全 文 ：·50· Chinese Journal of Information on TCM Jan.2014 Vol.21 No.1
不同工艺提取的竹节参皂苷粗提物毒性
及其抗炎作用初步研究
代艳文 1,袁丁 1,张海滨 1,万静枝 1,孙志伟 2,陈赤清 3,张长城 1,王婷 1
1.三峡大学医学院,湖北 宜昌 443002；2.湖北职业技术学院,湖北 宜昌 443002；
3.五峰赤诚生物科技有限公司,湖北 五峰 443413
摘要：目的 比较不同工艺提取的竹节参皂苷粗提物的毒性及抗炎效果。方法 采用不同工艺分别制备竹
节参皂苷粗提物样品 1、样品 2、样品 3、样品 4、样品 5、样品 6,然后用不同工艺、不同浓度的样品处理 RAW264.7
细胞,显微镜下观察细胞形态,噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力,一氧化氮(NO)试剂盒检测 RAW264.7 细胞 NO 释放
量。结果 不同样品作用于 RAW264.7 细胞毒性从小到大依次为：样品 4＜样品 6＜样品 5＜样品 2＜样品 1＜
样品 3。不同样品对脂多糖刺激的 RAW264.7 细胞 NO 释放抑制效果依次为：样品 4＞样品 5＞样品 2＞样品 6＞
样品 1＞样品 3。结论 6 种不同提取工艺得到的竹节参皂苷粗提物中,泡沫分离法提取的竹节参皂苷粗提物毒
性最小,抗炎效果最好。
关键词：皂苷；提取工艺；竹节参皂苷粗提物；抗炎；细胞活力
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.01.016
中图分类号：R285.5；R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2014)01-0050-04
Toxicity and Anti-inflammatory Effect of Total Saponins from Panax japonicus by Different
Extraction Technology DAI Yan-wen1, YUAN Ding1, ZHANG Hai-bin1, WAN Jing-zhi1, SUN Zhi-wei2,
CHEN Chi-qing3, ZHANG Chang-cheng1, WANG Ting1 (1.The Medical College of China Three Gorges University,
Yichang 443002, China；2.Hubei Polytechnic Institute, Yichang 443002, China；3.Wufeng Chicheng Biotechnology Co.
Ltd., Wufeng 443413, China)
Abstract：Objective To compare the toxicity and anti-inflammatory effect of total saponins from
Panax japonicus by different extraction technology. Methods The total saponins of sample 1, sample
2, sample 3, sample 4, sample 5 and sample 6 was prepared respectively by different process, and
RAW264.7 cells were treated with the samples of different concentration. Then cells morphology
was observed under microscope, thiazolyl blue (MTT) method was used to detect cell activity, the
nitric oxide (NO) release of RAW264.7 cells was detected with NO kit. Results The cell toxicity of
different samples from low to high was as follows：sample 4＜sample 6＜sample 5＜sample 2＜
sample 1＜sample 3. The NO inhibitory effect on RAW264.7 cells stimulated by LPS was as follows：
sample 4＞sample 5＞sample 2＞sample 6＞sample 1＞sample 3. Conclusion Among these six
different kinds of extraction process of total saponins from Panax japonicus, the total saponins
extract by foam fractionation has not only the minimal toxicity, but also the best primary
anti-inflammatory effect.
Key words：saponins；extraction process；saponins from Panax japonicus；anti-inflammatory；
cell activity
竹节参及其活性成分竹节参总皂苷具有抗炎、镇
痛、免疫调节、抗氧化活性等多种药理活性,且不同

基金项目：国家自然科学基金(31070314、81374001)；高等学
校青年教师深入企业行动计划项目(XD2012122)
通讯作者：王婷,E-mail：tingting0301@126.com
提取方法对竹节参皂苷生物活性的影响很大[1-5]。本研
究采用不同工艺提取竹节参中的皂苷成分,并建立脂
多糖(LPS)致 RAW264.7 细胞炎症模型,对竹节参不同
工艺提取的皂苷粗提物的毒性及抗炎活性进行了初
步研究,以期为竹节参提取工艺及深入研究提供实验
依据。
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1 实验材料
1.1 药物、细胞与试剂
竹节参采于湖北恩施椿木营竹节参种植基地,经
三峡大学湖北省天然产物研究与利用重点实验室邹
坤教授鉴定为五加科人参属植物 Panax japonicus
C.A.Mey。小鼠单核巨噬白血病细胞株 RAW264.7 购于
中国科学院上海细胞库。DMEM 高糖培养基,Gbico 公
司,批号 884684；胎牛血清,杭州四季清公司,批号
100607；LPS(B5：O55),Sigma 公司,批号 110M4086V；
一氧化氮(NO)检测试剂盒,上海碧云天生物技术有限
公司,批号 S0021-3。
1.2 仪器
NU-4750E 型二氧化碳培养箱(Nu Aire 公司)；
SW-4T-2F 洁净工作台(上海博讯实业有限公司医疗设
备 厂 ),CKX41 倒 置 显 微 镜 ( 日 本 奥 林 巴 斯 公
司),TD25-WS 多管架自动平衡离心机(湖南湘仪实验
室仪器开发有限公司),Thermo 全波长酶标仪(芬
兰,TECAN INPINIFETMF 200)。
2 实验方法
2.1 样品制备
2.1.1 乙醇加热回流提取法 参照文献[6]方法。竹
节参药材 100 g,10 倍量 60%乙醇加热回流提取 3
次,2 h 1 次,合并提取液并减压回收溶剂至无醇
味,80 ℃水浴,浓缩至原药材质量5倍,滤除不溶亲脂
性杂质,上清液用水饱和正丁醇等量萃取3次,回收正
丁醇,然后加入适量 85%乙醇溶液溶解竹节参总皂苷
粗提物,并不断搅拌缓慢加入丙酮,常温静置,待沉淀
完全析出,3500～4000 r/min 离心 15 min,收集沉淀
物,并用适量丙酮洗涤,减压真空干燥,得提取物粉末
样品 1。
2.1.2 乙醇超声提取法 竹节参药材 100 g,置锥形
瓶中,加入 60%乙醇 500 mL,超声处理(功率 250 W,频
率 50 kHz)40 min,摇匀,滤过,重复提取 3 次,合并滤
液,回收溶剂,减压真空干燥,得提取物粉末样品 2。
2.1.3 水饱和正丁醇超声提取法 竹节参药材100 g,
置锥形瓶中,加入水饱和正丁醇 500 mL,超声处理(功
率 250 W,频率 50 kHz)40 min,摇匀滤过,重复提取 3
次,合并滤液,回收溶剂,然后加入适量 85%乙醇溶解
竹节参总皂苷粗提物,并不断搅拌缓慢加入丙酮,常
温静置,待沉淀完全析出,收集沉淀物,并用适量丙酮
洗涤,减压真空干燥,得提取物粉末样品 3。
2.1.4 泡沫分离提取法 竹节参药材 100 g,10 倍量
纯水加热回流提取 3 次,提取液浓缩至 500 mL,调 pH
值至 4.88,加入到泡沫分离装置中,控制气体流速为
400 mL/min,进行分离,收集泡沫,乙醇消泡,分离结束
后挥干溶剂,减压真空干燥,得提取物粉末样品 4。
2.1.5 水提醇沉提取法 竹节参药材 100 g,10 倍量
双蒸水提取 3 次,2 h 1 次,合并滤液浓缩至原药材质
量的 5 倍,加 60%乙醇静置过夜,悬浊液于 3500 r/min
离心15 min,上清液水饱和正丁醇等量萃取3次,回收
正丁醇,然后加入适量 85%乙醇溶液溶解竹节参总皂
苷粗提物,并不断搅拌缓慢加入丙酮,常温静置,待沉
淀完全析出,收集沉淀物,并用适量丙酮洗涤,减压真
空干燥,得提取物粉末样品 5。
2.1.6 大孔吸附树脂提取法 竹节参药材 100 g,10
倍量双蒸水提取 3 次,2 h 1 次,合并滤液后浓缩至原
药材质量的 5 倍,加 95%乙醇至乙醇终浓度为 60%,静
置过夜,悬浊液于 3500 r/min 离心 15 min,上清液水
饱和正丁醇等量萃取 3 次,回收正丁醇。然后用 60%
乙醇洗脱竹节参总皂苷粗提物,过大孔吸附树脂纯化,
不断搅拌洗脱液并缓慢加入丙酮,常温静置,待沉淀
析出完全,收集沉淀物,并用适量丙酮洗,减压真空干
燥,得提取物粉末样品 6。
2.2 细胞培养
RAW264.7 细胞株的复苏：用 75%酒精擦拭超净工
作台,紫外线照射超净工作台 30 min,从液氮罐中取
出冻存管,迅速将冻存管放到已经预热的水浴锅
(37 ℃)中迅速解冻,不断摇动,待冻存管内液体完全
溶解(控制在 1 min 内),取出用酒精棉球擦拭冻存管
外壁,再拿入超净台内,将冻存管内的液体转入 15 mL
离心管,加入 2 倍体积含 10%胎牛血清的 DMEM 培养
基,800 r/min 离心 5 min,弃去上清液,重悬细胞,接
种到培养瓶中,37 ℃、5% CO2条件下培养。传代：待
细胞长至 90%后,从培养箱内取出细胞,小心吸出旧培
养液,用 PBS 清洗,加入 3 mL 10%胎牛血清的 DMEM 培
养基,用细胞刮棒沿一个方向轻轻将细胞刮下来,将
细胞悬液转移到15 mL离心管中,800 r/min离心5 min,
弃去上清液,加入培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成
细胞悬液,分装入培养瓶后,放入培养箱 37 ℃、5%CO2
条件下培养。冻存：当细胞长至 80%～90%时,将细胞
收集起来,将胎牛血清与二甲基亚砜(DMSO)按照 9∶1
的比列配制好冻存液。然后每管中加入 2 mL 冻存液
转移至冻存管中,依次放在 4 ℃中 40 min、-20 ℃中
40 min、-80 ℃过夜,第 2 日转移至液氮灌中保存。
2.3 RAW264.7 细胞活力测定
将RAW264.7接种于96孔板,细胞数为105个/mL,
每孔 100 μL,贴壁后,设置调零孔(只有培养液)、正常
组、给药组,给药浓度为 5、10、20、40、80 μg/mL,
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每组 4 个复孔,24 h 后吸取上清液,在每孔中加入含
MTT 的培养液,继续培养 4 h,然后将上清去掉,每孔加
入 150 μL DMSO,置摇床上低速震荡 10 min,使结晶充
分溶解,在酶联免疫检测仪 490 nm 处测量各孔吸光度。
2.4 RAW264.7 细胞一氧化氮释放量测定
将 RAW264.7 接种 96 孔板,细胞数为 105个/mL,
每孔 100 μL,贴壁后,同时加入不同提取工艺的竹节
参皂苷(浓度为 10、1 μg/mL)和 1 μg/mL LPS 作用,
设为空白组、LPS 组、LPS＋竹节参皂苷组,每组 4 个
复孔,24 h 后,取上清液 50 μL,依次加入 GriessⅠ和
GriessⅡ各 50 μL,37 ℃恒温箱中反应 30 min,在酶
联免疫检测仪 540 nm 处测量各孔吸光度。
3 统计学方法
采用 SPSS13.0 统计软件进行分析。所有数据均
以—x±s 表示,采用方差分析进行多组间差异比较,以
Dunnett-t 检验比较两组间均数的差异。P＜0.05 表
示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 不同提取工艺竹节参皂苷粗提物对RAW264.7细
胞活力的影响
形态学观察正常组的细胞呈圆形；与正常组比较,
样品 1 和样品 2 的药物浓度在 40 μg/mL 以下时对细
胞形体无显著影响；浓度达到 40 μg/mL 时细胞明显
肿胀变大,细胞膜逐渐模糊,细胞数量减少,细胞活力
分别为 63.24%和 76.65%(P＜0.01)；浓度为 80 μg/mL
时细胞膜已经破碎溶解,细胞基本死亡,细胞活力分
别为 3.28%和 4.10%(P＜0.01)。样品 3 药物浓度为
40 μg/mL 和 80 μg/mL 时,细胞已经基本死亡,细胞活
力分别为 1.98%和 1.03%(P＜0.01)。样品 4 药物浓度
对细胞形态均无明显影响,当药物浓度为 80 μg/mL 时,
其活力值达到 90.63%。样品 5 和样品 6 浓度在≤
40 μg/mL 时,对细胞无明显影响；当浓度达到 80 μg/mL
时,细胞出现死亡,细胞活力分别降至 2.94%和
9.30%(P＜0.01)。结果见表 1。因此样品的安全范围
为＜40 μg/mL。
4.2 不同提取工艺竹节参皂苷粗提物对脂多糖刺激
细胞一氧化氮释放的影响
通过细胞形态观察及 MTT 活力检测,发现当 LPS
与样品共同作用时,会加重细胞损伤。当样品 1 浓度
为 10 μg/mL、样品 3 浓度为 1 μg/mL 和 10 μg/mL 时,
细胞活力分别降至 53.74%、79.15%和 25.99%(P＜
0.01),提示这几组将不参与 NO 释放比较。而其他样
品在浓度为 1 μg/mL 和 10 μg/mL 时与 LPS 共同作用
细胞时,则对细胞活力无明显影响,见表 2。
采用Griess法检测细胞NO释放水平,与正常组比
较,LPS 组显著升高NO释放量,释放量是正常组的 4倍
(P＜0.01)；加入 1 μg/mL 样品处理后,样品 1、2、4、
5、6对 LPS 刺激细胞释放NO的抑制率分别为25.61%、
34.32%、42.80%、26.42%、32.06%；加入 10 μg/mL
样品处理后,样品 2、4、5、6 对 LPS 刺激细胞释放 NO
的抑制率分别为 51.09%、55.75%、59.65%、46.34%,
差异有统计学意义(P＜0.01)。结果见表 3。
表 1 不同提取工艺竹节参粗提物作用下各浓度组细胞活力比较(—x±s,%,n =4)
样品 正常组 5 μg/mL 组 10 μg/mL 组 20 μg/mL 组 40 μg/mL 组 80 μg/mL 组
样品 1 99.99± 8.05 99.22± 7.41 102.94± 8.95 97.88± 7.26 63.24±11.48** 3.28±2.13**
样品 2 99.99± 9.48 101.94± 5.24 98.10± 5.64 97.94± 9.84 76.65±14.24* 4.10±1.94**
样品 3 99.99± 6.42 100.38±15.25 100.60±16.03 96.14± 9.49 1.98± 0.74** 1.03±0.55**
样品 4 100.00± 7.79 108.12±12.07 98.83± 6.46 103.84± 6.17 104.64±11.72 90.63±5.41
样品 5 100.00± 4.80 109.14±14.38 101.27± 9.63 100.67±16.60 98.24± 8.21 2.94±2.34**
样品 6 100.00±11.74 101.19± 9.24 100.92± 9.45 109.60± 9.50 98.70± 4.18 9.30±2.44**
注：与正常组比较,*P＜0.05,**P＜0.01(下同)
表 2 不同提取工艺竹节参皂苷粗提物作用下各组细胞活力比较(—x±s,%,n =4)
样品 正常组 LPS 组
竹节参粗提物组
1 μg/mL 10 μg/mL
样品 1 99.99±3.46 101.57±11.33 106.86±12.86 53.74± 4.03**
样品 2 99.99±3.46 101.57±11.33 97.77±17.06 100.80± 6.18
样品 3 99.99±3.46 101.57±11.33 79.15±22.73* 25.99± 6.67**
样品 4 99.99±3.46 101.57±11.33 99.59± 5.77 98.79± 9.50
样品 5 99.99±3.46 101.57±11.33 107.26± 9.21 99.68± 8.44
样品 6 99.99±3.46 101.57±11.33 103.91± 5.37 102.09±12.92
表 3 不同提取工艺竹节参皂苷粗提物作用下各组 NO释放水平比较(—x±s,n =4)
样品 正常组 LPS 组
竹节参粗提物组
1 μg/mL 10 μg/mL
样品 1 8.03±1.05 28.89±2.53** 21.49±0.65## -
样品 2 8.03±1.05 28.89±2.53** 18.98±0.18## 14.14±0.72##
样品 3 8.03±1.05 28.89±2.53** - -
样品 4 8.03±1.05 28.89±2.53** 16.53±0.59## 12.79±0.75##
样品 5 8.03±1.05 28.89±2.53** 21.26±3.13## 11.66±0.66##
样品 6 8.03±1.05 28.89±2.53** 19.63±1.39## 15.51±1.30##
注：与 LPS 组比较,##P＜0.01
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5 讨论
NO是存在于哺乳动物中常见的信号分子,由L-精
氨酸、氧分子、还原型辅酶Ⅱ及其他辅助因子在不同
类型一氧化氮合酶(NOS)催化下合成。NO 可以产生于
人体内多种细胞,在心血管、免疫、神经等系统中均
扮演着重要的角色。在炎症反应中,NO 是判断炎症最
基本的指标,主要由诱导型一氧化氮合酶(iNOS)催化
合成,信号通路主要包括 p38 MAPK、ERK1/2 或者 NF-
κB,研究发现抑制 p38 MAPK、ERK1/2 或者 NF-κB 能
够阻碍iNOS蛋白合成,导致NO减少,继而发挥抗炎保
护效应[6]。LPS 是 NO 合成的强诱导剂,通过对巨噬细
胞内iNOS基因的诱导,而导致NO的大量合成和分泌。
本实验结果表明,采用不同工艺提取的竹节参皂
苷粗提物对细胞活力影响不同,作用于RAW264.7细胞
株的毒性依次为：样品 4＜样品 6＜样品 5＜样品 2＜
样品 1＜样品 3；对应的提取工艺分别是泡沫分离提
取法、大孔吸附树脂提取法、水提醇沉提取法、乙醇
超声提取法、乙醇加热回流提取法以及水饱和正丁醇
超声提取法,这表明采用泡沫分离工艺提取的总皂苷
对细胞毒性最小。研究还发现,不同提取工艺竹节参
皂苷粗提物干预LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞后,可
剂量依赖性抑制其NO产生,巨噬细胞的形态也趋于正
常,样品抑制效果依次为：样品4＞样品5＞样品2＞样
品 6＞样品 1＞样品 3,分别对应的提取工艺为泡沫分
离提取法、水提醇沉提取法、乙醇超声提取法、大孔
吸附树脂提取法、乙醇加热回流提取法和水饱和正丁
醇超声提取法。提示在这 6 种不同提取工艺得到的竹
节参皂苷粗提物中,运用泡沫分离法提取的竹节参皂
苷粗提物不仅毒性小,而且其抗炎效果最好。
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(收稿日期：2013-05-16,编辑：华强)

(上接第 49 页)
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