全 文 ：2012 年 3 月 第 14 卷 第 3 期 中国现代中药 Modern Chinese Medicine Mar. 2012 Vol. 14 No. 3
中药科技
△［基金项目］ 北京市科技计划项目(D08080203640901)
*［通讯作者］ 罗红梅，Tel:(010)57833194，E-mail:hmluo@ implad. ac. cn
蛇床及其近缘物种的 ITS2 分子鉴定
△
殷秀梅1，2，罗焜1，刘美子1，罗红梅1*
(1. 濒危药材繁育国家工程实验室，中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，
北京 100193;2. 西南大学园艺园林学院，重庆 400716)
［摘要］ 目的:对传统中药蛇床子基原植物及其近缘物种的 ITS2 条形码序列进行分析，探讨药用植物蛇床子
的分子鉴定方法。方法:采用 PCR 技术扩增蛇床 ITS2 基因片段，进行双向测序，运用 CodonCode Aligner 拼接后，
用 MEGA5. 0 软件进行相关数据分析，构建 NJ树。应用 Schultz 等建立的 ITS2 数据库及其网站预测 ITS2 二级结构。
结果:蛇床与其近缘物种 ITS2 序列间存在明显差异，基于 ITS2 序列的 NJ 树及其 ITS2 二级结构均可以将蛇床及其
近缘物种区分开。结论:ITS2 可有效地鉴别蛇床及其近缘物种。
［关键词］ 蛇床;近缘物种;DNA条形码;ITS2;鉴定
蛇床子为我国传统中药， 《中国药典》记载其
来源为伞形科植物蛇床 Cnidium monnieri (L. )Cuss.
的干燥成熟果实，具有燥湿祛风，杀虫止痒，温肾
壮阳的功能，用于阴痒带下，湿疹瘙痒，湿痹腰痛，
肾虚阳痿，宫冷不孕等［1］。现代药理学研究表明蛇
床子的药理作用广泛，有抗心律失常、降血压、血
脂、镇静催眠、治疗骨质疏松、抗菌、止痒、抗炎、
抗肿瘤、抗氧化等作用［2-5］。药用植物蛇床的近缘物
种，主要包括同属植物兴安蛇床 Cnidium dauricum
(Jacquin) Fischer ＆ C. A. Meyer，同科植物毒芹
Cicuta virosa Linn. 、粗糙独活 Heracleum scabridum
Franch. 和旱芹 Apium graveolens Linn. 。这些近缘物
种在外形上与药用植物蛇床极为相似，但药效却完
全不同。如毒芹，全草有毒，人畜误食往往发生急
性中毒或死亡。
DNA条形码技术是利用基因组中一段公认标准
的、相对较短的 DNA 片段来进行物种鉴定的新方
法。由加拿大分类学家 Paul Hebert 首次提出，随后
引起学术界的广泛关注［6-7］。ITS2 作为 DNA 条形码
序列，因其两端具有保守区便于通用引物设计，序
列扩增容易，变异位点充足等优点，而被广泛应用
于动植物物种鉴定［8］。本研究选用 ITS2 序列对蛇床
及其近缘物种进行鉴定研究，分析蛇床子基原植物
与近缘物种之间的变异性，进化树中物种的聚类情
况，以及 ITS2 序列二级结构的差异，以期建立蛇床
及其近缘物种鉴定的新方法，确保临床用药安全。
1 材料与方法
1. 1 材料
蛇床新鲜叶片采自中国医学科学院药用植物研
究所广西分所药用植物园，标本号 PS1219MT01
(GenBank登录号 JF421487)。蛇床子基原植物及近
缘物种毒芹 Cicuta virosa、旱芹 Apium graveolens、粗
糙独活 Heracleum scabridum、兴安蛇床 Cnidium
dauricum的 ITS2 序列下载于 GenBank 数据库，蛇床
及其近缘物种信息见表 1。
表 1 蛇床及其近缘物种材料信息
中文名 拉丁名 GenBank 登录号
蛇床 Cnidium monnieri JF421487，AY863065
EU236164，AY330507
兴安蛇床 Cnidium dauricum AY330508
旱芹 Apium graveolens U30553
毒芹 Cicuta virosa U78372
粗糙独活 Heracleum scabridum EU236171
1. 2 样品 DNA提取、PCR扩增和测序
采用植物 DNA 提取试剂盒(Tiangen Biotech
Co. ，China)提取 DNA。ITS2 序列的 PCR扩增及测
定方法均参考 Chen等的研究［8］。
1. 3 数据分析
测序获得的峰图利用 CodonCode AlignerV3. 7. 1
(CodonCode Co. ，USA. )校对拼接以获得可用于后
续分析的 ITS2 序列。实验数据与 GenBank 下载的
ITS2 序列均采用基于隐马尔可夫模型的 HMMer 注释
·9·
DOI:10.13313/j.issn.1673-4890.2012.03.012
2012 年 3 月 第 14 卷 第 3 期 中国现代中药 Modern Chinese Medicine Mar. 2012 Vol. 14 No. 3
方法去除两端 5. 8S 和 26S 区段获得 ITS2 间隔区序
列［9］。通过MEGA5. 0 软件对不同样本进行序列对比
和遗传距离分析，并重构其 NJ 系统发育树。基于
Schultz等［9］的研究预测各物种 ITS2 二级结构。
2 结果与分析
2. 1 蛇床种内 ITS2 序列变异分析
蛇床的 4 条参考序列比对后长度为 221 bp，GC
含量范围为 57. 5% ～ 57. 9%，平均 GC 含量为
57. 7%。含有 1 个 POLY ‘G’结构(大于等于 5 个
单碱基重复) ，变异位点 4 处，分别为 19 位点的 A-
G变异，77，145 位点的 C-T变异和 217 位点的 A-T
变异。蛇床种内平均 K2P距离为 0. 009 8，种内最大
K2P距离为 0. 018，种内 ITS2 序列变异较小。
2. 2 蛇床种间 ITS2 序列变异分析
蛇床与其近缘物种间序列进行比对后长度为 230
bp，GC含量范围为 52. 9% ～ 57. 9%，平均 GC 含量为
56. 4%。种间 ITS2序列变异较大，ITS2 序列间存在较
多的变异位点(图 1)。蛇床种间平均 K2P 距离为
0. 229 1，种间最小 K2P 距离为 0. 133，为蛇床
(JF421487)和同属植物兴安蛇床(AY330508)，见表 2。
图 1 蛇床与近缘物种的种间 ITS2 序列比对
表 2 蛇床种间 K2P遗传距离
样本 1 2 3 4
1 Cnidium monnieri JF421487
2 Cnidium dauricum AY330508 0. 133
3 Apium graveolens U30553 0. 245 0. 252
4 Cicuta virosa U78372 0. 214 0. 240 0. 280
5 Heracleum scabridum EU236171 0. 211 0. 203 0. 259 0. 253
2. 3 聚类分析
从基于 ITS2 条形码序列构建的蛇床与其近缘物
种的 NJ树(图 2)可以看出，蛇床不同来源的样品
聚为一支，后又与同属植物兴安蛇床 Cnidium
dauricum聚为一支。其近缘物种毒芹 Cicuta virosa、
粗糙独活 Heracleum scabridum、旱芹 Apium graveolens
均独立为一支。从 NJ树图可以看出蛇床能与其近缘
物种明显区分开。
图 2 基于 ITS2 序列构建的蛇床与其近缘物种的 NJ树
2. 4 蛇床及其近缘物种 ITS2 序列二级结构比较
如图 3 所示，蛇床与其近缘物种的 ITS2 二级结
构均有螺旋(Helix)Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，蛇床与其近
缘物种在螺旋Ⅱ和螺旋Ⅳ上较为保守，在螺旋Ⅰ和
螺旋Ⅲ上具有差异。结果显示，ITS2 二级结构能有
效的区分蛇床及其近缘物种。
图 3 蛇床与其近缘物种的 ITS2 二级结构图
3 讨论
近年 ITS2 作为 DNA 条形码序列在很多植物鉴
定研究中取得良好效果。Chen［8］等对 753 属 4 800
种藻类、真菌和植物的 6 600 条 ITS2 序列进行分析，
发现其种级水平鉴定效率达到 92. 7%。ITS2 对于不
同科属如蔷薇科、豆科、芸香科、黄芪属、重楼属
等都有较好的鉴定效果［10-14］。此外，ITS2 在大青
叶、党参、京大戟等药用植物的鉴定中，均能将基
原植物及其近缘物种和混伪品区别开［15-19］。
蛇床及其各近缘物种 ITS2 序列长度范围为
221 ～ 229 bp，序列间存在较多的变异位点，无插入
/缺失变异。蛇床种内最大 K2P 距离 0. 018，种间最
·01·
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小 K2P距离 0. 133，种间最小 K2P 距离远大于蛇床
种内 K2P距离。蛇床与其同属植物兴安蛇床的变异
位点相对较少，亲缘关系较近，而与同科近缘物种
种间变异较大。通过 NJ 树聚类分析及 ITS2 二级结
构比较，均能将蛇床与其近缘物种明确区分。本研
究证实了 ITS2 序列鉴别蛇床与其近缘物种的可行
性，同时为中药材鉴别研究提供了新思路。
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Molecular Identification of Cnidium monnieri and Its Closely Related Species Using ITS2 Sequences
YIN Xiu-mei1，2，LUO Kun1，LIU Mei-zi1，LUO Hong-mei1
(1. National Engineering Laboratory for Breeding of Endangered Medicinal Materials，Institute of Medicinal Plant
Development，Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Peking Union Medical College，Beijing 100193，China;
2. College of Horticulture and Landscape Architecture，Southwest University，Chongqing 400716，China)
［Abstract］ Objective:To analyze the ITS2 sequences of Cnidium monnieri(L. )Cuss. and its closely related
species and explore the molecular identification method for C. monnieri. Methods:The PCR technique was performed
to amplify the ITS2 regions and purified PCR products were sequenced bi-directionally. Sequence assembly and
consensus sequence generation were conducted using the CodonCode Aligner. Sequence analysis were carried out by
MEGA5. 0 software. The phylogenetic tree was constructed using the neighbor-joining methods. The ITS2 secondary
structure was predicted using the ITS2 database and website founded by Schultz et al. Results:C. monnieri and its
closely related species can be authenticated by the obvious differences of their ITS2 sequences. The NJ tree based on
ITS2 sequences and secondary structure of ITS2 can also distinguish C. monnieri and its closely related
species. Conclusion:ITS2 can be used to identify C. monnieri and its closely related species.
［Key words］ Cnidium monnieri (L. )Cuss. ;Closely related species;DNA barcoding;ITS2;Identification
(收稿日期 2011-12-06)
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