全 文 ：ChineseJournalofNewDrugs2011, 20(2)
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中国新药杂志 2011年第 20卷第 2期
[基金项目 ] 重大新药创制科技重大专项(2009ZX09301-010)
[作者简介 ] 刘敬弢 ,男 ,博士研究生 ,从事肿瘤药理学研究。联系
电话:(010)82801161, E-mail:xyljt 1985@126.com。
[通讯作者 ] 崔景荣 ,女 ,教授 ,博士生导师 , 从事肿瘤药理学研究。
联系电话:(010)82802467, E-mail:jrcui@bjmu.edu.cn。
·重大新药创制专项巡礼·
乙二酰二脱水卫矛醇对小鼠移植性肝癌 H22肿瘤生长和
血管生成的抑制作用
刘敬弢 1 ,郭 维 1 ,徐 波 1 ,佟 侃1 ,周 瑛 2 ,崔景荣 1
(1北京大学药学院天然药物与仿生药物国家重点实验室 ,北京 100191;2广西中医药研究院 ,南宁 530022)
[摘要 ] 目的:研究乙二酰二脱水卫矛醇(DADAG)在体内对肿瘤生长和血管生成的抑制作用及其机
制 。方法:采用小鼠 H22模型观察 DADAG对肿瘤生长的影响;免疫组化和 Westernblot法分别检测 DADAG
对肿瘤组织中微血管密度(MVD)和血管内皮生长因子(VEGF)以及转录因子 Sp1表达的影响。结果:DAD-
AG(5和 10 mg·kg-1·d-1)可以浓度依赖性地降低小鼠瘤重(抑制率分别为 29.8%和 60.2%)和 MVD(抑制
率分别为 38.9%和 66.7%),引起肿瘤组织坏死 ,降低 VEGF及 Sp1的表达量 ,但无明显肝 、肾毒性 。结论:
DADAG可以抑制小鼠 H22移植瘤的生长和血管生成 ,下调 VEGF及 Sp1的表达是其可能的作用机制之一 。
[关键词 ] 乙二酰二脱水卫矛醇;肝癌 H22;血管生成;微血管密度
[中图分类号 ] R979.1 [文献标志码 ] A [文章编号 ] 1003 -3734(2011)02 -0115 -05
Inhibitoryefectofdiacetyldianhydrogalactitolontransplanted
hepatocarcinoma22 growthandangiogenesisinmice
LIUJing-tao1 , GUOWei1 , XUBo1 , TONGKan1 , ZHOUYing2 , CUIJing-rong1
(1 StateKeyLaboratoryofNaturalandBiomimeticDrugs, SchoolofPharmaceuticalSciences,
PekingUniversity, Beijing100191, China;2 TraditionalChineseMedicineInstituteofthe
GuangxiZhuangAutonomousRegion, Nanning530022 , China)
[ Abstract] Objective:Toexploretheanti-tumorandanti-angiogenesisefectofdiacetyldianhydrogalactitol
(DADAG)onhepatocarcinomaH22 inmiceandthepossiblemechanism.Methods:Solid-typehepatocarcinoma
H22 wastransplantedinmicetoobservetheinhibitoryefectofDADAGontumorgrowth.Immunohistochemicalstai-
ningandwesternblotwereperformedtodetecttheefectofDADAGonmicroveseldensity(MVD), andtheex-
pressionofvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)anditsupstreamtranscriptionfactorSp1 intumortissues.
Results:DADAG(5 and10mg·kg-1·d-1)dose-dependentlyinhibitedtumorgrowthby29.8%and60.2%, and
MVDby38.9%and66.7%, respectively.DADAGalsoinducedtumornecrosisanddown-regulatedtheexpres-
sionofVEGFandSp1 withoutsignificanthepatotoxicityandnephrotoxicity.Conclusion:DADAGinhibitstumor
growthandangiogenesisofhepatocarcinomaH22 inmicebydecreasingVEGFandSp1 expression.
[ Keywords] diacetyldianhydrogalactitol(DADAG);hepatocarcinoma22 (H22);angiogenesis;microves-
seldensity(MVD)
血管生成 (angiogenesis)是指在宿主已有的微
血管床上 ,由内皮细胞芽生而产生新的微血管并形
成血管网的过程 ,包括内皮细胞的活化 、增殖 、移行
和管道化 [ 1] 。研究表明[ 2] ,大多数恶性实体瘤的生
长和转移都需要周围血管的支持。新生血管是肿瘤
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赖以生长和生存的物质基础 ,肿瘤细胞需要它们为
其输送养料并排出废物。自从 1971年 Folkman[ 3]
提出血管生成假设以来 ,抗血管生成已经成为一大
研究热点。 1996年 Hanahan等[ 4]又提出血管生成
的开关平衡假说 ,以肿瘤血管为靶点的靶向治疗
(tumorvasculartargetingtherapy)逐步发展成为当
今对抗肿瘤的主攻方向之一。 TNP-470是第一个用
于临床癌症治疗的血管生成抑制剂(angiogenesisin-
hibitors, AI),之后内皮抑素(endostatin)[ 5] 、白介素-
12(IL-12)[ 6]和 SU11248[ 2, 7]等化合物也相继应用于
临床。
乙二酰二脱水卫矛醇 (diacetyldianhydrogalacti-
tol, DADAG)是 20世纪 50年代匈牙利人 Vargha等
在多元醇烷化剂研究中得到的最有前景的化合物之
一 [ 8] 。有报道表明[ 9] , DADAG不仅可以直接对抗
脑瘤 、黑色素瘤等实体瘤 ,还能通过抑制血管生成发
挥抗癌作用 。前期研究结果显示 [ 1] , DADAG可以
在鸡胚模型中抑制尿囊膜血管新生 ,在细胞水平对
抗血管内皮细胞的增殖和迁移 ,而且上述作用很可
能与 DADAG下调血管内皮细胞生长因子(vascular
endothelialgrowthfactor, VEGF)的表达有关 。目前 ,
我们还未见有关 DADAG在肿瘤组织中对抗血管生
成的研究报道 ,故本实验以 ICR荷瘤小鼠为实验对
象 ,探讨 DADAG对肝癌 22(H22)肿瘤生长和血管生
成的影响以及相关蛋白表达的作用。
材料与方法
1 药品及试剂
化合物 DADAG由广西壮族自治区中医药研究
院周瑛教授合成 ,使用时用生理盐水溶解并稀释至
终浓度;VEGF兔源多克隆抗体(A-20)、Sp1兔源多
克隆抗体及 CD31(PECAM-1)大鼠抗小鼠单克隆抗
体均购于上海优宁维生物技术公司(SantaCruz公
司生产), 1∶200稀释;辣根过氧化物酶标记的羊抗
鼠(大鼠二步法 , PV-6004)、DAB显色液(ZLI9032)、
3% H2O2均购于中杉金桥生物技术公司;化学发光
试剂 (ECL, RPN2106)购于 AmershamBiosciences
(GEHealthcare)公司 。
2 实验仪器
80 2B型离心机 (上海安亭科学仪器厂);
JJT 1300型超净工作台(北京半导体设备一厂);
OMC 3795型倒置显微镜(日本 Olympus公司);
DYY 7C型电泳仪 (北京六一仪器厂);DYCP
40E型电泳槽(北京六一仪器厂);TY 80S型脱色
摇床(南京新校园生物技术研究所)。
3 实验动物及细胞株
雄性 ICR小鼠 ,体重 18 ～ 22 g, 5 ～ 6周龄 ,购
于北京大学医学部实验动物部 ,合格证号:SCXK
(京)2006-0009。小鼠培养于 (22 ±2)℃的 12 h
昼夜更替的环境中 ,每笼 4只 ,并提供充分的水分
及饲料供应 。小鼠 H22细胞由北京大学天然药物
及仿生药物国家重点实验室抗肿瘤药物筛选中心
细胞库提供。
4 小鼠肝癌 H22移植瘤模型实验
无菌条件下取 ICR传代 d7小鼠腹水细胞 ,经
离心 、细胞计数 ,用生理盐水溶解稀释配成密度为
1×106个·mL-1的细胞悬液 ,皮下接种于小鼠右前
肢腋下 ,每只注射 0.2 mL。小鼠于接种肿瘤翌日随
机分组并腹腔注射给药 , qd;对照组注射生理盐水 ,
两个给药组注射剂量分别为 5和 10 mg·kg-1·d-1。
小鼠连续给药 10 d后称重 ,断颈处死小鼠 ,分离得
到其肝 、肾 、肿瘤并称重 , 根据瘤重计算各组抑瘤
率 ,肿瘤置于液氮或 10%甲醛水溶液 (4 ℃)中
保存 。
5 免疫组织化学法检测肿瘤微血管密度(microves-
seldensity, MVD)
新鲜分离的肿瘤组织经 10%甲醛水溶液(4 ℃)
固定 24 h后包埋于石蜡中 ,制成 4 μm厚的切片 ,用
苏木精和伊红(HE)染色 ,并置于光学显微镜下观
察。另外 ,将切片用二甲苯脱蜡 ,梯度酒精水化 ,置
于浓度为 10 mmol·L-1的枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)
中煮沸 20 min修复抗原 。室温冷却 20 min后 , 用
3% H2O2封闭内源性过氧化物酶活性 。用磷酸盐
缓冲液(PBS)将切片冲洗干净 ,滴加 CD31鼠源单
克隆抗体(1∶200, SantaCruz, USA),置于保湿盒中
隔夜 4 ℃孵育 。翌日用 PBS冲洗切片后滴加二抗
室温孵育 1 h,继续用 PBS冲洗 。依次 DAB显色
5 ～ 10 min, 苏木素复染 10 min,盐酸酒精快速分
化 ,自来水冲洗反蓝 ,梯度酒精脱水 ,二甲苯透明 。
中性树胶封片后于显微镜下观察 , 各组分别在
200 ×视野下随机选择 3个视野计数 ,取其均值作
为 MVD[ 10] 。
6 Westernblot法检测血管生成相关蛋白表达
自液氮中取出肿瘤组织 ,提取总蛋白 ,运用考马
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斯亮蓝显色法(Bio-RadLaboratories, Inc.Richmond,
CA)蛋白定量 , 65 ℃灭活 10 min。取 50 μg总蛋白
量进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE),后将蛋
白电转移(2 h)至硝酸纤维素膜 (NC膜)上。依次
进行丽春红染色 ,蛋白标记 , 3%胎牛血清白蛋白
(BSA,鼎国生物技术公司)封闭 1 h。加入含 1.5%
BSA的一抗 4 ℃孵育过夜 , Tris缓冲液(1 ×TBST)
润洗 10 min×3次 ,再加入含 1.5% BSA的二抗室
温孵育 1 h, TBST润洗 15 min×4次 ,化学发光试剂
(ECL)显色 ,曝光 ,利用 BandScan软件进行灰度扫
描后分析并保存。
7 统计学处理
实验结果用 x±s表示 ,采用 Excel2003软件作
统计学比较 ,各给药组与对照组间采用 t检验(计数
结果)或 χ2检验(计量结果)。 P<0.05被认为差
异有统计学显著性。瘤重抑制率 /% =(对照组平
均瘤重 -给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重 ×
100;MVD抑制率 /%=(对照组平均 MVD-给药组
平均 MVD)/对照组平均 MVD×100;相对灰度值 =
(待测蛋白条带总灰度值 /条带面积)/(β-actin条带
总灰度值 /β-actin条带面积)。
结 果
1 DADAG对小鼠肝癌 H22的影响
表 1的结果显示 , DADAG两个剂量组的肿瘤重
量均明显低于对照组(P<0.001);低剂量组抑制率
接近 30%,高剂量组可达 60%;如表 2所示 ,与对照
组相比 ,两给药组小鼠的体重及肝 、肾指数均无显著
差异。
表 1 DADAG对小鼠肝癌 H22瘤重的影响
n=10, x±s
组 别 剂量 /mg·kg-1·d-1 瘤重 /g 抑制率 /%
对照组 — 1.393±0.205 —
DADAG低剂量组 5 0.978±0.200a 29.8
DADAG高剂量组 10 0.554±0.171a 60.2
与对照组相比 , a:P<0.001
表 2 DADAG对小鼠的毒性作用 n=10, x±s
组 别 剂量 /mg·kg-1·d-1 体重增加量 /g 肝脏指数 /mg·g-1 肾脏指数 /mg·g-1
对照组 — 5.9 ±2.2 66.643±27.861 13.801±5.804
DADAG低剂量组 5 5.1 ±1.9 64.698±27.276 14.717±6.162
DADAG高剂量组 10 5.4 ±1.8 59.744±6.106 14.420±1.173
2 DADAG对小鼠肝癌 H22肿瘤组织的形态学影响
为考察 DADAG在体内对 H22组织形态的影
响 ,将各实验组小鼠的肿瘤组织进行病理检测 。
如图 1所示 ,对照组细胞排列紧密 、规整 ,细胞膜
清晰 ,未见大面积坏死区域;而给药组细胞排列
松散 、无序 ,细胞质发生空泡化 , 细胞核有固缩
(图 1中箭头所指),与对照组相比 ,肿瘤坏死区
面积更大 。
图中箭头所指区域为给药组细胞核固缩以及空泡化结果
图 1 小鼠肝癌 H22肿瘤组织 HE染色结果(×200)
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3 DADAG对小鼠肿瘤组织中 MVD的影响
CD31亦称为血小板内皮细胞粘附分子 1(plate-
letendothelialceladhesionmolecule-1, PECAM-1),
是一种特有的糖蛋白分子 ,其含量高低可以反映肿瘤
组织内的微血管密度 。通过免疫组织化学法对 CD31
分子染色 ,可以探讨 DADAG对肿瘤组织中血管新生
的影响。图 2中亮黄色颗粒即为被标记的 CD31阳性
结果(图中箭头所指),主要位于内皮细胞的胞浆 、胞
膜及胞外基质中。从图中可以看出 ,给药组的 MVD
明显低于对照组 ,并且具有浓度依赖性(见图 3),高
剂量组几乎无阳性表达。这说明 DADAG在体内对
肿瘤生长的抑制作用与阻碍肿瘤微血管生成有关。
图中箭头所示为被 CD31标记的亮黄色颗粒
图 2 小鼠肝癌 H22肿瘤组织免疫组化结果(×200)
与对照组相比 , a:P<0.01, b:P<0.001
图 3 DADAG对 H22肿瘤组织中 MVD的影响
4 DADAG对血管生成相关蛋白表达的影响
为进一步探讨 DADAG影响肿瘤血管生成的作
用机制 ,用 Westernblot法观察肿瘤组织中 VEGF及
其上游调节因子 Sp1表达的变化。图 4显示 ,与对照
组相比 ,给药组 VEGF及 Sp1的表达量均明显减少。
图 4 DADAG对 H22肿瘤组织中 VEGF及
Sp1表达的影响
表 3为 BandScan灰度扫描结果 ,灰度值越高说
明蛋白表达量越低;表中所列为各组蛋白与 β-actin
的相对比值 。上述结果表明 , DADAG很可能是通过
下调 VEGF及 Sp1的表达来抑制肿瘤血管新生的。
表 3 DADAG影响对 H22肿瘤组织中 VEGF及 Sp1
表达的灰度扫描分析 n=20, x±s
组 别 剂量/mg·kg-1·d-1 VEGF Sp-1
对照组 — 0.961 ±0.093 1.448±0.087
DADAG低剂量组 5 1.228 ±0.136 2.010±0.136a
DADAG高剂量组 10 1.404 ±0.068a 2.141±0.206a
与对照组相比 , a:P<0.05
讨 论
20世纪 70年代 , Folkman[ 3] 提出在血管生成 、
肿瘤生长以及转移之间存在某种必然联系 ,自此肿
瘤血管生成便逐渐成为抗肿瘤药物研发的新靶点 。
研究表明 [ 11] ,生理状态下的血管生成是正常组织生
长 、发育 、伤口愈合以及生殖和胚胎发育等的基础;
而在病理状况下 ,长期无控制的血管生成则会加剧
某些疾病的恶化 。AI类药物与化疗药不同的是 ,它
不仅使肿瘤缩小 ,还能控制肿瘤转移 ,长期应用可使
肿瘤处于一种休眠状态 , 因而不会产生耐药性并有
持续作用。
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针对 DADAG的研究已开展多年 ,大多通过实
验证实其具有直接抑制肿瘤生长 、杀伤肿瘤细胞的
作用[ 9] ,而 DADAG抗血管生成的活性只是在体外
水平和鸡胚模型中得到初步证实 [ 1] 。本文采用小
鼠肝癌 H22肿瘤模型 ,腹腔连续给药 10 d,旨在研究
DADAG在体内对抗肿瘤和血管生成的药理作用 ,并
且探讨可能的分子机制 。实验发现 ,随着 DADAG
给药浓度的增加 ,小鼠瘤重不断降低 ,而各组小鼠的
体重变化及肝肾指数差别不大。这说明 DADAG可
以浓度依赖的抑制体内肿瘤的生长 ,但不伴有明显
的肝 、肾毒性 。
分离得到的肿瘤组织被制成病理切片 , 进行
HE染色和免疫组化实验。结果显示 ,肿瘤组织经
HE染色后 ,给药组细胞与对照组相比排列松散 ,形
状不规则 ,细胞膜不完整 ,核固缩明显 ,组织坏死面
积随药物浓度升高而增大;这与 DADAG可降低瘤
重的结论相符 。免疫组化实验则表明 , DADAG可以
浓度依赖地降低肿瘤组织中 CD31阳性表达率(棕
黄色颗粒显著减少),后者是血管内皮细胞表面抗
原 ,可以直接反应组织中的 MVD值。该结果与之
前证实[ 1] DADAG可以对抗正常血管的新生不同 ,
它更真实地反应了 DADAG对肿瘤区域的血管生成
的抑制作用。由此可以推断 , DADAG破坏了微血管
的形成 ,导致肿瘤生长所需的养料不易送达 ,代谢废
物无法排出 ,因而导致肿瘤组织的坏死 。
Hanahan等 [ 4]在开关平衡假说中认为 ,血管新
生受血管生成促进因子和血管生成抑制因子共同调
控 ,平时两类因子动态平衡 ,病理因素则会导致它们
的表达严重失衡。肿瘤的发生发展转移都离不开新
生血管的支持 ,因而血管生成正向调节因子往往会
占据优势。在已知的数 10种促血管生成因子中 ,
VEGF是最为重要也研究最多的成员之一 。后续研
究表明 [ 12] ,转录因子 Sp1属于 VEGF的上游分子 ,
在后者转录调控中起重要作用 ,它可与 VEGF启动
子特异性结合 ,促进其编码基因的转录 。因而本实
验提取肿瘤组织中的蛋白质 ,用 Westernblot法检测
DADAG对 VEGF及 Sp1的表达有无影响 。结果显
示 ,两种分子在给药组的表达均明显低于对照组。
这说明 DADAG很可能是通过下调 VEGF的表达抑
制了肿瘤血管新生 、降低肿瘤 MVD,而该下调作用
又与上游分子 Sp1的表达量降低有关 。
综上所述 ,本研究证实 DADAG可以抑制小鼠
肝癌 H22移植瘤的生长 ,降低肿瘤组织微血管密度 ,
其分子机制可能与其下调 VEGF及上游分子 Sp1的
表达有关。
[ 参 考 文 献 ]
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编辑:罗娟 /接受日期:2010 -06-01