全 文 ：第二军医大学学报 2013 年 2 月第 34 卷第 2 期 http:/ /www． ajsmmu． cn
Academic Journal of Second Military Medical University，Feb． 2013，Vol． 34，No． 2
· 195·
DOI:10． 3724 /SP． J． 1008． 2013． 00195 ·论 著·
一测多评法测定芹菜籽中芹菜甲素、芹菜乙素和新蛇床内酯
徐 娜，陈海生*
第二军医大学药学院天然药物化学教研室，上海 200433
［摘要］ 目的 建立一测多评法同时测定芹菜籽中芹菜甲素、芹菜乙素和新蛇床内酯的含量，验证该方法在芹菜籽中应
用的准确可行性。方法 以芹菜籽原料药中主要成分芹菜甲素、芹菜乙素和新蛇床内酯为指标，在一定范围内建立芹菜甲素
与芹菜乙素、芹菜甲素与新蛇床内酯的校正因子。测定芹菜甲素的含量，测得校正因子 f芹菜甲素 /芹菜乙素 = 0． 226;用校正因子测定
芹菜乙素和新蛇床内酯的含量，测得校正因子 f芹菜甲素 /新蛇床内酯 = 0． 702，同时，采用外标法测定 6 批不同批次中 3 个成分的含量，
以验证一测多评法的准确性和科学性。结果 不同仪器所得相对校正因子的 RSD为 4． 4% ～ 6． 7%，同一台仪器不同色谱柱
所得相对校正因子的 RSD为 2． 3% ～ 3． 6%，建立的校正因子重现性良好，原料药中采用校正因子计算的含量值与外标法实测
值之间没有明显差异。结论 在缺乏对照品的情况下，该方法可用于芹菜籽中多成分质量评价研究。
［关键词］ 一测多评法;相对校正因子;芹菜籽提取物;芹菜甲素;芹菜乙素;新蛇床内酯
［中图分类号］ R 931． 5 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 0258 － 879X(2013)02 － 0195 － 04
Quantitative analysis of multi － components with single marker in simultaneous determination of 3 － n －
butylphthalide，sedenenolide，and sedanolide in celery seed extract
XU Na，CHEN Hai － sheng*
Department of Natural Medicinal Chemistry，School of Pharmacy，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China
［收稿日期］ 2012 － 11 － 15 ［接受日期］ 2013 － 01 － 05
［基金项目］ 上海市中药现代化基金(09DZ1974000) ，上海市重点学科建设项目(B906)． Supported by Foundation for Modernization of Traditional
Chinese Medicine of Shanghai (09DZ1974000)and Project for Key Discipline Construction of Shanghai (B906)．
［作者简介］ 徐 娜，硕士． E － mail:woshixuna1986@ 163． com
* 通信作者(Corresponding author)． Tel:021 － 81871250，E － mail:haishengc@ hotmail． com
［Abstract］ Objective To develop a quantitative analysis of multi － components with single marker (QAMS)and validate its
accuracy and feasibility for simultaneously determining 3 － n － butylphthalide (b) ，sedenenolide (sen) ，and sedanolide (san)in
celery seed extracts (CSE)． Methods Three main effective components，3 － n － butylphthalide，sedenenolide，and sedanolide，were
selected as analytes for evaluating the quality of CSE． The relative correction factors (RCF，f)of 3 － n － butylthalide to the other two
thalides were calculated:fb / sen = 0． 226，fb / san = 0． 702． The external standard method was used to determine the title compounds in 6
batches of CSE and the results were compared with those of QAMS． Results The RSD of RCF calculated by different instruments was
between 4． 4% － 6． 7% ． The RSD of RCF calculated by the same instrument with different chromatographic columns was between 2． 3%
－ 3． 6% ． The established RCF had a good reproducibility． The quantitative results of three thalides determined by external standard
method and QAMS method were not significantly different． Conclusion The present method can serve as a new mode to determine
multi － components in CSE when standard substances are unavailable．
［Key words］ quantitative analysis of multi － components by single marker;relative correction factor;celery seed extracts;3 －
n － butylphthalide;sedenenolide;sedanolide
［Acad J Sec Mil Med Univ，2013，34(2) :195 － 198］
芹菜籽为芹菜的种子，常应用于调味品和食品
中，它含有丰富的维生素及挥发性芳香成分，有极好
的药用价值。印度传统医学中，芹菜籽常用来补充
维生素、镇静、解热镇痛、利尿、消炎、解痉挛［1］，我国
传统中医认为芹菜籽具有散气、消肿、利尿、降低血
压等功效。目前其主要用于治疗高血压、降血脂、抗
氧化等［2］，本课题组前期对青芹籽进行研究，发现其
乙酸乙酯部位有良好的黄嘌呤氧化酶抑制活性和抗
炎镇痛、降尿酸作用，可作为抗痛风原料药(未发表
资料)。
根据苯酞类含量测定的文献报道［3 － 6］，芹菜甲
素和新蛇床内酯的含量测定主要通过高效液相色谱
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(HPLC)外标法进行检测。目前为止，还没有关于芹
菜乙素含量测定的报道，由于芹菜乙素单体不稳定，
不易得，本研究采用校正因子一测多评法(QAMS) ，
同时测定芹菜乙素、芹菜甲素和新蛇床内酯的含量，
首次建立校正因子法测定芹菜乙素含量，为芹菜籽
药材质量标准的建立奠定基础。
1 仪器和试药
LC － 10AT 液相色谱仪(日本 Shimadzu 公司) ，
紫外检测器，自动进样器，在线脱气;LC Solution 色
谱工作站(Shimadzu 公司)。Agilent 1100 高效液相
色谱系统，Agilent Chemstation 工作站(美国 Agilent
公司) ;色谱柱 Diamonsil C18 (美国 Dikma 公司，
4． 6 mm × 250 mm，5 μm) ，Diamonsil C18 (2)
(4． 6 mm ×250 mm，5 μm) ，Waters symmetry C18(4． 6
mm ×250 mm，5 μm)。BSA124S 型电子天平(德国
Sartorius公司)。SK5200H型超声仪(上海科导超声
仪器有限公司)。
色谱纯乙腈、甲醇 (美国 J． T． Baker 公司) ;分
析纯甲醇、乙醇(国药集团化学试剂有限公司) ;Milli
－ Q纯水系统制备的去离子水(美国 Millipore 公
司) ;乙酸、磷酸(国药集团化学试剂有限公司)。对
照品芹菜甲素、芹菜乙素、新蛇床内酯均为自制，
HPLC纯度均 ＞ 98%(面积归一化法) ;芹菜籽原料
药为自制。
2 方法和结果
2． 1 原理 在一定的线性范围内，成分的量(质量
或浓度)与检测器响应成正比，即:W = f × A。在多指
标质量评价时，以药材中某一典型组分(有对照品供
应者)为内标，建立该组分与其他组分之间的相对校
正因子，通过校正因子计算其他组分的含量。这种
测定一个成分，实现对多个成分定量的方法命名为
QAMS［7 － 9］。
校正因子定义如下:假设某样品中含有 i 个组
分，存在
Wi /Ai = fi(i = 1，2，…，k，…，m) (1)
式中 Ai为组分 i 的峰面积;Wi为组分 i 的质量。
选取其中一组分 k为内标，建立组分 k与其他组分 m
之间的相对校正因子，有
fk /m = fk / fm =(Wk × Am)/(Wm × Ak) (2)
由此可导出定量计算公式:
Wm =(Wk × Am)/(fk /m × Ak) (3)
式中 Ak为内标物峰面积，Wk为内标物质量;Am
为组分 m的峰面积，Wm为组分 m的质量。
2． 2 方法学考察
2． 2． 1 色谱条件的确定 色谱柱为 Diamonsil C18
(美国 Dikma 公司，4． 6 mm × 250 mm，5 μm ) ;流动
相为乙腈 － 0． 3%磷酸水(50∶50)溶液;双波长检测
235 nm(芹菜甲素、新蛇床内酯)和 270 nm(芹菜乙
素) ;流速为 1． 0 mL /min，柱温 30℃。图谱见图 1。
图 1 对照品(A 270 nm，B 235 nm)和
样品(C 270 nm，D 235 nm)的 HPLC 图谱
Fig 1 HPLC of reference substance (A 270 nm，B 235 nm)
and sample (C 270 nm，D 235 nm)
1:Sedenenolide;2:3 － n － butylphthalide;3:Sedanolide
2． 2． 2 对照品溶液制备 分别精密称定芹菜甲素
10． 2 mg、芹菜乙素 10． 8 mg、新蛇床内酯 10． 2 mg，各
置于 50 mL容量瓶中，用甲醇溶解稀释至刻度，制得
各单一对照品溶液，分别量取不同体积单一对照品
第 2 期．徐 娜，等．一测多评法测定芹菜籽中芹菜甲素、芹菜乙素和新蛇床内酯 · 197·
溶液，稀释制成系列浓度混合对照品溶液，保存于
4℃ 冰箱，备用。
2． 2． 3 供试品溶液制备 取供试品约 20 mg，置于
25 mL的容量瓶中，甲醇稀释至刻度。
2． 2． 4 线性范围 将 2． 2． 2 项下制得的对照品混合
溶液，每个浓度进样 3 次，每次 10 μL，以进样量 C
(μg)为横坐标，平均峰面积 A 为纵坐标作标准曲线，
芹菜甲素:线性方程 A =47 152C －91 583，r =0． 999 7，
线性范围 0． 228 ～ 3． 86 μg;芹菜乙素:线性方程 A =
18 874C －75 344，r = 0． 999 5，线 性 范 围 为
0． 204 ～3． 32 μg;新 蛇 床 内 酯:线 性 方 程 A =
18 706 507C － 2 111，r = 1． 000，线性范围 0． 224 ～
3． 60 μg。结果表明各化合物在相应的范围内线性关系
良好。
2． 2． 5 检测限和定量限 定量限按信噪比 S /N =
10． 6 计为 9． 0 ng，检测限按 S /N =3． 4计为 2． 5 ng。
2． 2． 6 校正因子计算 根据公式(1)和(2) ，以芹
菜甲素(甲)为内参物，结合 2． 2． 2 项所制系列浓度
对照品溶液所得峰面积数据，计算芹菜乙素(乙)、新
蛇床内酯(蛇)的校正因子如下:f甲 /乙 = f甲 / f乙 =
0． 226，f甲 /蛇 = f甲 / f蛇 = 0． 702。
2． 2． 7 精密度实验 精密吸取同一供试品溶液 10
μL于同一天内连续进样 5 次，记录芹菜甲素、芹菜
乙素、新蛇床内酯的峰面积，得出日内精密度的 RSD
分别为 0． 9%、2． 5%、1． 2%;吸取同一供试品溶液
10 μL连续进样 3 d，每天 3 次，记录以上 3 个成分的
峰面积，得出日间精密度的 RSD 分别为 1． 8%、
3． 5%、2． 6%。结果表明仪器较为稳定。
2． 2． 8 重复性实验 精密称取同一批号的原料药
20 mg，共 6 份，按 2． 2． 3 项下方法制备样品溶液，测
定 6 份样品中芹菜甲素、芹菜乙素、新蛇床内酯的含
量，RSD分别为 1． 9%、3． 1%、2． 5% (n = 6) ，结果
表明该方法的重复性良好。
2． 2． 9 稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液 10
μL，分别于配制后的 0、2、4、8、12、24、48 h 测定峰面
积值，芹菜甲素、芹菜乙素和新蛇床内酯在 0、1、2 d
内峰面积的 RSD分别为 2． 8%、3． 4%、2． 6%。结果
表明处理后的样品在 48 h内稳定。
2． 2． 10 加样回收率 取已知含量的原料药 6 份，每
份 20 mg，精密称定，分别按各成分在原料药中的含量
精密加入对照品芹菜甲素 2． 5 mg、芹菜乙素6． 0 mg、
新蛇床内酯 4． 0 mg，按 2． 2． 3 项下方法制备样品溶
液，测定，计算加样回收率。芹菜甲素、芹菜乙素、新
蛇床内酯的平均加样回收率分别为 101． 2%、98． 9%、
99． 7%，RSD 分别为 2． 5%、3． 7%、2． 1%。
2． 3 校正因子的系统适应性考察
2． 3． 1 色谱柱及高效液相色谱仪考察 实验考察
了 Shimadzu LC － 10AT 和 Agilent 1100 两种高效液
相色谱系统，考察了 Dikma 一代柱 Diamonsil C18
(4． 6 mm ×250 mm，5 μm)、Dikma 二代柱 Diamonsil
C18(2) (4． 6 mm × 250 mm，5 μm)、Waters symmetry
C18(4． 6 mm ×250 mm，5 μm)3 种色谱柱，芹菜乙素、
新蛇床内酯的校正因子依次为0． 215 ～ 0． 242、0． 687
～ 0． 729，其中，不同仪器所得相对校正因子的 RSD
为 4． 4% ～ 6． 7%，同一台仪器不同色谱柱所得相对
校正因子的 RSD为 2． 3% ～3． 6%。详见表 1。
表 1 不同仪器和色谱柱测得的相对校正因子(f)
Tab 1 Relative correction factor (f)measured by
different instruments and chromatographic columns
Instrument Chromatographiccolumn f b /Sen f b /San
Shimadzu Diamonsil C18 0． 221 0． 687
LC － 10AT Diamonsil C18(2) 0． 227 0． 695
Waters symmetry C18 0． 215 0． 729
Agilent 1100 Diamonsil C18 0． 232 0． 689
Diamonsil C18(2) 0． 242 0． 725
RSD (%) 4． 41 2． 66
b:3 － n － butylphthalide;Sen:Sedenenolide;San:Sedanol-
ide;RSD:Relative standard deviation
2． 3． 2 待测组分色谱峰的定位 中药成分复杂，色
谱图中除待测组分的色谱峰外，还存在很多其他色
谱峰，因此对待测组分色谱峰正确定位是准确测定
的前提。本实验考察了待测组分与内参物保留时间
差值的变化情况，见表 2。3 种成分在不同色谱柱和
色谱仪上保留时间有所差别，但芹菜甲素相对于芹
菜乙素、新蛇床内酯的保留时间差值变化不大。因
此，选择采用待测组分与内参物保留时间的差值定
位。实验所得芹菜甲素与芹菜乙素、新蛇床内酯的
时间差均值分别为 1． 245、6． 367 min;RSD分别为 2．
30%、1． 08%。
2． 3． 3 QAMS与外标法结果比较 按 2． 2． 3 项下方
法制备 6 批供试品溶液，分别进样测定。采用外标
法和 QAMS计算芹菜乙素和新蛇床内酯的含量(表
3)。结果表明所建立 QAMS 具有较好的可信度，可
以用于芹菜籽质量标准的研究。
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表 2 不同仪器和色谱柱测得的保留时间(RT)差
Tab 2 Retention time (RT)measured by different
instruments and chromatographic columns
Instrument Chromatographiccolumn RTb － RTsen RTsan － RTb
Shimadzu Diamonsil C18 1． 261 6． 396
LC － 10AT Diamonsil C18(2) 1． 279 6． 452
Waters symmetry C18 1． 252 6． 387
Agilent 1100 Diamonsil C18 1． 207 6． 279
Diamonsil C18(2) 1． 225 6． 318
RSD (%) 2． 30 1． 08
b:3 － n － butylphthalide;sen:Sedanenolide;san:Sedanolide;
RSD:Relative standard deviation
表 3 外标法和一测多评法测定
芹菜乙素和新蛇床内酯含量结果
Tab 3 Results of ESM and QAMS in determining
sedenenolide and sedanolide contents
%
Batch
No．
Sedenenolide
ESM QAMS
Sedanolide
ESM QAMS
1 29． 61 29． 35 19． 15 19． 18
2 31． 01 30． 73 19． 41 19． 44
3 30． 61 30． 36 18． 36 18． 39
4 28． 71 28． 39 21． 85 21． 88
5 29． 87 29． 65 20． 45 20． 48
6 30． 06 29． 87 20． 53 20． 56
ESM:External standard method;QAMS:Quantitative analysis of multi
－ components by single marker
3 讨 论
流动相体系考察:根据预实验，本实验考察了不
同浓度的乙腈 －0． 3%磷酸水、甲醇 －水、甲醇 －0． 3%
磷酸水为流动相对色谱分离的影响，发现磷酸水可以
防止芹菜甲素、芹菜乙素、新蛇床内酯的色谱峰拖尾，
而用甲醇 －水作为流动相不能将 3 个苯酞在合理的
时间内有效分离，考虑到磷酸对色谱柱的影响，经过
条件摸索，将流动相体系定为乙腈 － 0． 3%磷酸水(50
∶50)。
检测波长的选择:经过二极管阵列检测器分析，
芹菜甲素最大吸收在 228 nm，芹菜乙素最大吸收在
275 nm，新蛇床内酯最大吸收在 222 nm 处，为了减
小干扰，选择 235 nm为芹菜甲素和新蛇床内酯的检
测波长，270 nm为芹菜乙素的检测波长。
多指标综合质量控制模式已成为中药质量评价
和控制的发展趋势。多指标质量控制模式需要足够
量的化学对照品，而芹菜甲素、芹菜乙素和新蛇床内
酯的单体分离难度大，且芹菜乙素单体结构很不稳
定，难分离。王智民等［10］提出“一测多评”的想法，
并已成功运用于木通中 3 种有效成分及人参与三七
药材中多种人参皂苷含量的同步测定［11］。其中，黄
连的一测多评评价标准已被 2010 年版《中华人民共
和国药典》采纳［12］。
4 利益冲突
所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。
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［本文编辑］ 尹 茶