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竹节参多糖对环磷酰胺致免疫低下
小鼠的恢复作用研究
张长城，赵海霞，姜美杰，王洪武，何毓敏，曾 晓，袁 丁*
(三峡大学医学院，湖北 宜昌 443002)
摘要 目的: 研究竹节参多糖( Panax japonicus polysaccharides) 对环磷酰胺所致免疫低下模型小鼠免疫功能的
调节作用。方法:腹腔注射环磷酰胺( cyclophosphamide，Cy) 制备免疫功能低下模型，计算脾脏指数; MTT法检测脾
淋巴细胞增殖活性; 分光光度法检测血清溶血素的含量; QHS法检测脾脏分泌抗体形成细胞的能力;流式细胞术检
测外周血 NK细胞百分比。结果: 竹节参多糖能提高免疫低下小鼠的脾脏指数;显著促进脾淋巴细胞的增殖;促进
血清溶血素的生成及 QHS反应; 提高外周血 NK细胞比例。结论: 竹节参多糖具有较好的免疫增强作用，对免疫低
下小鼠的免疫系统具有恢复作用。
关键词 竹节参;多糖;免疫调节;淋巴细胞; NK细胞
中图分类号: R285. 5 文献标识码: A 文章编号: 1001-4454( 2011) 01-0091-04
Effects of Polysaccharides Isolated from Panax japonicus on Immunosuppression Mice
ZHANG Chang-cheng，ZHAO Hai-xia，JIANG Mei-jie，WANG Hong-wu，HE Yu-min，ZENG Xiao，YUAN Ding
( Medical College of China Three Gorges University，Yichang 443002，China)
Abstract Objective: To investigate the immunomodulatory effects of polysaccharides from Panax japonicus on immunosuppressed
mice. Methods: Immunosuppressed murine model were established in Kuming mice induced by cyclophosphamide( Cy) and splenic in-
dexes were evaluated. The proliferation activities of splenic lymphocyte were assayed by MTT and levels of serum hemolysin were con-
firmed by spectrophotometry. The antibody-secreting capbilities of splenocytes were assayed by quan-titative haemolysis of SRBC
( QHS) . The percentage of NK cells were analysed by flow cytometry( FCM) . Results: Polysaccharides of Panax japonicus significantly
increased the splenic indexes，promoted the proliferation of splenic lymphocytes，enhanced QHS reaction，elevated the production of ser-
um hemolysin and percentages of peripheral blood NK cells in Cy-induced immunosuppressed mice. Conclusion: Panax japonicus poly-
saccharides can recover immune function in the Cy-induced immunosuppressed mice.
Key words Panax japonicus; Polysaccharides; Immunological regulation; Lymphocytes; NK cell
收稿日期: 2010-03-23
基金项目:国家自然科学基金项目( 30873383)
作者简介:张长城( 1973-) ，博士，副教授，主要从事中药药理学研究; Tel: 0717-6396558; E-mail: greatwall@ ctgu. edu. cn。
* 通讯作者:袁丁，Tel: 0717-6397366; E-mail: yxyyd@ ctgu. edu. cn。
中药多糖具有多种生理活性，已成为生命科学
的重点研究内容。研究多糖的免疫调节作用是目前
中药多糖药理研究的热点〔1〕。近年来对中药多糖
的深入研究，为寻找新型免疫调节剂及抗肿瘤药物
提供了广阔的前景。竹节参系五加科人参属植物竹
节参 Panax japonicus C. A. Meyer的干燥呈竹鞭状根
茎，是我国西南地区土家族、苗族集聚地区民间常用
中草药，具有滋补强壮、散瘀止痛、止血祛痰等功效，
常用于病后虚弱，劳嗽咯血，咳嗽痰多、跌扑损伤等
症。竹节参主含皂苷、多糖等化学成分〔2-4〕，研究显
示，竹节参提取物具有增强机体免疫功能的作用，但
有关竹节参多糖对免疫功能损伤的保护作用尚未见
报道，本实验利用环磷酰胺( Cy) 腹腔注射制备小鼠
免疫低下模型，探讨竹节参多糖的免疫调节作用，旨
在为竹节参的应用提供实验依据。
1 材料与仪器
1. 1 实验动物 6 ～ 7 周龄 SPF 级昆明小鼠，体质
量 18 ～ 22 g，雌雄各半，湖北省实验动物研究中心提
供，动物生产许可证号: SCXK ( 鄂 ) 2008-0005。豚
鼠:健康豚鼠。鸡:健康家鸡。
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DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2011.01.033
1. 2 药物与试剂 竹节参采自湖北省恩施州宣恩
椿木营竹节参种植基地，经三峡大学医学院中医系
谭复成教授鉴定为五加科植物竹节参 ( Panax ja-
ponicus C. A. Meyer) 的根茎。磷脂酰乙醇胺 ( Phos-
phatidylethanolamine，PE) 标记抗小鼠 CD49b 单克隆
抗体和异硫氰酸荧光素 ( fluorescinisothiocyate，
FITC) 标记抗小鼠 CD3 单克隆抗体，美国 eBioscine-
nce公司;胎牛血清，杭州四季青生物工程公司; RP-
MI-1640 培养基，美国 GIBCO 公司; MTT 及刀豆蛋
白 A( concanavalin A，Con A) ，美国 Sigma公司;注射
用环磷酰胺 ( 批号: 08121021 ) ，江苏恒瑞医药股份
有限公司;香菇菌多糖片( 批号: 20090101 ) ，开封制
药集团有限公司; 其余试剂均为国产分析纯。
1. 3 主要仪器 全波长酶标仪( Tecan200 型) ，美
国 Thermo electron 公 司; 高 速 冷 冻 离 心 机
( Suprafuge22) ，日本 Heraeus 公司等; 721 分光光度
计，上海第三分析仪器厂; BL-600 电子天平，北京赛
多利斯仪器系统有限公司; AL104-电子天平，瑞士
METTLER TOLEDO 公司; 96 孔细胞培养板，日本
IWAKI公司; CO2 细胞培养箱，美国 Shell /LAB 公
司。
2 方法
2. 1 竹节参多糖的制备 竹节参根茎除去泥沙，
干燥后打成粗粉，经乙醇脱脂，水提后 80%乙醇醇
沉过夜，抽滤得多糖沉淀，蒸馏水溶解后 Sevag 法除
蛋白，H2O2 脱色后透析 72 h，60 ℃真空干燥得浅褐
色多糖，苯酚浓硫酸法检测总糖含量为 69. 70%，
DNS 法检测还原糖含量为 5. 82%，多糖含量为
64. 19%。
2. 2 鸡红细胞( CRBC，chicken red blood cell) 的制
备〔5〕 在无菌条件下，由健康成年鸡静脉取血，置
于三角瓶中，加入 5 倍鸡血容积的 Alsevers 溶液混
匀，4 ℃冰箱贮存。临用时，用氯化钠注射液洗涤 3
次，前 2 次离心速度为1 500 r /min，离心 5 min，弃上
清液和界面的白细胞层，最后再连续 2 次离心 ( 2
000 r /min，5 min) 直至红细胞比容恒定，洗涤后以 1
∶ 5 用生理盐水稀释
2. 3 豚鼠血清( 补体) 的制备〔6〕 取 8 周龄，体质
量 300 ～ 400 g豚鼠 4 只，心脏采血，离心分离血清，
置 － 20 ℃保存，临用前以生理盐水按要求稀释。
2. 4 动物模型制备及给药 48 只昆明小鼠随机
分为 5 组，第 1 组为空白对照组，仅灌服生理盐水，
第 2 组为模型组，每天灌服生理盐水 0. 4 mL，连续 7
d，于灌服第 1 天腹腔注射 Cy( 50 mg /kg) 连续 3 d。
第 3、4、5 组为竹节参多糖低、中、高剂量组，处理方
法同模型组，并分别灌服竹节参多糖( 125、250、500
mg /kg) 。另取 48 只昆明小鼠，随机分组与给药方
法同前，各组第 3 天腹腔注射 20% 鸡红细胞
( CRBC) 0. 2 mL /只，对照组腹腔注射等体积 NS。
给药期间，每只小鼠按规定给予定量饲料，自由饮
水，每日记录小鼠体质量，观察小鼠体质量及毛色变
化。
2. 5 小鼠免疫器官质量的测定 末次给药 24 h
后称量体质量，处死小鼠，取脾并称湿质量，以小鼠
脾质量 /体质量( mg /g) 作为脾脏指数。
2. 6 脾淋巴细胞增殖试验〔7，8〕( MTT 法) 末次药
后 24 h处死动物，置 75%酒精浸泡 5 min，无菌取出
脾脏，过 200 目细胞筛，用 RPMI-1640 不完全培养液
制成细胞悬液，4 ℃ 1 000 r /min 离心 5 min，弃上
清。重悬 1 次，用 RPMI-1640 培养液调整细胞浓度
为 5 × 106 /mL。取 96 孔细胞培养板，每孔加入 100
μL细胞悬液和 50 μL ConA 液 ( 终浓度为 5 μg /
mL) 。将培养板置 37 ℃、5%CO2 培养箱培养 48 h，
加入 5 mg /mL MTT 液 10 μL，震荡 2 min 后继续培
养 4 h。取出培养板，2 000 r /min 离心 5 min，弃上
清液，各孔加 DMSO 100 μL，震荡 10 min后，以 DM-
SO调零，用酶标仪测光密度 D ( λ ) 值 ( 波长 570
nm) ，计算刺激指数( SI) 。
SI =
D( λ) 刺激孔
D( λ) 对照孔
2. 7 小鼠血清溶血素含量测定〔6〕 昆明种小鼠于
给药第 8 天，摘眼球取血制备血清。通过正交试验，
筛选出合适比例的补体( 豚鼠血清) 、血清与鸡红细
胞的浓度。即 1∶ 100 的血清，1. 25% CRBC，1∶ 20 的
补体。将血清用生理盐水 100 倍稀释，加入 96 孔
板，每孔 100 μL，继而依次加入等量 1. 25%鸡红细
胞和豚鼠血清( 1∶ 20 稀释) ，试验孔总体积 300 μL，
同时设置血清阳性对照、补体对照、CRBC 对照、
CRBC半数溶血值及生理盐水对照( 调零用) ，实验
均设 3 个复孔，置 37 ℃温箱温育 1 h，2 000 r /min，
离心 10 min，取上清 150 μL放入另一 96 孔板，置酶
标仪 415 nm 波长处测定光密度 D( λ) 值。并按下
列公式计算每只小鼠样品的半数溶血值( HC50 ) 。
HC50 =
D( λ) 样品
D( λ) 全溶血
× 2 ×样品血清稀释倍数
2. 8 小鼠脾分泌抗体能力的测定( QHS)〔9〕 第 3
天，每只小鼠腹腔注射 20%鸡红细胞悬液 0. 2 mL
进行免疫。第 8 天，小鼠脱臼处死，取脾，用冷的
Geys液制成 5 × 106 /mL 脾细胞悬液。取试管若干
只，每管依次加入脾细胞悬液、0. 2%CRBC、1∶ 10 豚鼠
·29· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 34 卷第 1 期 2011 年 1 月
血清各 0. 5 mL，充分混匀，另设不加补体的空白对
照。置 37 ℃水浴中温育 1 h，离心 ( 3 000 r /min) 5
min。取上清液，用分光光度计( 波长 413 nm) 测光
密度值。
2. 9 小鼠外周血 NK细胞比例的测定 于末次给
药 24 h后，眼球取血，加肝素抗凝，采用流式细胞术
测定处周血 NK百分比。
2. 10 统计学处理 数据经 SPSS 软件处理，实验
各个指标均用 珋x ± s 表示，各组均属之间比较进行
one-way ANOVA检验。
3 结果
3. 1 竹节参多糖对小鼠体质量的影响 在实验过
程中，各组小鼠活动活跃，毛色有光泽，未见有脱毛、
松毛( 除模型组外) 、腹泻和死亡情况。模型组小鼠
体质量显著低于空白对照组( P ＜ 0. 05 ) ，竹节参多
糖各剂量组与模型组比较，体质量有所增加。结果
见表 1。
表 1 竹节参多糖对小鼠体质量的影响(珔x ± s，n =8)
组别 剂量 / ( g /kg) 体质量 /g
空白对照组 － 25. 74 ± 1. 14
模型组 － 21. 90 ± 2. 27*
香菇多糖组 0. 100 25. 60 ± 2. 11#
竹节参多糖低剂量组 0. 125 23. 08 ± 2. 07#
竹节参多糖中剂量组 0. 250 23. 76 ± 2. 40#
竹节参多糖高剂量组 0. 500 25. 03 ± 1. 48#
注:与空白对照组比较，* P ＜ 0. 05; 与模型组比较，#P ＜ 0. 05
3. 2 竹节参多糖对脾脏指数的影响 模型组小鼠
脾指数显著低于空白对照组( P ＜ 0. 05 ) ，竹节参多
糖各剂量组与模型组比较差异显著( P ＜ 0. 05) 。结
果见表 2。
表 2 竹节参多糖对小鼠脾脏指数的影响(珔x ± s，n =8)
组别 剂量 /( g /kg)
脾脏指数 /
( mg /g)
空白对照组 － 3. 88 ± 0. 06
模型组 － 2. 57 ± 0. 06＊＊
香菇多糖组 0. 100 3. 58 ± 0. 05#
竹节参多糖低剂量组 0. 125 2. 84 ± 0. 07#
竹节参多糖中剂量组 0. 250 2. 87 ± 0. 05#
竹节参多糖高剂量组 0. 500 3. 07 ± 0. 17#
注:与空白对照组比较，＊＊P ＜ 0. 01; 与模型组比较，#P ＜ 0. 05
3. 3 竹节参多糖对脾淋巴细胞增殖的影响 与空
白对照组比较，模型组淋巴细胞增殖转化能力显著
降低( P ＜ 0. 05) 。竹节参多糖对淋巴细胞的增殖能
力有提高作用。结果见表 3。
表 3 竹节参多糖对脾淋巴细胞转化的影响(珔x ± s，n =8)
组别 剂量 / ( g /kg) SI
空白对照组 － 2. 48 ± 0. 22
模型组 － 1. 62 ± 0. 14*
香菇多糖组 0. 100 2. 40 ± 0. 21#
竹节参多糖低剂量组 0. 125 1. 99 ± 0. 18#
竹节参多糖中剂量组 0. 250 2. 05 ± 0. 11#
竹节参多糖高剂量组 0. 500 2. 22 ± 0. 15##
注:与空白对照组比较，* P ＜ 0. 01; 与模型组比较，#P ＜ 0. 05，##
P ＜ 0. 01
3. 4 竹节参多糖对小鼠血清溶血素的影响 空白
对照组与模型组比较有显著性差异( P ＜ 0. 01 ) ; 模
型组与用药组均具有显著性差异( P ＜ 0. 05 或 P ＜
0. 01) ;结果显示竹节参多糖各剂量均可提高免疫
抑制小鼠血清溶血素含量，并呈一定量效关系。结
果见表 4。
表 4 竹节参多糖对小鼠血清溶血素的影响(珔x ± s，n =8)
组别 剂量 /( g /kg)
血清溶血
素 /D( λ) HC50
空白对照组 － 1. 05 ± 0. 05 93. 27 ± 4. 44
模型组 － 0. 33 ± 0. 02＊＊ 29. 73 ± 1. 80＊＊
香菇多糖组 0. 100 0. 84 ± 0. 01## 75. 27 ± 0. 90##
竹节参多糖低剂量组 0. 125 0. 55 ± 0. 03# 48. 90 ± 2. 67#
竹节参多糖中剂量组 0. 250 0. 64 ± 0. 06## 57. 28 ± 5. 37##
竹节参多糖高剂量组 0. 500 0. 78 ± 0. 03## 69. 68 ± 2. 68##
注: 与空白对照组比较，＊＊ P ＜ 0. 01; 与模型组比较，# P ＜
0. 05，##P ＜ 0. 01
3. 5 竹节参多糖对脾脏分泌抗体的影响 模型组
QHS反应较空白对照组小鼠明显受抑制 ( P ＜
0. 01) ;竹节参多糖可促进免疫低下小鼠的 QHS 反
应，低、中、高剂量组脾脏分泌抗体的能力均显著提
高，与模型组比较差异显著( P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01) ，
结果见表 5。
表 5 竹节参多糖对脾脏分泌抗体的影响(珔x ± s，n =8)
组别 剂量 /( g /kg)
抗体形成细胞
/D( λ)
空白对照组 － 0. 31 ± 0. 01
模型组 － 0. 20 ± 0. 03＊＊
香菇多糖组 0. 100 0. 29 ± 0. 01##
竹节参多糖低剂量组 0. 125 0. 23 ± 0. 23#
竹节参多糖中剂量组 0. 250 0. 24 ± 0. 02##
竹节参多糖高剂量组 0. 500 0. 26 ± 0. 02##
注: 与空白对照组比较，＊＊ P ＜ 0. 01; 与模型组比较，# P ＜
0. 05，##P ＜ 0. 01
·39·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 34 卷第 1 期 2011 年 1 月
3. 6 竹节参多糖对 NK细胞百分比的影响 模型
组小鼠外周血 NK细胞比例与空白组比较显著降低
( P ＜ 0. 01) ，竹节参多糖能拮抗 Cy 的抑制作用，对
免疫抑制小鼠外周血 NK 细胞比例具有恢复作用。
结果见表 6。
表 6 竹节参多糖对 NK活性的影响(珔x ± s，n =8)
组别 剂量 / ( g /kg) NK/%
空白对照组 － 10. 43 ± 1. 29
模型组 － 1. 56 ± 0. 26＊＊
香菇多糖组 0. 100 4. 83 ± 1. 22#
竹节参多糖低剂量组 0. 125 4. 32 ± 1. 81#
竹节参多糖中剂量组 0. 250 5. 83 ± 2. 34#
竹节参多糖高剂量组 0. 500 6. 93 ± 1. 31##
注: 与空白对照组比较，＊＊ P ＜ 0. 01; 与模型组比较，## P ＜
0. 05，#P ＜ 0. 01，
4 讨论
机体免疫功能低下是导致多种疾病发生的重要
原因，故寻找具有增强机体免疫功能的药物具有重
要意义。植物多糖因其来源广泛、天然无毒，具有较
广泛的活性，是目前研究的热点。许多植物多糖具
有调节机体的特异性和非特异性免疫功能的作用。
环磷酰胺是治疗恶性肿瘤的烷化剂代表药物，可导
致机体免疫抑制，从而导致免疫功能低下，是制备免
疫功能低下动物模型较理想的实验药物〔10〕。本研
究以环磷酰胺制备的免疫低下小鼠为实验动物模
型，探讨了竹节参多糖对其免疫功能的调节作用。
本实验结果显示，环磷酰胺使小鼠食欲减退，毛
色光泽渐失，体质量减轻并显著降低实验小鼠的脾
脏指数和脾淋巴细胞增殖能力，显著削弱了小鼠体
液免疫功能，抑制非特异性免疫。竹节参多糖能明
显恢复免疫低下小鼠体质量和脾脏指数，在体外可
增强 ConA刺激下小鼠的 T淋巴细胞增殖反应。脾
脏是机体最大的外周性免疫器官，是 T、B 淋巴细胞
定居和对抗原刺激进行增殖的场所。提示竹节参多
糖可通过提高免疫低下小鼠的 T 细胞增殖能力，使
脾脏指数明显回升，增强了小鼠机体免疫水平。同
时，竹节参多糖能显著增加免疫抑制小鼠的血清溶
血素含量及促进 QHS 反应，提示免疫低下小鼠的
IgM抗体水平和脾脏 B淋巴细胞分泌抗体能力均获
得提高，小鼠的体液免疫功能得到较好的恢复。本
研究还发现，竹节参多糖能提升模型小鼠外周血
NK细胞的比例，NK 细胞是非特异性免疫的重要标
志，提示竹节参多糖能够拮抗环磷酰胺对外周血
NK细胞的抑制作用，增强了机体的非特异性免疫
的功能。
本实验研究表明，竹节参多糖对环磷酰胺所致
小鼠免疫低下具有较好的恢复作用，具有促进免疫
低下小鼠脾细胞增殖功能及分泌 IgM 抗体的能力，
提升外周血 NK 细胞比例的作用，但其增强免疫功
能的分子机制仍有待进一步研究揭示。
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《中药材》杂志为中国科技核心期刊。
·49· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 34 卷第 1 期 2011 年 1 月