮＡ提取方法的比较
Ｐｌａｎｔ　Ｔｉｓｓｕｅ试剂中含有大量的还原剂，可避免多酚类物质在提取过程中被氧化而导致ＲＮＡ的降解；该
试剂不含有苯酚等挥发性有毒成份，对实验人员毒害性较小．但该试剂盒提取的总ＲＮＡ中也含有基因组
（附图Ｂ），也要进行除基因组的步骤，步骤繁琐，但其优点是提取出的总 ＲＮＡ 的量大．（３）ＭｉｎｉＢＥＳＴ
Ｐｌａｎｔ　ＲＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ试剂盒具有高效、快速、方便之特点，操作时间也短；提取过程中无需苯酚氯仿
抽提等步骤．利用该试剂盒提取的总ＲＮＡ纯度高，基本不含有蛋白质及基因组ＤＮＡ的污染．但其缺点是
价格较高．ＭｉｎｉＢＥＳＴ　Ｐｌａｎｔ　ＲＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ试剂盒法的提取结果见（附图Ｃ）．
３　讨　论
目前，关于ＲＮＡ的提取方法有很多种，但每种方法都有其优缺点．但总体看，本文所采用的三种方法
提取出的总ＲＮＡ的质量和纯度均能满足一般的分子操作的要求．
在分子实验中，获得纯度高、完整性好的ＲＮＡ是实验成功的前提．提取得到的ＲＮＡ可以直接用于
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交、斑点杂交、ｍＲＮＡ纯化、体外翻译、ＲＮＡ分解酶的保护分析、ＲＴ－ＰＣＲ、Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＲＴ－
ＰＣＲ、构建ｃＤＮＡ文库等各种分子生物学实验．在ＲＮＡ提取和检测过程中，外源性ＲＮａｓｅ主要来自所用
的器皿、缓冲液和移液器等，因此在实验过程中要注意彻底去除外源ＲＮａｓｅ的污染．
滇龙胆是云南的地道药材，但由于其市场需求不断增大且其生长缓慢，造成人为滥采滥挖，进而导致
野生滇龙胆数量日渐减少，所以保护野生龙胆刻不容缓［４］．
参考文献：
［１］杨雁，邵爱娟，金航，等．云贵高原滇龙胆不同居群形态特征变异研究［Ｊ］．中草药，２０１２，４３（８）：１６０４－１６１０．
［２］唐荣平，苏汉林，王建光，等．滇龙胆草资源调查及繁殖特性研究［Ｊ］．山地农业生物学报，２０１２（５）：４６０－４６３．
［３］张金渝，沈涛，杨维泽，等．云南道地药材滇龙胆资源调查与评价［Ｊ］．植物遗传资源学报，２０１２（５）：８９０－８９５．
［４］唐荣平，苏汉林，阳小勇，等．滇西南药用植物滇龙胆草的致危因素和保护策略探讨［Ｊ］．山地农业生物学报，２０１３
（５）：４４５－４４７，４７０．
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　Ｔｈｒｅｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
ｏｆ　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｉｎ　Ｇｅｎｔｉａｎａｒｉｇｅｓｃｅｎｓ　Ｌｅａｆ
ＺＨＡＮＧ　Ｈａｉｃｈｅｎ　ＺＨＡＮＧ　Ｘｉａｏｄｏｎｇ
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，Ｙｕｘｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙｕｘｉ，Ｙｕｎｎａｎ　６５３１００，Ｃｈｉｎａ）
Ｋｅｙ　Ｗｏｒｄｓ：Ｇｅｎｔｉａｎａ　ｒｉｇｅｓｃｅｎｓ；ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｇｕａｎｉｄｉｎｅ　ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ；ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｋｉｔｓ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｉｔｈ　ｙｏｕｎｇ　ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｔｉａｎａｒｉｇｅｓｃｅｎｓ　ａｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｍａｔｅｒｉａｌ，ｉｔｓ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｗａｓ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ
ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｇｕａｎｉｄｉｎｅ　ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ　ａｎｄ　ｔｗｏ　ｋｉｔｓ　ｏｆ　ＴａＫａＲａ　Ｃｏｍｐａｎｙ．Ｔｈｅ　ｑｕａｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｗｅｒｅ　ｃｏｍｐａｒｅｄ．
Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｇｕａｎｉｄｉｎｅ　ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｅｃｏｎｏｍｉｃａｌ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｍｉｎｉ　ＢＥＳＴ　Ｐｌａｎｔ　ＲＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
ｋｉｔ　ｗａｓ　ｓｕｐｅｒｉｏｒ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｏｔｈｅｒ　ｔｗｏ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｂｅｃａｕｓｅ　ｉｔｓ　ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ　ＲＮＡ　ｉｓ　ｏｆ　ｈｉｇｈ　ｑｕａｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｔｙ，ａｎｄ　ｉｔ　ｉｓ　ｈｉｇｈｌｙ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ
ａｎｄ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ．
收稿日期：２０１５年２月１９日
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玉溪师范学院学报