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胶束毛细管电泳法测定天山花楸果实中苦杏仁苷的含量
张　倩1 ,马晓丽2 ,常军民1＊ ,王　岩1 ,孟　磊2(1.新疆医科大学药学院 ,新疆 乌鲁木齐 830011;2.新疆医科大学分析
测试中心 ,新疆 乌鲁木齐 830011)
摘要:目的　建立了一种简单 、快速分析天山花楸果实中苦杏仁苷含量测定的胶束毛细管电泳法(M EKC)。方法　采用熔融石
英毛细管(58.5 cm×75 μm ,有效长度为 48.5 cm),缓冲体系为70 mmol· L-1的硼砂-200 mmol· L-1的十二烷基硫酸钠(pH 9.50);
分离电压 10 kV(+)※(-);电泳时间40 min;电泳温度 25 ℃;压力进样 0.5 psi×10 s;柱上检测 UV 215 nm(二极管阵列检测器)。
结果　苦杏仁苷在 20 min 内得到较好分离 , 在 25 ～ 225μg ·mL-1范围内与峰面积线性关系良好 ,线性方程为:Y =776.66 X -
6 637.9(r = 0.999 7), 样品平均回收率为 100.8%, RSD值为 2.8%。结论　该方法简单 、快速 ,结果准确可靠 , 可用于天山花
楸中氰苷类成分测定及质量控制。
关键词:天山花楸;苦杏仁苷;胶束毛细管电泳法
doi:10.3969/ j.issn.1004-2407.2011.05.003
中图分类号:R927.2　　　文献标志码:A　　　文章编号:1004-2407(2011)05-0319-03
Determination of the content of amygdalin in Sorbus tianschanica Rupr.fruit by
micellar electrokinetic chromatography
ZHANG Qian1 ,M A Xiaoli2 , CHANG Junmin1＊ ,WANG Yan1 , MENG Lei2(1.College o f Pharmacy , Xinjiang Medical Univ ersity ,
Xinjiang U rumuqi 830011 , China;2.Analy tical &Testing Center , Xinjiang Medical Univ ersity , Xinjiang U rumuqi 830011 , China)
Abstract:Objective To e stablish a sim ple and rapid micellar e lectrokinetic chr omatog raphy me thod(MEKC)w hich can determine
the content of amygdalin in Sorbus tianschanica Rupr.fr uit.Methods Bare fused-silica capilla ry (58.5 cm × 75 μm , effective
leng th of 48.5 cm)was used;the buffe r wa s composed of 70 mmol· L-1 sodium bo rate-200 mmo l· L-1 SDS (pH 9.50);r unning
voltage a t 10 kV;polarity from anode(inle t)to cathode(outlet);sepa ration time 40 min;temperature 25 ℃;sampling 0.5 psi×10
s;on line detection at 215 nm (PDA).Results The linear r ange o f amygdalin w as f rom 25-225μg·m L-1 , with linear reg ression e-
qua tion wasY =776.66 X -6 637.9 (r =0.999 7), and the average r ecovery w as 100.8%, w ith RSD 2.8%.Conclusion The
me thod is sim ple , rapid , accurate and reliable , and can be applied fo r the quality contro l o f cy anogenic g ly co side s.
Key words:Sorbus tianschanica Rupr.;amygdalin;micella r electrokine tic chr omatog raphy
基金项目:新疆维吾尔自治区高校科研计划项目(编号:
XJEDU2005I19)
作者简介:张倩 ,女 ,硕士研究生
＊通信作者:常军民 ,男 , 博士 ,教授 , 硕士生导师
　　天山花楸为蔷薇科 Rosacea花楸属 Sorbus植物
天山花楸Sorbus t ianschanica Rupr.的干燥果实 ,主
产于新疆的天山山脉 ,是维吾尔族和哈萨克族民间常
用药材。据《中华本草》记载[ 1-2] ,天山花楸的枝叶与
果实常用于治疗肺结核 、哮喘 、咳嗽 、胃痛等。苦杏仁
苷是天山花楸主要的有效成分之一 ,具有止咳平喘的
功效 。目前 ,文献报道的苦杏仁苷的分析方法主要有
HPLC 法[ 3-7] 。随着毛细管电泳应用领域的不断拓
宽 ,作为一种高效 、灵敏和低耗的分析方法 ,其已被广
泛应用于传统中草药及中药制剂的有效成分检
测[ 8-10] 。为了进一步开发和利用天山花楸 ,笔者首次
采用胶束毛细管电泳法对天山花楸果实中的苦杏仁
苷含量进行测定 ,旨在建立一种简单 、快速分离测定
天山花楸果实中苦杏仁苷含量的方法 ,以期为天山花
楸资源的开发和利用提供基础依据 ,并为控制药材的
内在质量提供一种新的分析方法。
1　仪器与试药
1.1　仪器　Beckman P/ACETM MDQ型高效毛细
管电泳仪(Beckman 公司 ,美国),二极管阵列检测
器 ,石英毛细管柱(58.5 cm ×75 μm ,有效长度 48.5
cm , 河北永年光纤厂);FE20-pH 计(METT LER
TOLEDO公司);XS205 电子天平(MET TLER TO-
LEDO公司);Milli-Q 纯水仪(Millipore 公司);UV-
2550紫外分光光度计(Shimadzu 公司 ,日本);DZF-
6090真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。
1.2　试药　苦杏仁苷对照品(中国药品生物制品检
定所 ,批号 110820-200403);十二烷基硫酸钠(SDS ,
Sigma公司);硼砂;其他试剂均为分析纯;实验中配
制缓冲液和样品液所用水为高纯水(Milli-Q);天山
花楸 2010年 8月采自新疆呼图壁县林场 ,并经新疆
医科大学药学院生药教研室帕丽达 ·阿不力孜教授
鉴定。
2　实验方法
2.1　对照品储备液的制备　精确称取苦杏仁苷对照
品 10.0 mg ,置于 10 mL棕色量瓶内 ,以去离子水溶解
并稀释至刻度 ,摇匀 ,制成质量浓度为 1 mg ·mL-1的
对照品储备液;放置-4 ℃冰箱中保存 ,在使用前按
要求稀释。
2.2　样品的前处理　精确称取天山花楸果实 5.000 4
g ,研磨均匀 ,置于 250 mL 圆底烧瓶中 ,加入 100 mL
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乙醚 ,在 40 ℃加热回流脱脂(60 min×3),过滤并弃
去乙醚层 ,滤渣挥干;加甲醇 100 mL 在 40 ℃加热回
流提取(60 min×3),合并提取液 ,在 40 ℃的真空干
燥箱中将甲醇挥尽;用去离子水溶解并定容至 100
mL 量瓶中 ,摇匀 ,制成供试品溶液 ,放置-4 ℃冰箱
中保存。
2.3　紫外扫描　为确定毛细管电泳中的最佳检测波
长 ,对苦杏仁苷的标样(20 μg · mL-1)进行紫外扫
描 ,在 200 ～ 400 nm 的波长范围内 ,苦杏仁苷的最大
吸收在 215 nm处 ,故选择检测波长为 215 nm 。
2.4　电泳条件　石英毛细管柱(58.5 cm×75 μm ,
有效长度 48.5 cm);运行缓冲液:70 mmol·L-1的硼
砂-200 mmol·L-1的十二烷基硫酸钠(pH9.50);分
离电压 10 kV(+)※(-);电泳时间 40 min;电泳温
度 25 ℃;压力进样 0.5 psi×10 s;柱上检测 UV 215
nm(二极管阵列检测器)。清洗程序:第 1次进样前
分别以甲醇 、双蒸水 、0.1 mol·L -1盐酸 、双蒸水 、0.1
mol·L-1氢氧化钠 、双蒸水 、缓冲溶液冲洗毛细管 20
psi×3 min;每次进样间用 1 mo l·L -1氢氧化钠冲洗
20 psi×3 min ,双蒸水冲洗 20 psi×5 min ,最后用缓
冲溶液冲洗 20 psi×3 min。样品及缓冲液均在 4 ℃
储存 ,在使用前用 0.45μm 微孔滤膜滤过 ,且临用前
超声脱气处理。
3　结果与分析
3.1　缓冲液的浓度及分离电压的影响　考察了 10 ,
20 ,30 ,50 ,70和 100 mmol· L-1不同浓度的硼砂缓冲
溶液对分离的影响。结果表明 ,10 mmol·L-1时没有
电流 ,图谱出现断层 ,20 mmol·L-1时分离不完全 ,随
着浓度的增大 ,分离时间延长 ,峰形趋于正态 ,但当缓
冲液浓度大于 100 mmol ·L-1时峰形变差 ,有拖尾现
象 ,且分离效果也不佳。选用 70 mmol·L-1的硼砂缓
冲溶液 ,在选定的缓冲液浓度下 ,又进一步考察了 8 ,
10和 20 kV 电泳电压对分离的影响 ,我们综合考虑
组分的分离度 、灵敏度 、噪音 、焦耳热及分析时间等因
素 ,选择 10 kV 为分离电压 。
3.2　表面活性剂的浓度对分离的影响　考察了 50 ,
100 ,200 和 300 mmol·L-1不同浓度的 SDS 对分离
效果的影响 ,随着浓度的增加 ,分离效果越好 ,峰带越
窄 ,分离越完全 ,但是在 300 mmol·L-1时 ,基线分离
度增大 ,分析时间明显延长 ,且配制不容易 ,易结晶阻
塞毛细管通路 ,影响实验的重复性。故选用了 200
mmo l·L-1的 SDS 作为阴离子表面活性剂 。
3.3　pH 的确定　运行缓冲液的 pH 既可改变溶质
的结构 ,使溶质电离或呈中性状态 ,又可改变电渗流的
大小 ,因此 , pH 对 CE 分离有较大的影响。在 2个缓
冲液的浓度均确定的基础上 ,改变 pH 进一步考察 pH
对分离选择性的影响 。结果表明 , pH >10.5时 ,苦杏
仁苷的峰会裂开成 2个 ,可能是苷元实体与非糖衍生
的手性中心的杏仁腈差向异构化的原因 , pH 为 9.0 ,
9.5和 10.0时 ,保留时间比较理想 ,其中 pH9.5时 ,分
离效果最佳 ,峰形最好 ,故选定缓冲液的 pH 为 9.5。
3.4　线性关系考察　分别精密吸取 0.250 , 0.500 ,
1.000 ,1.500 ,2.000和 2.250 mL 苦杏仁苷对照品储
备液置于 6个 10 mL 棕色量瓶中 ,用去离子水稀释
至刻度 ,摇匀作为对照品溶液 ,经 0.45 μm 微孔滤膜
滤过 ,进样 ,记录色谱图 ,以峰面积为纵坐标 ,以相应
进样质量浓度为横坐标进行线性回归。结果表明苦
杏仁苷质量浓度在25 ～ 225μg ·mL-1线性范围内与
峰面积积分值呈良好的线性关系 ,苦杏仁苷对照品电
泳图见图 1。
图 1　苦杏仁苷对照品电泳图
1.苦杏仁苷
Fig.1 A CZE separation of amygdalin reference substance
1.amygdalin
3.5　精密度实验　考察所建立方法在相同操作条件
下短时间内的精密度:取苦杏仁苷对照品溶液 ,按 2.4
项下的电泳条件 ,连续 6 次重复进样分析 ,每次进样
10 s ,测得苦杏仁苷对照品峰面积的 RSD 为 1.4%。
结果表明 ,此分析方法精密度好 。
3.6　稳定性实验　取供试品溶液每隔 2 h连续 12 h
考察样品的日内稳定性 ,每次进样 10 s。记录并计算
峰面积的 RSD 为 1.8%。结果表明 ,供试品溶液在
12 h 内稳定性好。
3.7　重复性实验　取同一批天山花楸样品6份 ,按 2.2
项下操作制备样品溶液 ,经测定样品中苦杏仁苷峰面积
的 RSD为 2.2%。结果表明 ,该方法重复性较好。
3.8　加样回收率实验　取已知含量的样品 ,定量加
入混合对照品 ,按 2.2项下进行处理 ,重复测定 6次 ,
测得吸收峰面积 ,计算回收率 ,结果见表 1。
3.9　样品测定　取天山花楸果实样品 ,按照供试品
制备方法制得天山花楸供试品液 3份 ,使用前经超声
脱气处理 ,摇匀 ,过 0.45 μm 微孔滤膜滤过 ,进样分
析 。采用外标法测定样品 ,计算含量 ,结果见表 2 ,电
泳图见图 2。
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表 1　苦杏仁苷回收率测定结果(n=6)
Tab.1 Result of the recovery of amygdalin(n=6)
项目　　 实际质量浓度/μg·mL -1 加入质量浓度/μg·mL -1 测得质量浓度/μg·mL-1 回收率/ % 平均回收率/ % RSD/ %
低质量浓度 23.498 15 38.34 98.97
23.498 15 38.42 99.45
23.498 15 37.94 96.26
中质量浓度 23.498 30 53.61 100.35
23.498 30 54.08 101.95 100.8 2.8
23.498 30 54.27 102.56
高质量浓度 23.498 45 70.99 105.55
23.498 45 69.50 102.23
23.498 45 68.45 99.89
表 2　样品中苦杏仁苷的含量测定结果
Tab.2 Result of determination contents of amygdatin in samples
编号 样品量/ g 苦杏仁苷的质量浓度/μg·mL-1 苦杏仁苷的含量/mg· g -1 平均含量/mg· g -1
1 5.003 86.25 1.724
2 5.006 88.52 1.768 1.75
3 5.002 87.82 1.756
图 2　天山花楸果实样品电泳图
A.供试品;B.供试品加苦杏仁苷对照品;1.苦杏仁苷
Fig.2 A CZE of sample of Sorbus tianschanica Rupr.fruit
A.sample;B.sample add amygda lin of reference substances;
1.amygdalin
4　讨论
①样品前处理的选择　选用了加热回流的提取
方法和超声的提取方法对样品进行处理 ,发现加热回
流提取的样品没有太多的杂峰干扰 ,而超声提取的样
品杂峰相对多 ,而且分离效果不如加热回流提取的
好 ,故本实验选用了加热回流的前处理方法。
②胶束毛细管电泳　考察了硼砂与 SDS 按10∶
1 ,5∶1 ,4∶1 , 2∶1 , 4∶3 和 1∶1 不同比例的缓冲
盐 ,SDS 的浓度太低 ,胶束稳定性差 ,负载小 ,分辨能
力下降 ,重复性不好 。随着 SDS 量增大 ,出峰时间相
对延后 ,峰形相对对称 ,但是缓冲液与 SDS 等比加入
时 ,浓度太高 ,电流变大 ,焦耳热增加 ,柱效降低 ,基线
噪音增大 ,所以 ,综合考虑 ,最佳的配比是 4∶1 。
　　本实验通过胶束毛细管电泳技术对天山花楸果
实中苦杏仁苷含量进行测定 ,对缓冲液的 pH 、硼砂
浓度 、电压 、SDS浓度等条件做了优化 ,结果表明:70
mmol· L-1硼砂缓冲液-200 mmol · L-1的 SDS ,
pH9.50 ,电压10 kV ,柱温 25 ℃的CZE 分离体系 ,能
使样品中苦杏仁苷得到较为理想的分离 。
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(收稿日期:2011-05-04)
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