免费文献传递   相关文献

欧李种仁中苦杏仁苷的提取及其抗氧化活性



全 文 :湖 北 农 业 科 学 2013 年
第 52卷第 19 期
2013年 10月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol. 52 No.19
Oct.,2013
收稿日期:2013-02-10
基金项目:成都大学校基金资助项目(2011XJZ18)
作者简介:邬晓勇(1975-),男,山西河曲人,副教授,主要从事植物天然产物及分子生物学研究,(电话)028-84616301(电子信箱)
cduwxysyx@126.com。
欧李(Prunus humilis Bunge)为蔷薇科樱桃属
落叶小灌木, 是我国特有的果实和药食兼用树种。
其茎叶、果实、根皮具有很高的经济和药用价值。 欧
李种仁可以入药,具有利尿、助消化等功效,能治疗
消化不良、水肿、肠胃停滞等疾病[1-3]。欧李种仁中含
有大量的苦杏仁苷, 主要用于治疗慢性气管炎、急
慢性呼吸道感染和脓疱病 [4],与其他药物合用还可
治疗皮肤癌 [5];苦杏仁苷还具有抗凝血和抗氧化性
的作用[6]。
苦杏仁苷具有明确的生理、药理活性。 关于苦
杏仁苷分析检测的方法也比较完善,但国内对欧李
苦杏仁苷分离提取工艺的深入研究还较少,所以本
试验采用 HPLC法测定欧李种仁浓缩液中苦杏仁苷
的含量,利用 DPPH法测定苦杏仁苷的抗氧化性,以
期为欧李苦杏仁苷提取工艺的改进提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
试验于 2012 年 6 月在成都大学药食同源植物
资源开发重点实验室进行。 欧李采自成都大学欧李
种植基地。
将风干的欧李果实去果肉得到欧李种子,反复
淘洗将果肉和种子分开,把得到的欧李种子放入烘
箱中 50 ℃干燥 24 h。 干燥后人工去壳得到欧李种
仁,将欧李种仁放入烘箱中 50 ℃干燥 48 h,备用。
1.2 仪器与试剂
DIONEX-HPCL 高效液相色谱仪;UV-1800 紫
外分光光度计。
苦杏仁苷标准品(纯度大于 99.0%,中国药品生
物制品检定所);无水乙醇、甲醇和石油醚(成都市
欧李种仁中苦杏仁苷的提取及其抗氧化活性
邬晓勇,孙雁霞,何 钢,赵 琦,苟小军
(成都大学药食同源植物资源开发重点实验室,成都 610106)
摘要:采用 HPLC 法测定欧李(Prunus humilis Bunge)种仁浓缩液中苦杏仁苷的含量,利用 DPPH 法测定
苦杏仁苷的抗氧化性。 结果表明,提取液中苦杏仁苷的浓度为 7.94 mg / mL;苦杏仁苷清除 DPPH 的能力
随着其浓度的降低而下降,当苦杏仁苷溶液浓度为 7.50 mg / mL 时清除率最高,为 90.9%。 欧李种仁浓缩
液经氯仿、乙酸乙酯和加热处理均能提高水相中苦杏仁苷的纯度。
关键词:欧李(Prunus humilis Bunge);种仁;苦杏仁苷;高效液相色谱;抗氧化性
中图分类号:S662.3 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2013)19-4764-04
Extracting and Anti-oxidative Activity of Amygdalin from Kernel of
Prunus humilis Bunge
WU Xiao-yong,SUN Yan-xia,HE Gang,ZHAO Qi,GOU Xiao-jun
(The Key Laboratory of Medical and Edible Plants Resources Exploitation,Chengdu University, Chengdu 610106,China)
Abstract: The content of amygdalin of Prunus humilis Bunge was measured by HPLC and anti-oxidative activity of amygdalin
was measured by DPPH method. The results showed that the concentration of the amygdalin in the extract liquid was 7.94
mg / mL; the activity of scavenging DPPH declined with the decreasing concentration of amygdalin. The clearance rate was
highest at 90.9% when the concentration of amygdalin was 7.50 mg / mL. The purity of amygdalin in water phase could be
enhanced when the concentrated solution of kernel was treated by chloroform, ethyl acetate and heating.
Key words: Prunus humilis Bunge; kernel; amygdalin; HPLC; anti-oxidative activity
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2013.19.067
第 19 期
科龙化工试剂厂);DPPH (成都康普泰科技有限公
司),以上试剂均为分析纯。
1.3 方法
1.3.1 标准曲线的制作 准确称取 20 mg 苦杏仁苷
标准品置于 10 mL 容量瓶中, 用甲醇定容。 采用
UV-1800 紫外分光光度计多波长扫描检测苦杏仁
苷标准品的最大吸收波长。
标准曲线的制作: 精确称取 20 mg 苦杏仁苷标
准品置于 10 mL 容量瓶中,用甲醇定容。 准确量取
0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 分别置于 EP 管中, 分别加
入 0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL 甲醇, 配制成终浓度分别
为 0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg / mL 的系列标准品溶液。
采用 HPLC法测定不同浓度标准溶液, 得到相应的
峰面积。 以系列标准溶液的浓度(C)为横坐标,色谱
峰面积(A)为纵坐标,制作苦杏仁苷标准曲线。
色谱条件:色谱柱 C18柱;流动相,甲醇-水=30∶
70;柱温 28 ℃;检测波长 220 nm;流速 1 mL / min;进
样量 10 μL。
1.3.2 欧李种仁中苦杏仁苷的提取及含量测定
取 100 g 干燥种仁粉碎。 将粉碎后的欧李种仁粉末
置于 1 000 mL 的烧瓶中,加入 230 mL 无水乙醇,恒
温水浴(80~90 ℃)回流 1 h,抽滤收集滤液,3 次重
复。 向合并滤液中加入少量蒸馏水,利用石油醚萃
取去除滤液中的油脂,待分层后取下层液体。 利用
旋转蒸发器将下层液体加热浓缩,得到苦杏仁苷浓
缩液,利用蒸馏水定容至 100 mL。分别取 1 mL上述
溶液于 2 支 EP 管中,离心处理,取 50 μL 上清液稀
释 30 倍,0.22 μm 微孔滤膜过滤, 利用 HPLC 法检
测苦杏仁苷的含量。
1.3.3 苦杏仁苷抗氧化性测定 0.6 mmol / L DPPH
溶液配制:精确称取 0.039 g DPPH,用 95%乙醇定
容至 50 mL,稀释 10倍后得到 0.6 mmol / L DPPH 溶
液备用。
反应体系:1 mL 待测液加入 2 mL 0.6 mmol / L
DPPH 和 2 mL 95%乙醇,以不加样品为对照,混匀
后于暗处反应 30 min; 另取 5 mL 95%乙醇作调零
对照; 在 517 nm 处测定吸光值 (A 值)。 配制 7.5
mg / mL 的苦杏仁苷提取液,进行二倍稀释得到 8 个
浓度梯度,分别为 7.5、3.75、1.875、0.937 5、0.468 8、
0.234 4、0.117 2、0.058 6、0.029 3 mg / mL。 将稀释后
溶液作为抗氧化性测定的待测液, 测定其吸光值
(A)[7]。
清除率=(1-A 样品 /A 空白)×100%
1.3.4 氯仿和乙酸乙酯萃取苦杏仁苷 取苦杏仁
苷浓缩液 5 mL 分别置于 2 个分液漏斗中, 分别加
入等体积的氯仿和乙酸乙酯,充分振荡混匀,静置,
待分层后,分别取有机相和水相利用“1.3.2”的方法
测定苦杏仁苷的浓度。
1.3.5 加热对苦杏仁苷纯度的影响 将苦杏仁苷
浓缩液 5 mL 置于烧杯中, 沸水浴中加热处理 10
min,之后取样经离心后按照“1.3.2”的方法测定苦
杏仁苷的浓度。
2 结果与分析
2.1 苦杏仁苷最大吸收波长的确定
如图 1所示,采用 UV-1800 紫外分光光度计于
200~400 nm 波长下进行多波长扫描,得到苦杏仁苷
标准品的最大吸收波长是 220 nm,故在后续色谱检
测苦杏仁苷含量时选择 220 nm的检测波长。
2.2 苦杏仁苷标准曲线
根据标准溶液测得的不同浓度标准品溶液色
谱图(图 2)进行分析,得到各个浓度标准溶液的数
据,如表 1所示。 根据表 1中数据制作标准曲线,如
图 3 所示。 以苦杏仁苷浓度(C)为横坐标,峰面积
(A)为纵坐标绘制得到苦杏仁苷标准曲线。 该回归
曲线线性良好,相关系数 R2=0.997 1,可以用于计算
苦杏仁苷的浓度。
2.3 欧李种仁中苦杏仁苷的含量
采用 HPLC法进行检测, 得到欧李种仁中苦杏
仁苷的色谱图(图 4),其峰面积为 731.757 mAU·min。
根据标准曲线计算出溶液中苦杏仁苷浓度为 7.94
1~5 号色谱峰分别为 0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg / mL 的苦杏仁苷标
准品
图 2 苦杏仁苷标准品的色谱图
图 1 苦杏仁苷的最大吸收波长
0.750
0.500
0.250
0



200.0 250.0 300.0 350.0
波长//nm
400
350
300
250
200
150
100
50
0



//m
AU
0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 15.0
保留时间//min
5
4
3
2
1
邬晓勇等:欧李种仁中苦杏仁苷的提取及其抗氧化活性 4765
湖 北 农 业 科 学 2013 年
图 4 欧李种仁提取液中苦杏仁苷的色谱图
表 2 苦杏仁苷的抗氧化活性
编号
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
苦杏仁苷浓度//mg/mL
0
7.50
3.75
1.875
0.937 5
0.468 8
0.234 4
0.117 2
0.058 6
0.029 3
A517 nm值
0.795
0.072
0.113
0.377
0.651
0.656
0.752
0.815
0.821
0.837
DPPH 清除率//%
90.9
85.8
52.6
18.1
17.5
5.4
0
0
0
mg / mL,即每 100 g 欧李种仁中苦杏仁苷含量为 794
mg。
2.4 苦杏仁苷抗氧化性的测定
研究表明, 苦杏仁苷具有一定的抗氧化性,能
够还原 DPPH[8]。 由表 2 可知,苦杏仁苷清除 DPPH
的能力随着苦杏仁苷溶液浓度的降低而下降。 苦杏
仁苷溶液浓度为 7.50 mg / mL 时,对 DPPH 的清除率
最高, 为 90.9%; 当苦杏仁苷溶液浓度为 0.234 4
mg / mL时,清除率下降为 5.4%。
2.5 氯仿和乙酸乙酯萃取苦杏仁苷
分别采用氯仿和乙酸乙酯萃取苦杏仁苷,结果
表明,氯仿和乙酸乙酯均不能将混合液中的苦杏仁
苷完全萃取出来;经检测,苦杏仁苷在氯仿相中的
含量仅为 0.17 mg / mL, 在乙酸乙酯相中仅为 0.21
mg / mL, 低于萃取之后保留在水相中的苦杏仁苷的
含量,表明氯仿和乙酸乙酯不能作为苦杏仁苷的萃
取剂使用。 但是苦杏仁苷混合液经过两种有机溶剂
萃取后,保留在水相中的苦杏仁苷的含量较萃取之
前有了较为明显的提高。 这可能是混合液中的部分
杂质被氯仿和乙酸乙酯分别萃取出去,从而提高了
水相中苦杏仁苷的相对含量。
2.6 加热对苦杏仁苷纯度的影响
利用沸水浴加热可以使醇溶性蛋白发生变性,
从而提高苦杏仁苷的纯度。 水相提取液经沸水浴加
热后, 经 HPLC 法测定苦杏仁苷含量色谱图如图 5
所示。 溶液中苦杏仁苷浓度为 12.1 mg / mL,相比较
加热前有了大幅度提高。 说明通过加热处理可以除
去苦杏仁苷溶液中的部分杂质,从而提高提取液中
苦杏仁苷的纯度。
DPPH 法检测加热处理后苦杏仁苷的抗氧化活
性结果表明, 苦杏仁苷的抗氧化性大幅度地降低
(表 3); 与检测不加热处理苦杏仁苷的抗氧化性比
较发现,在浓度为 7.5 mg / mL时,加热后其自由基清
除率仅为 69.8%; 而浓度为 1.875 mg / mL 时的清除
率为 0。说明经过加热处理后,苦杏仁苷提取液的抗
氧化活性有了明显的下降。
表 1 苦杏仁苷 HPLC 标准曲线数据
编号
1
2
3
4
5
样品浓度//mg/mL
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
响应值//mAU
75.070
126.437
192.563
263.143
308.794
峰面积//mAU·min
42.300
72.211
112.722
154.238
182.130
保留时间//min
10.81
10.85
10.86
10.85
10.86
回归方程
y=91.927 x+2.006 9
R2
0.997 1
图 3 苦杏仁苷标准曲线
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0



//m
AU
·
m
in
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
苦杏仁苷标准浓度//mg/mL
y=91.927 x+2.006 9
R2=0.997 1
1 400
1 200
1 000
800
600
400
200
-10



//m
AU
0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0 17.8
保留时间//min
图 5 加热后苦杏仁苷提取液的色谱图
1 800
1 500
1 250
1 000
750
500
250
-10



//m
AU
0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0 19.3
保留时间//min
4766
第 19 期
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
(上接第 4763页)
(责任编辑 赵 娟)
抑制剂的研究[J].食品科学,2007,28(5):216-219.
[15] 何思莲,刘慧霞,周少基,等.甘蔗多酚氧化酶酶学特性及应用
研究[J].广西大学学报(自然科学版),2009,34(6):827-831.
[16] 杨昌鹏,胡艳妮,陈智理,等.杨桃多酚氧化酶的部分纯化及其
特性研究[J].食品与发酵工业,2010,36(1):34-38.
[17] 徐 芹,乔勇进,方 强,等.砀山酥梨多酚氧化酶酶学特性及
抑制效应的研究[J].食品科学,2008,29(4):74-77.
[18] 赵 立 .香蕉皮中多酚氧化酶性质的研究[J].湖北农业科学,
2009,48(12):3117-3119.
[19] 李粉玲,蔡汉权,陈 艳,等.火龙果果肉的酶促褐变及其抑制
措施[J].湖北农业科学,2007,46(6):999-1002.
[20] 韩 涛,李丽萍.果蔬多酚氧化酶的抑制及褐变的防治因素[J].
北京农学院学报,1999,14(4):88-93.
[21] 李军兰,李怡华,赵秋玲,等.鸡腿蘑多酚氧化酶特性研究[J].食
品科学,2007,28(1):187-190.
(责任编辑 赵 娟)
表 3 加热后苦杏仁苷的抗氧化活性
编号
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
苦杏仁苷浓度//mg/mL
0
7.5
3.75
1.875
0.937 5
0.468 8
0.234 4
0.117 2
0.058 6
0.029 3
A517 nm值
0.752
0.227
0.462
0.805
0.792
1.008
1.121
1.253
1.286
1.307
DPPH 清除率//%
69.8
38.6
0
0
0
0
0
0
0
3 小结与讨论
已有研究表明,苦杏仁苷具有一定的抗氧化作
用[6]。本试验研究结果表明,苦杏仁苷清除 DPPH的
能力随着苦杏仁苷溶液浓度的降低而下降。 苦杏仁
苷溶液浓度为 7.50 mg / mL 时对 DPPH 的清除率最
高,为 90.9%。
本试验中提取苦杏仁苷的方法是采用无水乙
醇在 80~90 ℃下回流, 因为试验所用材料为植物种
子,所以在提取苦杏仁苷的过程中,一些醇溶性蛋
白和黄酮类化合物也会被提取出来 [9-11]。 采用氯仿
和乙酸乙酯两种溶剂对苦杏仁苷的萃取结果表明,
氯仿和乙酸乙酯不能作为苦杏仁苷的萃取剂使用。
但是经过两种溶剂萃取后,苦杏仁苷溶液中的部分
杂质可以被两种溶剂除去,从而提高了水相中苦杏
仁苷的相对含量。
苦杏仁苷混合液经过加热处理后,苦杏仁苷的
相对含量大幅增加,说明加热处理可以去除苦杏仁
苷溶液中的部分杂质, 从而提高苦杏仁苷的纯度;
然而苦杏仁苷的抗氧化活性却大幅下降。 经检测,
加热后苦杏仁苷溶液浓度为 7.5 mg/mL 时, 自由基
清除率仅为 69.8%, 这可能与加热去除了部分黄酮
或其他抗氧化成分有关[12,13]。
参考文献:
[1] 马建军,张立彬.野生欧李生长期矿质营养元素含量的变化[J].
园艺学报,2004,31(2):165-168.
[2] 田金强,兰彦平,朱克瑞,等. 欧李仁综合利用关键技术研究[J].
中国油脂,2012,37(2):65-69.
[3] 林 海.欧李仁油抗氧化活性的研究[J].食品工业科技,2012,
33(15):105-107.
[4] 张 伟,林 彤,江英桥. RRLC 法同时测定橘红痰咳颗粒中苦
杏仁苷和柚皮苷[J]. 中成药,2012,34(5):865-868.
[5] ZHOU C S, QIAN L C, MA H L, et al. Enhancement of
amygdalin activated with β-D-glucosidase on HepG2 cells pro-
liferation and apoptosis[J]. Carbohydrate Polymers,2012,90(1):
516-523.
[6] WEI Y, XIE Q Q, ITO Y. Preparative separation of axifolin-
3-glucoside, hyperoside and amygdalin from plant extracts by
high speed countercurrent chromatography[J]. Journal of Liquid
Chromatography and Related Technologies,2009,32 (7):1010-
1022.
[7] 杨 虎,张生堂,高国强. 玫瑰黄酮的提取及其清除 DPPH 自由
基活性研究[J].食品科学,2012,33(24):152-155.
[8] 董 捷,尹 策,张红城,等.杏花花粉中苦杏仁苷的抗氧化性研
究[J].食品科学,2007,28(8):65-68.
[9] 潘进权,张世英,何敏婷,等.竹叶总黄酮提取工艺及抗氧化特性
的研究[J].中国食品学报,2012,12(3):39-44.
[10] 张英华,关 雪.刺五加叶中黄酮类提取物的抗氧化性及抑菌
作用研究[J].东北农业大学学报,2012,43(3):85-90.
[11] KEABAITSE L, 王 璋. 乙醇分级大豆肽的氨基酸组成与相
对分子质量分布[J].食品工业科技,2004,25(11):81-84.
[12] 张永军,黄惠华.食品胶对豆浆中活性成分异黄酮苷元热稳定
性的影响[J]. 食品工业科技,2009,30(12):311-315.
[13] 黄惠华,郭乾初,梁汉华,等.豆浆热处理过程中 3 种大豆异黄
酮苷原的热降解比较[J].食品科学,2006,27(9):132-136.
邬晓勇等:欧李种仁中苦杏仁苷的提取及其抗氧化活性 4767