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卫矛提取物不同组分总黄酮含量及抗氧化抗炎活性评价



全 文 :收稿日期:2014-04-25; 修订日期:2014-10-20
基金项目:国家自然科学基金(No. 81260537);
江西省高等学校科技落地计划项目(No. KJLD13063);
江西省自然科学基金(No. 20132BAB205093);
江西省卫生厅中医药科研计划(No. 2012Z004;No. 2013Z001)
作者简介:朱 伟(1975-),男(汉族),江西永新人,广州中医药大学第二
临床医学院研究员,博士学位,主要从事中药复方药效物质基础研究工
作.
* 通讯作者简介:刘良徛(1965-),男(汉族),江西吉安人,江西省中医院主
任中医师,博士学位,主要从事中医肺系病的临床和基础研究工作.
卫矛提取物不同组分总黄酮含量
及抗氧化抗炎活性评价
朱 伟1,胡梦梅1,熊小晶2,张文然2,刘良徛2*
(1.广州中医药大学第二临床医学院,广东 广州 510006;
2. 江西省中医院,江西 南昌 330006)
摘要:目的 比较卫矛提取物不同极性组分总黄酮含量及抗氧化抗炎活性。方法 60%乙醇提取卫矛黄酮类化合物,经萃
取制得 4 个不同极性的组分(石油醚组分、乙酸乙酯组分、正丁醇组分、水组分)。采用分光光度法测定各组分的总黄酮
含量;通过清除 DPPH自由基、ABTS自由基试验和还原力试验,评价各组分的抗氧化活性;利用脂多糖诱导小鼠腹腔巨
噬细胞 RAW264. 7 释放一氧化氮模型,评价各组分的抗炎活性。结果 卫矛提取物总黄酮的含量为
(271. 25 ± 5. 51)mg·g -1,其中乙酸乙酯组分的总黄酮含量最高,为(773. 61 ± 12. 03)mg·g -1,显著高于总提取物和
其他组分(P < 0. 01)。活性评价结果表明卫矛提取物具有良好的抗氧化和抗炎活性,其中乙酸乙酯组分的抗氧化活性最
强,乙酸乙酯组分和石油醚组分则具有良好的抗炎活性。结论 卫矛的化学成分具有良好的多样性,其作用机制具有多
组分、多靶点、多途径的特点,其具体机制有待进一步深入研究。
关键词:卫矛; 总黄酮; 抗氧化; 抗炎
DOI标识:doi:10. 3969 / j. issn. 1008-0805. 2015. 03. 011
中图分类号:R284. 1 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2015)03-0543-04
The total flavonoids contents,Anti - oxidant and anti - inflammatory activity of different
fractions of Euonymus alatus extraction
ZHU Wei1,HU Meng-mei1,XIONG Xiao-jing2,ZHANG Wen-ran2,LIU Liang-ji2*
(1. The Second Affiliated Hospital,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510006,China;
2. Jiangxi Hospital of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330006,China)
Abstract:Objective To compare the total flavonoids contents,antioxidant and anti - inflammatory activity of different fractions
of Euonymus alatus(Thunb.)Sieb extraction. Methods The flavones were segregated from Euonymus alatus(Thunb.)Sieb with
60% ethanol,and then extracted with petroleum ether,ethyl acetate,butanol,respectively. Contents of total flavonoids in various
fractions were determined by spectrophotometric. Antioxidant activity of the different fractions were evaluated by DPPH,ABTS
and reducing power measurement,and anti - inflammatory activity were evaluated by measuring NO that released from mice's ab-
dominal macrophage RAW264. 7 induced by lipopolysaccharide. Results The content of total flavonoids of ethanol extraction of
Euonymus alatus (Thunb.)Sieb. was 271. 25 ± 5. 51 mg·g -1 . The content of total flavonoids of ethyl acetate fraction was 773.
61 ± 12. 03 mg·g -1,which was significantly higher than any other fractions(P < 0. 01). The results revealed that Euonymus
alatus extraction has strong antioxidant and anti - inflammatory activity. All fractions had antioxidative and anti - inflammatory ac-
tivity. Among them,the ethyl acetate fraction has the most potent antioxidative effect and the acetate fraction and petroleum ether
fraction had the most potent anti - inflammatory effect. Conclusion The chemical components of Euonymus alatus showed good
diversity. The molecular mechanisms of Euonymus alatus was featured by multi - drugs,multi - targets and multi - pathways. It is
required further in - depth study.
Key words:Euonymus alatus (Thunb.)Sieb; Total flavonoid; Antioxidant activity; Anti - inflammatory activity
卫矛为卫矛科卫矛属植物卫矛 Euonymus alatus(Thunb.) Sieb.的带翅嫩枝或枝翅,别名鬼箭羽,其性寒,味苦,归肝经,有
破血,通经,杀虫,活血化瘀之功效[1]。卫矛含有黄酮、生物碱、
强心苷、五环三萜、甾体、有机酸等多种化学成分,具有良好的抗
氧化、抗炎、降血糖、调血脂及抗肿瘤等作用[2 ~ 4]。本研究制备了
卫矛的提取物,并按照极性大小依次分成了 4 个组分,并对它们
体外抗氧化抗炎活性进行了评价,以期阐释卫矛的药效物质基础
及其作用机制。
1 材料与仪器
1. 1 药材 卫矛购于江西中医药大学附属医院,经广东省中医院
陈燕芬主任中药师鉴定是卫矛科卫矛属植物 Euonymus alatus
(Thunb.)Sieb.的干燥枝翅,样品凭证保存于我科标本室。
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2015 VOL. 26 NO. 3 时珍国医国药 2015 年第 26 卷第 3 期
1. 2 药品与试剂 芦丁(批号:46148,阿拉丁公司),LPS(SIG-
MA,L2880 - 100mg) ,1 1 -二苯 - 2 -苦基肼(DPPH,阿拉丁公
司,D109423 - 250mg),2,2'-联氮 -二 -(3 -乙基 -苯并噻唑啉
- 6 -磺酸)(ABTS,SIGMA,A1888 - 1G) ,抗坏血酸(VC,批号:
20120418,天津市大茂化学试剂厂);DMEM高糖培养基及胎牛血
清均为 GIBCO公司生产。其它试剂皆为分析纯。
1. 3 仪器 VICTOR X5 型酶标仪(美国 PerkinElmer 公司),U -
2910 型紫外双光束分光光度计(日本 HITACI 公司),BS224S 型
万分之一电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司),XMTD -
8222 型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司),B600A
型医用离心机(安新县白洋离心机厂),Rotavapor R - 215 型旋转
蒸发仪(瑞士 BUCHI公司)。
2 方法
2. 1 原料的预处理及不同极性部位分离 称取卫矛药材 100g,
加 60%乙醇溶液 1L,加热回流提取 3 次,每次微沸 1h,过滤,合并
3 次滤液,置旋转蒸发仪减压回收至干,得干膏,重 5. 47 g。
将干膏予 100 ml 蒸馏水溶解,取 10 ml 作为卫矛总样(WM
- Z),余转移至分液漏斗中,依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、
水饱和的正丁醇萃取,每组分别萃取 3 次,回收相应溶剂分别得
到石油醚(WM -1)、乙酸乙酯(WM - 2)、正丁醇(WM - 3)和水
(WM - 4)4 个组分,各称重,并予 60%乙醇溶液溶解,4℃保存,
备用。
2. 2 总黄酮含量测定
2. 2. 1 标准曲线绘制 精密吸取 0. 2 mg·ml -1芦丁溶液 0. 25,
0. 5,1,1. 5,2 ml,分别置于 10 ml容量瓶中,加 60%乙醇溶液补足
2 ml。分别加入 5%亚硝酸钠溶液 0. 3 ml,混匀,放置 6 min,分别
加入 10%硝酸铝溶液 0. 3 ml,混匀,放置 6 min,分别加入 4%氢
氧化钠溶液 4 ml,再加 60%乙醇溶液至刻度,混匀,放置 10 min,
以相应试剂为空白,于 500 nm处检测吸光度值,以对照品质量浓
度(C,μg·ml -1)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标,绘制标准曲
线,并进行回归计算,回归方程为:A = 0. 0024C - 0. 0022 (R2 =
0. 999 9),如图 1 所示。
图 1 芦丁标准曲线
2. 2. 2 样品总黄酮含量测定 将不同极性部位的样品稀释成一定
的浓度,按“2. 2. 1”标准曲线绘制项下操作,测定其吸光度值,按以下
公式计算不同极性部位干膏中总黄酮含量相当于芦丁的含量:
总黄酮含量(mg·g - 1)=
2 × C1
C2 × V1
注:C1 为按标曲所求得总黄酮浓度(μg·ml
-1),C2 为样品
的质量浓度(mg·ml -1),V2 为所取样品的体积(ml)。
2. 3 抗氧化实验
2. 3. 1 清除 DPPH自由基活性测定 参照 Golluecke 等[5]的方法
测定,取 2 ml 不同质量浓度的样品溶液(12. 5,25,50,100 μg·
ml -1),加入 2 ml DPPH溶液(100 μg·ml -1),充分混匀后,避光反
应 30 min。于 517 nm处测定反应体系的吸光度值(Am)。同时设
定溶剂空白组(An,DPPH溶液用等体积甲醇代替)和样品空白组
(Ao,样品溶液用等体积甲醇代替)。VC 作为阳性对照组。实验
平行操作 3次,根据下列公式计算提取液对 DPPH的清除率。
2. 3. 2 清除 ABTS 自由基活性测定 参照 Roberta Re 等[6]的方
法测定,取 0. 4 ml不同质量浓度的样品溶液(12. 5,25,50,100 μg
·ml -1),加入 ABTS +溶液 4 ml,反应 6 min,于 734 nm处测定其
吸光度 Ai。同时设定溶剂空白组(Aj,ABTS +溶液用等体积甲醇
代替),样品空白组(Ah,样品溶液用等体积甲醇代替)和阳性对
照组。实验平行操作 3 次,根据下列公式计算提取液对 ABTS +
的清除率:
清除率(%)=(1 - Ai - AjAh )× 100%
2. 3. 3 还原力测定 参照 Mazor D等[7]的方法测定,取 0. 8 ml不
同质量浓度的样品溶液(12. 5,25,50,100 μg·ml -1),加入 2 ml
磷酸盐缓冲液(pH = 6. 6)和 2 ml 1%铁氢化钾,50 ℃水浴 20
min,加 2 ml 10%三氯乙酸,3000 r /min,离心 10 min,取 2 ml上清
加 2 ml去离子水,0. 4 ml 0. 1%三氯化铁,反应 5 min,于 700 nm
处测吸光度值,以 VC为阳性对照,实验平行操作 3 次,测得的吸
光度值越大表示还原能力越强。
2. 4 抗炎实验 RAW264. 7巨噬细胞用含 10%胎牛血清的 DMEM
高糖培养基,37℃,5%CO2 细胞培养箱中培养,2 ~ 3 天传代 1 次。
LPS由 PBS配制成储备液质量浓度为 1 mg·ml -1,-20℃避光保
存,使用时稀释至 1 μg·ml -1。以每孔 3 × 104个将细胞接种于 96
孔板中,培养24 h待细胞贴壁后,加入系列质量浓度为25,50,100,
200 μg·ml -1的卫矛样品与终浓度为 1 μg·ml -1的 LPS 共 200
μl,共培养细胞 24 h,收集上清,-20℃保存。
参照文献[8]方法,取 100 μl 细胞上清,加入 50 μl Griess A
试剂,37℃避光反应 10 min,加入 50 μl Griess B 试剂,37℃避光
反应 10 min,立即于 550 nm 处测定吸光度值,通过检测上清中
NO2
-含量,用以反应 NO的水平。
2. 5 统计分析 采用 SPSS13. 0 统计分析软件进行处理,定量指
标均以 珋x ± s的形式表示,各组数据间的比较采用单因素方差分
析,P < 0. 05 有统计学意义,采用改良寇氏法计算 IC50。
3 结果
3. 1 总黄酮含量测定结果 从表 1 数据可以看出,卫矛总样与其
4个组分总黄酮含量存在显著性差异:其中 WM -2 和 WM - 3 总
黄酮含量均明显高于 WM - Z(P < 0. 01),WM - 1 和 WM - 4 总
黄酮含量显著低于 WM - Z(P < 0. 05) ,且 WM - 2 中的总黄酮含
量为(773. 61 ± 12. 03)mg·g -1,显著高于其他 3 个组分(P <
0. 01),而 WM - 1 的总黄酮含量最低,为(160. 95 ± 2. 38)
mg·g -1。黄酮类化合物多具有游离的酚性羟基,一般易溶于极
性较大的有机溶剂和碱性溶液中,不溶于非极性强的有机溶剂。
卫矛经不同极性有机溶剂萃取后,黄酮类物质主要富集在乙酸乙
酯部位,而石油醚部位成分主要是一些小极性小分子物质,如挥
发油、萜类物质。
表 1 卫矛不同极性部位总黄酮含量(珋x ± s)
组分 总黄酮 /mg·g - 1
WM - Z 271. 25 ± 35. 51**
WM -1 160. 95 ± 22. 38 ##**
WM -2 773. 61 ± 62. 03##
WM -3 307. 62 ± 41. 76##**
WM -4 266. 39 ± 25. 24#**
与 WM - Z组比较,##P < 0. 01,# P < 0. 05;与 WM - 2 组比较,* P <
0. 05,**P < 0. 01;n = 6
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时珍国医国药 2015 年第 26 卷第 3 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2015 VOL. 26 NO. 3
3. 2 抗氧化实验结果
3. 2. 1 卫矛不同极性部位清除 DPPH自由基的测定结果 由图 2
可以看出,卫矛总样及其 4 个组分均具有较好的清除 DPPH自由
基的作用,且不同馏分清除 DPPH自由基能力存在较大差异。其
中 WM -2 具有最强的清除自由基的能力,在浓度 100 ~ 12. 5 μg
·ml -1范围内,其对自由基的清除率均超过 90%,且在浓度为
12. 5 μg·ml -1时,其清除 DPPH自由基的能力显著强于 VC(P <
0. 01),而 WM - Z,WM - 1,WM - 3,WM - 4 的自由基清除能力
均显著低于 VC(P < 0. 01);与 WM - Z 相比,WM - 1 和 WM - 4
的自由基清除能力显著低于 WM - Z(P < 0. 01),而 WM - 2 和
WM -3 的自由基清除能力显著强于 WM - Z(P < 0. 01),尤其是
WM -2,其清除自由基能力强于其它馏分,对 DPPH 自由基清除
的 IC50为 2. 63 μg·ml
-1。由此可见,WM - 2 是其主要的抗氧化
活性组分。
与 VC比较,##P < 0. 01,# P < 0. 05;
与 WM - Z比较,* P < 0. 05,**P < 0. 01
图 2 卫矛不同极性部位对 DPPH的清除能力
表 2 卫矛不同极性部位清除 DPPH的 IC50 μg·ml -1
组分 IC50
VC 7. 42
WM - Z 28. 89
WM -1 35. 80
WM -2 2. 63
WM -3 16. 53
WM -4 36. 60
3. 2. 2 卫矛不同极性部位清除 ABTS自由基的测定结果 由图 3
可以看出,卫矛总样及其 4 个组分表现不同大小的清除 ABTS 自
由基的能力,其中 WM - 2 具有最强的清除自由基的能力,在浓
度 100 ~ 25 μg·ml -1范围内,其对自由基的清除率均超过 90%,
且在浓度在 25 ~ 12. 5 μg·ml -1范围内,其清除 ABTS 自由基的
能力显著强于 VC(P < 0. 01),而WM - Z,WM -1,WM -3,WM -
4 的自由基清除能力均显著低于 VC(P < 0. 01);与 WM - Z 相
比,WM -1 和 WM - 4 的自由基清除能力无显著性差异(P >
0. 05) ,而 WM -2 和 WM -3 的自由基清除能力显著强于 WM -
Z(P < 0. 01),尤其是 WM -2,其清除自由基能力强于其它馏分,
对 ABTS自由基清除的 IC50为 10. 94 μg·ml
-1。由此可见,WM
-2 是其主要的抗氧化活性组分。
3. 2. 3 卫矛不同极性部位还原能力测定结果 还原力实验的原
理是样品将铁氢化钾还原成亚铁氢化钾,亚铁氰化钾与铁离子作
用,生成普鲁士蓝,在 700 nm波长处测定吸光度值,吸光度为 0.
5 时的样品浓度,即为 IC50值,IC50值越小表示样品还原能力越
强。
如图 4 所示,卫矛经萃取所分离的不同极性部位均具有较强
的还原力,且不同馏分间的还原能力存在较大差异。其中 WM -
2 的还原能力最强,在浓度 100 ~ 25 μg·ml - 1 范围内,其还原能
力显著强于 VC(P < 0. 01),而 WM - Z,WM - 1,WM - 3,WM - 4
的还原能力均显著低于 VC(P < 0. 01) ;与 WM - Z 相比,WM - 1
和 WM -4 的还原能力无显著性差异(P > 0. 05),而 WM - 2 和
WM -3 的还原能力显著强于 WM - Z(P < 0. 01),尤其是 WM -
2,其还原能力强于其它馏分,还原能力 IC50为 49. 02 μg·ml
-1。
由此可见,WM -2 是其主要的抗氧化活性组分。
与 VC比较,##P < 0. 01,# P < 0. 05;
与 WM - Z比较,* P < 0. 05,** P < 0. 01
图 3 卫矛不同极性部位对 ABTS的清除能力
表 3 卫矛不同极性部位清除 ABTS的 IC50 μg·ml -1
组分 IC50
VC 23. 74
WM - Z 74. 62
WM -1 73. 70
WM -2 10. 94
WM -3 39. 64
WM -4 79. 71
与 VC比较,## P < 0. 01,# P < 0. 05;
与 WM - Z比较,* P < 0. 05,** P < 0. 01
图 4 卫矛不同极性部位还原力结果
表 4 卫矛不同极性部位还原能力 IC50 μg·ml -1
组分 IC50
VC 65. 81
WM - Z 234. 29
WM -1 272. 33
WM -2 49. 02
WM -3 150. 91
WM -4 283. 29
3. 3 抗炎实验结果 RAW264. 7 巨噬细胞可被 LPS活化,释放大
量的 NO,而过量的 NO在细胞内转化成过硝酸根离子等自由基,
发挥细胞毒作用[9]。本实验通过研究卫矛对 LPS 诱导的
RAW264. 7 释放 NO 的抑制作用,来评价其在细胞内的抗炎活
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2015 VOL. 26 NO. 3 时珍国医国药 2015 年第 26 卷第 3 期
性。
如图 5 所示,予 1 μg·ml -1的 LPS 刺激 24 h,RAW264. 7 巨
噬细胞释放 NO的含量明显增加,与 contrl 组比较差异具有显著
性(P < 0. 01),表明 LPS诱导 RAW264. 7 巨噬细胞释放 NO 的炎
症模型成立。当加入不同浓度的卫矛样品,在药物对细胞生长无
抑制作用的前提下,对 LPS诱导的 RAW264. 7 巨噬细胞释放 NO
表现出不同的抑制作用,且其抑制能力的大小与剂量呈明显依赖
关系,其中 WM -1 和 WM - 2 具有最强的抑制 NO 作用,与 LPS
组相比,P < 0. 01,具有显著性差异,其 IC50值分别为65. 32,72. 38
μg·ml -1;WM - Z 和 WM - 3 部位对 NO 的抑制作用其次,同
LPS组相比,P < 0. 01,同样具有显著性差异;而 WM - 4 在浓度
50 ~ 200 μg·ml -1范围内对 NO释放无抑制作用(P > 0. 05)。
结果以 珋x ± s表示,n = 6;vs contrl,## P < 0. 01;
vs lps,**P < 0. 01,* P < 0. 05
图 5 卫矛不同极性部位对 LPS诱导巨噬细胞 NO释放的抑制作用
表 5 卫矛不同极性部位对 LPS诱导巨噬细胞释放 NO的抑制作用 IC50
μg·ml -1
组分 IC50
WM - Z 121. 45
WM -1 65. 32
WM -2 72. 38
WM -3 159. 78
WM -4 > 159. 78
4 讨论
本研究使用 60%乙醇加热回流提取得到卫矛的提取物,采
用萃取方法得到 4 个组分,利用 NaNO2 - Al(NO3)3 - NaOH法测
定各馏分的总黄酮含量,通过自由基清除实验、还原力测定以及
脂多糖诱导的 RAW264. 7 巨噬细胞释放炎症因子模型,评价卫
矛总提取物及 4 个组分的体外抗氧化抗炎活性。从实验结果可
以看出,随着不同组分总黄酮含量的增加,其清除 DPPH、ABTS +
自由基及还原能力均显著性增加(P < 0. 05),这说明卫矛各馏分
抗氧化能力的大小与总黄酮含量正相关,这和既往的研究结果一
致[10]。目前发现卫矛中含有木栓酮,β -甾醇,卫矛醇,槲皮素,
香橙素,d -儿茶素等多种黄酮类化合物,其中 β -甾醇和槲皮素
的抗氧化活性较强,其能力与 VC 相当[11]。本研究结果显示卫
矛乙酸乙酯组分抗氧化能力显著性强于 VC(P < 0. 01),这表明
卫矛中还存在一些尚未发现的抗氧化能力较强的黄酮类成分,这
有待更深入的分离纯化工作。
炎症是十分常见而又重要的基本病理过程,NO 在炎症中起
着关键的调节作用,其具有影响 cGMP,NF - κB依赖的信号转导
通路,调节核转录因子抑削剂 IKB 的活性,影响多种炎症因子的
表达等多重作用。经 LPS活化后的 RAW264. 7 巨噬细胞会促进
NO的大量分泌[12],本研究通过检测细胞上清 NO 的释放量,来
评价卫矛不同组分的体外抗炎活性,结果表明乙酸乙酯和石油醚
组分具有较强的抗炎作用,值得进一步研究。
本研究结果显示卫矛乙酸乙酯组分抗氧化活性最强,而乙酸
乙酯和石油醚组分的抗炎活性较强,这说明卫矛的化学成分具有
多样性的特点,治疗疾病是从多途径、多层次、多环节、多靶点发
挥整体综合调理作用,其具体协同机制有待后续研究。
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