全 文 ：异紫堇啡碱对培养乳鼠心肌内游离钙的影响
黄燮南 ,吴　芹 ,雷开键 ,石京山
(遵义医学院 药理学教研室 ,贵州 遵义　563003)
[ 摘　要] 　目的　观察异紫堇啡碱(ISOC)对去甲肾上腺素(NA)和高钾所致培养乳鼠心肌细胞内游离钙浓度
([ Ca2+] i)增高的影响 ,初步分析该药心脏效应的作用原理。方法　利用钙荧光指示剂 Fura-2/ AM 负载的培养乳
鼠心肌细胞 ,动态地观察在 ISOC 存在下 ,由 NA和高钾所增加的[ Ca2+] i改变。结果　ISOC 对培养乳鼠心肌细胞
的静息[ Ca2+] i无影响 , 其在 10-5和 3×10-5mol/ L时也不显著抑制高钾所致心肌细胞[ Ca2+] i的增高 , 但能降低由
NA所升高的心肌细胞[ Ca2+] i。结论　ISOC 抑制由受体中介的心肌细胞[ Ca2+] i的增高。
[ 关键词] 　异紫堇啡碱;乳鼠心肌细胞;去甲肾上腺素;高钾;细胞内游离钙
[ 中图分类号] R331　[ 文献标识码] A　　　[ 文章编号] 1000-2715(2002)02-0097-03
The effects of Isocorydine on the cytosolic free Ca2+ level in the newborn
rat heart cells
HUANG Xie-nan , WU Qing , LEI Kai-jian , SHI Jing-shan
(Department of Pharmacology , Zunyi Medical College , Guizhou Zunyi , 563003 China)
[ Abstract] 　Objective　To analy se the antiarrhy thmic mechanism(s)of isoco rydine(I SOC), its effects on the increasing
of the cy to solic free Ca2+ level([ Ca2+] i)induced by noradrenaline(NA)and high potassium in the cultural new born rat
bear t cells w ere investigated.Methods　The changes of the [ Ca2+] i increased by NA and high potassium in the presence
of ISOC were determined , using fura-2/AM laoded cultural bear t cells of the new born rat.Results　ISOC at 10-5 and 3
×10-5 mol / L-1 had no effect on the basic [ Ca2+] i and the [ Ca2+] i increased by high po tassium , bnt it inbibited the
[ Ca2+] i increased by NA significantly.Conclusions　ISOC inhibited the receptor-mediated increasing of [ Ca2+] i in the
heart cells , and it may be partly relate to its antiarrhy thmic effects.
[ Key Words] 　I soco rydine;new born rat beart cell;noradrenaline;high potassium;cy tosolic free [ Ca2+] i
　　异紫堇啡碱(Isocorydine , ISOC)对心血管系统
具有较广泛的作用[ 1] 。我们的研究表明 ,该药的扩
血管效应可能与其抑制血管平滑肌细胞由受体中介
的钙释放和钙内流有关[ 2 ,3] 。该药还能对抗多种动
物模型的实验性心律失常 ,并具有减慢心率等心脏效
应[ 4 ,5] ,但其心脏作用的原理尚不清楚。本研究采用
钙荧光指示剂 Fura-2/AM 负载的培养乳鼠心肌细
胞 ,直接观察 ISOC对 NA和高钾所升高的心肌细胞
[ Ca2+] i的影响 ,初步分析其心脏效应的原理。
1　材料
[ 收稿日期] 2002-01-10;[修回日期] :2002-4-15
[ 基金项目] 贵州省科技厅基金(黔计字 94-3033)
[ 作者简介] 黄燮南(1944—),男 , 广东省台山人 ,硕士 , 教授 ,
遵义医学院院长 ,曾两次到日本作访问学者 , 研究方向:心血
管药理。
1.1　药品与试剂　ISOC 由陕西省澄县人民医院连
秀峰老师提供;Fura-2/AM 、EGTA 、维拉帕米 、去甲
肾上腺素(NA)均为 Sigma 公司产品;小牛血清购自
上海第二医科大学实验中心;DMEM 为美国 Gibco-
BRL公司产品 。D-Hank s 的成分(mmol/L)为:
NaCl 137.0 , KCl 5.0 , Na2HPO4 0.6 , KH2PO4 0.4 ,
NaHCO3 3.0 ,Glucose 5.6。PH7.30 ～ 7.40。
1.2　仪器　RF -5000型荧光分光光度计(日本岛
津公司);SMZ -1型控温振荡器(深圳天南海北实业
公司);TM S-101倒置显微镜(奥林巴斯公司);TH
-201 CO2 培养箱(日本)。
2　实验方法
2.1　心肌细胞培养[ 6] 　取出生后 1 ～ 4d 的 Wistar
乳鼠的心脏于盛有 D-Hank s液的平皿中 ,清洗后
将其心室肌剪成 1 ～ 3mm3 小块并移入三角烧杯内 ,
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第 25卷第 2期
2002年 4月 　　　　　
遵　义　医　学　院　学　报
ACTA ACADEM IAE MEDICINAE ZUNYI
　　　　　Vol.25 No.2　Apr.2002
加入 0.125%胰蛋白酶消化液 ,置于 37℃恒温摇床中
消化 10 ～ 15min。弃去消化液后在沉下的组织块中
重新加入胰蛋白酶消化液 ,继续消化15min后用吸管
吹打至混浊 。然后移入离心管并加入冷 DMEM(内
含 20%小牛血清)培养液终止消化 ,随即用 200目不
锈钢筛过滤。继而以 1000r/min速度离心 10min ,去
上清液后用 DMEM 培养液将沉下的细胞漂洗 2 次 ,
再加入 DMEM 培养液使细胞混匀悬浮 ,调细胞密度
至 1.5 ～ 3×106 个/ml ,分装于培养瓶内置 37℃、5%
CO2+95%O2 的二氧化碳培养箱中培养 。细胞培养
18 ～ 30h 开始贴壁生长 , 48h 后可见细胞出现自发博
动 ,此时可用于实验 。
2.2　心肌细胞悬液制备　在培养好的心肌细胞中加
入 0.06%胰蛋白酶消化液 ,使之分散成单个细胞 ,然
后以 1000r/min的速度离心 10min ,弃上清液后加入
BSA -Hank s 液(mmol/L:NaCl 130 , KCL 5.0 ,
CaCl2 1.30 , MgCl2 0.5 ,Na2HPO4 0.6 ,KH2PO4 0.5 ,
NaHCO3 3.0 , Glucose 5.6 ,PH7.20-7.30),制成细
胞悬液 。调细胞密度至 1.5 ～ 3×106 个/ml ,经台盼
兰染色 ,如成活率在 90%以上 ,则可用于负载。
2.3　心肌细胞负载和荧光测定[ 7] 　在上述细胞悬
液中加入 5μmol/L 的 Fura-2/AM ,恒温(37℃)避光
振摇(40次/min)50min ,离心并弃去上清液 ,再用含
2g/L BSA-Hank s液冲洗 2次以防止胞内 Fura-
2/AM 外排。最后用 Hank s液重新悬浮 ,调细胞数
为106个/ml用于荧光测定 。荧光分光光度计的发
射波长为 500nm ,激发发射光栅为 5nm 和 10nm ,先
以激发波长 300 ～ 400nm 连续测定荧光强度 , 如在
340nm 处见荧光强峰 ,则表明Fura-2/AM 己负载入
细胞 ,然后以 340nm 作为激发波长观察不同状态下
荧光强度的变化 。
2.4　心肌细胞[ Ca2+] i 的计算[ 7] 　按公式:[ Ca2+] i
=Kd×(F-Fmin)/(Fmax -F)计算。式中 Kd为Fura
-2与 Ca2+结合反应的解离常数(224nmol/L);F 为
在某因素影响下测得的荧光强度;Fmax 是加入
Tri tionx-100(终浓度为 0.98g/L)测得的最大荧光
值;Fmin为加入 EGTA(终浓度 5mmol/L)后测得的最
小荧光值 。
2.5　统计处理　结果以 x ±s表示 ,显著性检验用
S tudents t检验 。
3　结果
3.1　ISOC 对心肌静息[ Ca2+] i 的影响　在本实验
条件下 ,测得心肌细胞的静息[ Ca2+] i为 154.3±14.
2nmol/L , 加入 ISOC 10-5 、5 ×10-5和 10-4 mol/L
后 , [ Ca2+] i 分别为 153.0 ±7.3 , 148.2 ±13.2 和
150.1±11.5nmol/L。给药前后的[ Ca2+] i 值无显著
差异(P>0.05),表明 ISOC对心肌细胞静息[ Ca2+] i
无影响。
3.2　ISOC 对高钾所致心肌细胞[ Ca2+] i 增高的影
响　加入 KCl 50mmol/L 使心肌细胞[ Ca2+] i明显增
高。钙拮抗剂维拉帕米 10-6mol/L 使高钾所升高的
[ Ca2+] i 明显下降(P <0.05),而 ISOC 10-5 、3 ×
10
-5和 10-4mol/L 对 KCl(50mmol/L)的作用无影响
(P>0.05)(见表 1)。
　　表 1　ISOC 对高钾所致心肌细胞[ Ca2+] i 增高的影响
组别 剂量(mol/ L)
　　静息　　　　KCl 50mmol/ L　
　[ Ca2+] i　(nmol/ L)　
对照组 - 154.2±13.0 305.6±34.0
ISOC 10-5 148.2±13.2 302.5±50.3
ISOC 3×10-5 150.1±11.5 254.0±54.5
ISOC 10-4 150.5±11.8 257.8±54.1
VerΔ 10-6 155.3±13.2 203.2±31.2＊
　　n=6 , Δ:维拉帕米;＊:与对照组比较 P<0.05
3.3　ISOC对 NA所致心肌细胞[ Ca2+] i增高的影响
　加入 NA10-6mol/L 使心肌细胞[ Ca2+] i 明显增高
(P <0.05)。 ISOC 10-5 mol/L 对 NA 所增高的
[ Ca2+] i无明显影响 ,但该药的浓度增大到 3×10-5
和 10-4mol/L 时 ,可显著降低 NA的作用(P<0.05)
(见表 2)。
　　表 2　ISOC对 NA 所引起的心肌细胞[ Ca2+] i增高的影
响
组别 剂量(mol/ L)
　　静息　　　　NA 10-6mol/ L　
　[ Ca2+] i　(nmol/ L)　
对照组 154.0±14.2 283.4±41.
ISOC 10
-5 153.0±13.8 244.5±23.1
ISOC 3×10-5 154.2±13.2 210.5±37.2＊
ISOC 10
-4 148.5±12.7 219.0±38.2＊
　　n=6 , ＊:与对照组比较 P <0.05
3　讨论
本研究采用钙荧光指示剂 Fura-2/AM 负载的
乳鼠培养心肌细胞 ,直接地观察 ISOC 对[ Ca2+] i的
影响。结果表明 , ISOC 对心肌细胞静息的[ Ca2+] i
和高钾所升高的[ Ca2+] i均无作用 ,而较明显地降低
由 NA 所升高的[ Ca2+] i水平 。该结果与我们在家兔
主动脉条实验[ 2]和用 Fura-2/AM 负载的血管平滑
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　　　　　　　　　　　　　遵　义　医　学　院　学　报　　　　　　　　　　　25卷
肌细胞实验[ 3]的结果完全一致 。由此可见 , ISOC 对
电压依赖性钙通道似无阻滞作用 ,而可能通过抑制受
体中介的 Ca2+内流和/或 Ca2+释放而影响 NA 升高
心肌细胞[ Ca2+] i的作用。
有报道表明 , ISOC 能对抗多种动物模型的实验
性心律失常 ,并能减慢心律[ 4 ,5] 。本研究虽不能完全
阐明该药抗心律失常的机理 ,但从实验结果来看 ,该
药至少部分地通过对抗交感神经过度兴奋而发挥其
抗心律失常和减慢心率作用。
[参考文献]
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常作用[ J] .中国药理学报 , 1986 , 7(2):131 ～ 134.
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常的作用[ J] .云南中医杂志 , 1990 , 11(4):37-38.
[ 6] 　Harary l , Farley B.I n vitro studies of single isolated beat-
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[ 7] 　Gryinkieneicz K , Poenie M , Tsien Ry.A new generation
of Ca2+ indicato rs with greatly improved fluo rescence
properties[ J] .J Biol chem.1985 , 260:3340.
[ 责任编辑:万启惠]
妊娠晚期输卵管系膜静脉破裂腹腔出血一例
李文敏 ,刘晓琴
(四川省成都市第六人民医院 妇产科 , 四川 成都　630051)
1　病例资料
患者 , 23a ,因停经 34+wk ,突发右下腹疼痛 6h ,
于2002年2月 28日4am 急诊以“妊娠合并急性阑尾
炎”收入外科 ,病员末次月经 2001年 6月 29日 、预产
期2002年 4月 6日 ,孕期定期在当地医院行产前检
查无异常 ,入院前 6h ,无明显诱因突感右下腹持续性
胀痛 ,伴呕吐 ,乏力 ,无肛门坠胀感 。既往体健 ,查体:
T36.6℃,P112次/min , R20次/min ,BP11.66/8.0kPa(110/
60mmHg),痛苦面容 ,自动体位 ,心肺正常 ,腹部膨隆 ,
肝脾肋下未扪及 ,宫底剑下 3横指 ,无宫缩 ,右下腹压
痛 ,反跳痛及肌紧张 ,移动性浊音可疑 ,肠鸣音正常。
急诊在持硬麻下以麦氏切口行阑尾切除术 ,术中见:
腹腔积血及血块 2300ml ,遂请我科手术台上会诊 ,延
长原切口探查:子宫约 8+mo 孕大 ,右侧输卵管系膜
近宫角处一怒张静脉有约 0.3cm 长破口 ,活动出血 ,
阑尾无充血水肿 ,行静脉破裂处缝扎术 , 术中输血
800ml ,术后转入我科给予抗感染 , 抑制宫缩治疗 ,
2wk后痊愈出院。
2　讨论
2.1　妊娠期输卵管系膜静脉破裂而引起严重腹腔积
血极为少见 ,该病员可能因仰卧位致子宫压迫下腔静
脉 ,使盆腔血液回流受阻 ,输卵管系膜静脉压力升高
而引起破裂出血。
2.2　该病员入院后未作盆腔 B 超 、腹部 B 超 、血常
规等检查 ,因而未发现盆腹腔积血 ,血色素下降而被
误诊“急性阑尾炎” 。
2.3　妊娠晚期合并急性阑尾炎应取高于麦氏点相当
于宫体上 1/3处右侧腹直肌旁切口 ,而该病员切口选
择错误至手术延长切口探查时较为困难。
[责任编辑:王福军]
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黄燮南等·异紫堇啡碱对培养乳鼠心肌内游离钙的影响