全 文 ：异紫堇啡碱抑制血管平滑肌由受体中介的细胞内游离钙
的增高
黄燮南 ,吴　芹 ,雷开键 ,石京山
(遵义医学院 药理学教研室 ,贵州 遵义　563003)
[ 摘　要] 　目的　观察扩血管药异紫堇啡碱(ISOC)对去甲肾上腺素(NA)和高钾所致血管平滑肌细胞内游离钙
浓度([ Ca2+] i)增高的影响 , 分析该药扩血管作用的原理。方法　利用钙荧光指示剂 Fura-2/ AM 负载的家兔血
管平滑肌培养细胞 ,动态地观察在 ISOC 存在下 , 由 NA 和高钾所增加的[ Ca2+] i 的改变 , 分析 IS OC 对 NA 和高
钾所致钙内流和/或钙释放的影响。结果　 ISOC 对血管平滑肌静息[ Ca2+] i 无影响 , 该药在 10-5和 5 ×10-5
mol/ L 时对高钾所致[ Ca2+] i 的增高也无明显抑制 , 但能明显抑制 NA 所致细胞[ Ca2+] i 的增高。结论　 ISOC
抑制由受体中介的血管平滑肌[ Ca2+] i 的增高。
[ 关键词] 　异紫堇啡碱;血管平滑肌细胞;去甲肾上腺素;高钾;细胞内游离钙
[ 中图分类号] R 965.2　[ 文献标识码] A　　　[ 文章编号] 1000-2715(2002)01-0001-03
Isocorydine inhibited the receptor-mediated increasing of the cytosolic free
Ca2+ level in the blood vessel smooth muscle cells
HUANG Xie-nan , WU Qing , LEI kai-jian , SHI Jing-shan
(Department of Pharmacology , Zunyi Medical College , Guizhou Zunyi 563003 , China)
[ Abstract] 　Objective　To analy se the vasodilative mechanism(s)of isocorydine(ISOC), its effects on the increasing of
the cy toso lic free Ca2+ level([ Ca2+] i)induced by no radrenaline(NA)and high potassium in the blood vessel smooth
muscle cells were investig ated.Methods　The changes of the [ Ca2+] i increased by NA and high potassium in the presence
of ISOC were determined , using fura-2/ AM -loaded cells of the blood vessel smoo th muscle of the rabbit.Results　
ISOC a t 10μmol.L-1 and 50μmol.L -1 had no effect on the basic [ Ca2+] i and the [ Ca2+] i increased by high po tassium ,
but inhibited the [ Ca2+] i increased by NA significantly.Conclusions　I SOC inhibited the receptor-mediated increasing
of [ Ca2+] i in the blood vessel smoo th muscle cells.
[ Key words] 　Isocorydine;blood vessel smooth muscle cell;no radrenaline;high po tassium;cy tosolic free Ca2+
　　异紫堇啡碱(Isocorydine , ISOC)具有解除内脏
和血管平滑肌痉挛的作用[ 1 ,2] 。在兔的胸主动脉螺
旋条 , ISOC 对去甲肾上腺素(Noradrenaline , NA)缩
血管的量效曲线呈非竞争性抑制作用 ,而对高钾的作
用则不明显。采用间接方法的初步研究表明 , ISOC
可能抑制受体中介的钙释放和钙内流[ 3] 。本文采用
钙荧光指示剂 Fura-2/AM 负载的兔主动脉平滑肌
培养细胞 ,直接地观察 ISOC对 NA和高钾增高细胞
[ 收稿日期] 2002-01-20;[修回日期] 2002-02-05
[ 基金项目] 贵州省自然科学基金资助项目(No:(94)-3033)。
[ 作者简介] 黄燮南(1944—),男 , 广东省台山人 ,教授 , 硕士 ,
两次赴日本作访问学者 ,遵义医学院院长。 研究方向:心血管
药理学。
内游离钙([ Ca2+] i)作用的影响 。
1　材料
1.1　动物　家兔(1.2 ～ 1.5kg), ♀♂兼用 ,由本院实
验动物中心提供。
1.2　药品与试剂　ISOC 由陕西省澄县人民医院连
秀峰老师提供;Fura-2/AM 、Eg tazic acid(EGTA)、
维拉帕米 、NA 均为 Sigma 公司产品;胰蛋白酶购自
上海华美生物公司;DMEM 为美国 Gibco -BRL 公
司产品;小牛血清由上海第二医科大学科技实验中心
提供;Hank s液的成分是(mmol/L):NaCl　137.0 ,
KCl　5.0 , CaCl2 　1.25 , MgSO4 ·7H2O 　0.8 ,
Na2HPO4 　0.6 , KH2PO4 　0.4 , NaHCO3 　3 .0 ,
Glucose　5.6 ,PH　7.35 ～ 7.45。
·1·
第 25卷第 1期
2002年 2月 　　　　　
遵　义　医　学　院　学　报
ACTA ACADEM IAE MEDICINAE ZUNYI
　　　　　Vol.25 No.1　Feb.2002
1.3　仪器　RF -5000型荧光分光光度计(日本岛
津公司);SMZ-1型控温振荡器(深圳天南海北实业
公司);TMS -1015 倒置显微镜(日本奥林巴斯公
司);TH -201CO2培养箱(日本)。
2　方法
2.1　兔主动脉平滑肌细胞的培养　原代培养参考夏
人仪等[ 4]采用的组织块贴壁法 ,培养液为含 20%小
牛血清的 DMEM 培养液。将家兔击昏后放血处死 ,
在无菌条件下取出胸主动脉 ,用 Hank s液冲洗 2 ～ 3
次去除血污 ,剪除外膜结缔组织 ,纵行切开血管 ,并用
棉签轻轻擦除内膜 ,剪成 1 ～ 2mm3 的均一组织块 ,接
种于培养瓶底部 。加入培养液 ,置于 37℃,95%O2+
5%CO2 培养箱中 ,使瓶底朝上 ,3 ～ 4h后轻轻翻转培
养瓶 ,使组织块浸泡在培养液中静止培养。每隔 3d
换液 1次 ,约经 15 ～ 20d后可在倒置显微镜下观察到
细胞生长繁殖连成片状 ,待成单层生长呈典型“峰” 、
“谷”样时即可取细胞用于实验 。
2.2　血管平滑肌细胞悬液的制备　待培养瓶内的细
胞呈单层状生长后 ,弃去培养液 ,加入 0.06%胰蛋白
酶消化液 ,当在倒置显微镜下看见细胞回缩间隙出现
时 ,即倒去消化液 ,加入 DMEM 培养液终止消化 ,并
用吸管轻轻吹打使之分散成单个细胞 ,再以 1000r/
min的速度离心 5min ,然后用含 20%小牛血清的
Hank s液使细胞悬浮混匀 ,并调整细胞数为 109 个/
L。最后用台盼兰染色 ,细胞的存活率达 90%以上 ,
即可用于 Fura-2/AM 负载。
2.3　Fura-2/AM 在血管平滑肌细胞的负载　将上
述细胞悬液置于控温振荡器中 , 加入 Fura -2/AM
3μmol/ L ,振荡 45min , 使 Fura-2/AM 进入细胞 ,然
后取出冷却 。用离心法除去上清液中的 Fura-2/
AM ,再按同法用 20%小牛血清 Hank s液充分冲洗
2次后 ,重新用 Hank s 液悬浮并稀释细胞数为 109
个/ L 待用。
2.4　荧光测定及血管平滑肌内[ Ca2+] i的计算[ 5] 　
采用 RF -500型荧光分光光度计测定荧光强度的变
化。激发波长为 340 ～ 380nm ,发射波长为 480 ～
500nm ,发射光栅为 5nm 和 10nm 。测定温度 37℃。
先用 300 ～ 400nm激发波长扫描观察负载情况 ,然后
观察细胞静息状态和药物存在时的荧光强度。按下
式计算[ Ca2+] i:
[ Ca2+] i=Kd×(F-Fmin)/(Fmax -F)×(SF/Sb2)
式中 Kd为 224 nmol/ L , F 是实验观察到的荧光
比值(F340/380nm), Fmax为加入 0.1%T ritonx -100
时细胞悬液的荧光比值 , Fmin为加入 5 mmol/L
EGTA后测得的荧光比值 , SF2/Sb2 为 Fura-2/AM
在无 Ca2+及有 Ca2+结合达饱和状态下 ,在 380nm 处
的荧光强度。
2.5　统计处理　结果用 x ±s 表示 ,显著性检验用
Students检验。
3　结果
3.1　ISOC对高 K+(50 mmol/ L)所致血管平滑肌细
胞[Ca2+] i增高的影响 , 在本实验条件下 , ISOC 10-6
mol/L 对细胞静息情况下的[ Ca2+] i无显著影响;加
入 KCl 50 mmol/L 使[Ca2+] i明显升高 ,钙拮抗剂维
拉帕米 10-6mol/L 使由 KCl增高的[ Ca2+] i明显降
低(P <0.05)。而 ISOC 10-6 、10-5和 5×10-5mol/L
对 KCl的作用均无明显影响(P>0.05)(表 1)。
　　表 1　ISOC 对高钾(50mmol/ L)所致血管平滑肌[ Ca2+] i
增高的影响
组别 剂量(mol/ L)
静息
[ Ca2+] i KCl mmol/ L(nmol/ L)
对照组 - 202.3±52.2 297.5±40.7
ISOC 10-6 203.1±52.4 265.2±40.8
ISOC 10-5 202.8±52.0 259.4±43.7
ISOC 5×10-5 201.4±51.5 245.8±47.2
VerΔ 10-6 202.5±51.5 215.2±28.3＊
　　n=6 , ■=维拉帕米;＊与对照组比较 P<0.05
3.2　ISOC 对 NA(10-6mol/ L)所致细胞[ Ca2+] i增
高的影响　加入 NA 10-6mol/L 使血管平滑肌细胞
的[Ca2+] i明显升高 。 ISOC 10-6mol/L 对由 NA 所
增高的[ Ca2+] i无明显影响(P >0.05),但该药的浓
度增大到 10-5和 5×10-5mol/L 时 ,可明显降低 NA
的作用(P <0.05)(表 2)。
　　表 2　ISOC 对 NA 所致血管平滑肌[ Ca2+] i增高的影响
组别 剂量(mol/ L)
静息
[ Ca2+] i
KCl
(mol/ L)
对照组 - 192.8±30.2 278.2±47.6
ISOC 10-6 192.5±30.3 231.6±34.1
ISOC 10-5 191.5±31.3 184.4±40.8＊
ISOC 5×10-5 191.5±30.3 171.2±40.2＊
　　　n=6　＊与对照组比较 P<0.05
4　讨论
用钙荧光指示剂 Fura-2/AM 负载的细胞测定
[ Ca2+] i是一种较为直接的 ,且能动态地观察[ Ca2+] i
变化的方法。本研究的结果表明 , ISOC 能抑制由
·2·
　　　　　　　　　　　　　遵　义　医　学　院　学　报　　　　　　　　　　　25卷
NA所致血管平滑肌[ Ca2+] i 的增高 ,而对高钾(50
mmol/L)升高[Ca2+] i的作用无明显影响。这与我们
以前在家兔主动脉螺旋条实验研究的结果相一致。
该研究发现 , ISOC 能使 NA 缩血管的量效曲线呈非
平行右移 ,最大反应压低 ,而对高钾的量效曲线无明
显影响[ 3] 。一般认为 , NA 的缩血管效应是细胞外
Ca
2+通过受体操纵性钙通道内流和激发细胞内 Ca2+
的释放所致 ,而高钾的缩血管作用则是细胞外 Ca2+
经电压依赖性钙通道内流的结果。因此 ,可以认为 ,
ISOC 对电压依赖性钙通道并无明显阻滞作用。另一
方面 , ISOC对 NA量效曲线的抑制是呈非竞争性的 ,
故该药也不是一个典型α受体阻断剂 ,其对 NA所致
血管平滑肌[ Ca2+] i升高的抑制作用可能是通过影
响受体后某个环节而实现的。
我们采用 Fura-2/AM 负载的大鼠主动脉螺旋
条的研究发现 ,α-受体激动剂(苯肾上腺素)引起血
管平滑肌[Ca2+] i的增高是其引起 Ca2+内流和 Ca2+
释放的共同结果[ 6] 。本实验虽未能将 NA所致 Ca2+
内流和Ca2+释放分开来研究 ,但采用血管螺旋条机
械收缩法的实验表明 , ISOC 对 NA所致 Ca2+内流和
Ca
2+释放均可能有抑制作用[ 7] 。因此 , 本次测得
ISOC 对 NA 所致[ Ca2+] i升高的抑制作用也可能是
其对受体中介的 Ca2+内流和 Ca2+释放抑制的共同
结果 。
结合本实验结果与我们另一份关于 ISOC 对环
核苷酸生成影响的研究[ 7] , 似可认为 , ISOC 促进
cGMP 的生成及其对受体中介的[ Ca2+] i 升高的抑
制 ,构成其扩血管作用的主要原理 。
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