全 文 ：　＊收稿日期:2002-11-29;修回日期:2003-05-16
作者简介:赵　昕(1970-),女 ,浙江人 ,主治医师 , 讲师 ,医学博
士在读 ,从事循环内科临床和基础研究。
脱氢紫堇碱对正常和低氧豚鼠心肌细胞内钙的影响＊
赵　昕1 , 汤　浩1 , 王亚杰2 , 于　昕3 , 刘　莹2 , 张　杰2 , 秦　嘉1 , 郭善芬4
(1.中国医科大学基础医学院生理教研室 , 2.基础医学院生物化学教研室 ,辽宁 沈阳 110001;
3.附属第二医院妇产科 ,辽宁沈阳 110003;4.阜新市中心医院循环科 ,辽宁 阜新 123000)
摘要 目的:探讨脱氢紫堇碱(dehydeocorydaline, DHC)及维拉帕米(verapamil , Ver)对豚鼠心肌细胞内游离钙浓度
([ Ca2+] i)变化的影响。方法:采用离体豚鼠心脏 Langendorff 法灌注 , 用荧光指示剂方法(Fure-2/AM)标记心肌
([ Ca2+] i)变化。观察低氧后心肌[ Ca2+] i 的变化。 结果:①正常氧状态心肌[ Ca2+] i 均值为(120.5±8.3)nmol/ L
(n=20);②正常氧条件下 , DHC 、Ver均使心肌[ Ca2+] i 明显下降。(3)低氧状态下 ,心肌[ Ca2+] i 增加与缺氧时间
(程度)直线相关(r=0.98)。 ④DHC 对低氧后心肌[ Ca2+] i 增加明显减缓。结论:DHC 在正常氧 、低氧条件下阻止
心肌细胞内钙超载 ,我们认为 DHC 可能提高心肌细胞的自我保护作用。
关键词:　脱氢紫堇碱 DHC;　维拉帕米;　心肌细胞内游离钙;　心肌低氧
中图分类号:Q46 文献标识码:A 文章编号:1000-6834(2003)03-0222-04
　　心肌缺氧所致心肌损伤的发生机制尚未完全阐
明。近年来 ,逐渐发现钙离子(Ca2+)与心肌细胞低
氧损伤密切相关 ,应用钙通道阻断剂可明显减轻心
肌细胞损伤 ,降低梗塞面积 ,说明心肌细胞内钙超载
在心肌细胞低氧损伤中起重要作用[ 1] 。而 DHC 是
从罂粟科植物延胡索块中提取的一种季胺类生物碱
单体有效成分之一[ 2] ,近年研究发现 DHC 具有提
高小鼠的耐低氧能力 ,并有抗心律失常 ,扩张冠状动
脉 ,及缓解冠状动脉痉挛[ 3]等作用 。为了从细胞分
子水平阐明 DHC 对改善心肌低氧所致心肌损伤的
药理机制 ,本实验采用免疫荧光指示剂方法研究
DHC 对心肌细胞内游离钙浓度[ Ca2+] i的影响 ,为
临床开发应用 DHC药物提供实验依据。
1　材料与方法
1.1　药物
维拉帕米(verapamil , Ver)、Fura-II/AM(C24H47
O2N3 ,分子量 =1001.86)、胶原酶(I 型)、T riton-
100 、乙二醇四乙酸酯(EG TA)、羟乙基哌嗪乙磺酸
(HEPES)、二甲基亚枫(DMSO)均为美国 Sigma 公
司产品。DHC-由天津药物所提供。
1.2　心肌细胞的分离
参考 Pow ell Farmmer 并略加改动 。选用二月
龄豚鼠 20只(体重为 350±30 g),雌雄兼用。20%
的乌拉坦(5 m l/kg)腹腔注射 ,开胸 ,迅速取出心脏 ,
立即将心脏悬于 Landendorff 装置上行恒流灌注 。
首先采用无钙液灌注 5 min ,使心脏停跳;再用酶液
消化和分离心肌细胞;接着用 KH 液 20 m l冲洗 ,将
胶原酶去除;通过 200目筛网过滤;滤液以 1 000 r/
min离心 3 min ,反复 2次;最后细胞悬浮于储存液
中 ,台盼蓝排斥试验检查 ,细胞存活率在 95%以上 ,
并调整细胞数为 2×106/ml。细胞计数及台盼蓝排
斥试验法细胞存活率计算如下:
细胞计数法:取 0.3%台盼蓝液与细胞悬液各
10 μl混均后 ,再取适量混合液滴于细胞计数板上 ,
计数 4个大格的细胞数 ,再用下述公式求出细胞数:
细胞数(ml)=(4个大格数/4)×104×2
细胞存活率计算方法 计算计数板中 4个大格
内未蓝染活细胞及细胞总数 ,则细胞存活率(%)=
活细胞数/细胞总数×100%。
1.3　心肌[ Ca2+] i的测定
将上述调整细胞数后的细胞悬液 ,加入终浓度
为 5 μmol/L 的 FuraII/AM , 37℃恒温振荡 50 min ,
以 1000 r/min 离心 3 min ,最后悬于储存液中调整
细胞数到 2×106/ml ,将悬液分数管 。在细胞外钙
含量为 2 mmol/L 情况下 ,加入 Triton-100(终浓度
为 0.5%)及 EGTA(终浓度为 8 mmol/L , pH >
8.5),采用 F-2000型荧光分光光度计进行心肌细胞
内钙含量测定 ,按照下列公式计算出[ Ca2+] i(电脑
软件自动计算):
[ Ca2+] i =Kd×(CR-Rmin)/(R-Rmax)×β
β =Fmin340/Fmax380 ,F340/F380;
Rmin=Fmin340/Fmin380 ,Rmax =Fmax340/Fmax380
1.4　实验方案
将每次分离的心肌细胞均分为 6组 ,在常氧条
件下 ,观察 100 s后 ,随机 3组分别加入营养液 10
μl、DHC 10μl(终浓度:0.05 mmol/ L)、Ver 10μl(终
222 Chin J Appl Physiol 2003;19(3)
DOI :10.13459/j.cnki.cjap.2003.03.005
浓度:20 mol/ L)观察 500 s。而另外 3 组在低氧条
件下(氮气:0.1 cm 3/ s)也分别给予同浓度的上述 3
种药物后 ,观察 500 s ,动态测量不同条件下各组细
胞内钙含量的变化。
1.5　统计学处理
所有结果均用均数±标准差( x ±s)表示 ,并做
组间均数 t 检验及线性相关性检验 ,并分别求出回
归方程。
2　结果
2.1　正常氧(PO2:15.9 kPa)状态下 ,心肌[ Ca2+] i
的变化
在静息(0 ～ 100 s)正常氧状态(PO2:15.9 kPa)及
控制细胞外[Ca2+] i为 2 mmo1/L(生理情况)时 ,3组
的心肌[Ca2+] i无显著差异(P>0.05),故知 3组的组
间一致性较好 , 具有可比性。本法分离豚鼠心肌
[ Ca2+] i的总均值为(120.5±8.3)nmol/L(表1)。
DHC 组心肌[ Ca2+] i 与对照组比较差异显著
(P<0.05)。而 Ver组与对照组比较 ,心肌[ Ca2+] i
也明显下降 , 差异显著(P <0.001)。说明 DHC 、
Ver使正常氧状态心肌[ Ca2+] i 都明显下降 , 但
DHC 作用稍弱于 Ver(表 1)。
2.2　低氧状态的心肌[ Ca2+] i的变化
当纵坐标心肌[ Ca2+] i取自然对数时 ,三组的
心肌[ Ca2+] i与低氧时间(程度)成直线相关 ,相关
性良好 ,相关系数 r 分别为 0.9836 、0.9819 、0.9562
(表 2)。
DHC组低氧后心肌[ Ca2+] i 增加较对照组缓
慢 ,各值与对照组相比差异显著(P<0.05)(表 2)。
Tab.1 Intracellular free calcium concentra tion([ Ca2+] i)changes of myocardial cell on different
time(degree)of normoxia sta te(nmol/ L , x±s , n=20)
Group
Before administ ration
0(120) 100(120)
After administ rat ion
100(120) 200(120) 300(120) 400(120) 500(120)
Cont rol 　122.7±8.7 　115.8±13.1 　126.4±8.1 　124.1±9.9 　117.1±12.2 　116.3±18.5 　111.9±15.9
DHC 120.7±7.3 113.4±10.4 110.5＊＊±14.3 93.6＊±14.7 82.4＊＊±16.1 64.1＊＊±21.5 40.7＊＊±11.9
Ver 118.2±4.6 108.5±8.1 102.8＊＊±10.7 88.5＊＊±17.4 72.2＊＊±11.9 # 50.1＊＊±7.5# 22.0＊＊±15.6#
　　DHC:Dehydeocorydaline group;Ver:Verapamil group;Value of sign of agg regation:partial pressure of oxygen(mmHg , 1 mmHg=0.133 kPa)
＊＊P <0.01 vs con trol;#P<0.05 vs DHC
Tab.2 Intracellular free calcium concentra tion([ Ca2+] i)changes of myocardial cell on different
time(degree)of hypox ic condition(nmol/ L , x±s , n=20)
Group
Before administ ration
under normoxia
0(120) 100(120)
After administ rat ion under hypoxia
100(120) 200(120) 300(120) 400(120) 500(120)
Cont rol 　121.3±5.1 　132.9±11.8 206.7±28.8 330.5±14.9 406.1±21.2 538.1±20.2 755.9±36.0
DHC 119.4±13.4 127.1±9.4 161.0＊＊±19.6 219.9＊＊±20.2 307.5＊＊±15.4 419.2＊＊±14.0 472.5＊＊±21.1
Ver 117.7±5.2 110.9±8.6 107.9＊＊±18.6## 143.7＊＊±19.3##206.3＊ ±14.8##269.0＊＊±19.5## 300.8＊＊±23.2##
　　DHC:Dehydeocorydaline group;Ver:Verapamil group;Value of sign of agg regation:partial pressure of oxygen(mmHg , 1 mmHg=0.133 kPa)
＊＊P <0.01 vs con trol;##　P<0.01 vs DHC
　　Ver 组心肌[ Ca2+] i在低氧后与对照组比较增
加更少 ,且降低速率较 DHC 组增加 ,差异非常显著
(P<0.001)(表 2)。
对照组在低氧 400 ～ 500 s时 ,心肌[ Ca2+] i 增
加有较大的越迁 ,显示缺氧时心肌[ Ca2+] i升高的
时相变化特点(图 1)。
DHC 组在 400 ～ 500 s时 ,心肌[ Ca2+] i 增加幅
度最小 ,表明DHC对此时段的缺氧心肌细胞钙阻滞
作用最大。而在低氧 300 ～ 400 s时 ,心肌[ Ca2+] i
增加幅度最大 ,说明 DHC 对此时段缺氧心肌细胞钙
阻滞作用最小(图 1)。
3　讨论
文献报道 ,常用测定心肌细胞内钙方法有 3种:
Kusuoka等利用 NMR 直接测定活体心肌[ Ca2+] i
的水平。Carrozza[ 6] 等利用“结钙发光蛋白”(ae-
quorin)技术 ,也得到类似的结果。Gao[ 4] 等运用荧
光指示剂“Fure-2”直接测定细胞内游离钙技术 ,因
Fura-2/AM 与钙结合后有很高的荧光强度(比
Quin-2 强 30 倍),具有更大优越性 。因此 ,本实验
采用后种测定方法 。
目前已有许多实验从不同角度提出心肌细胞缺
223中国应用生理学杂志 2003;19(3)
血 、低氧后 [ Ca2+] i 增加[ 1 ,7] ,认为低氧引起心肌
[Ca2+] i增加的原因有:缺氧后 ,细胞内 ATP/ADP
比值和 pH值均下降 ,从而激活磷脂酶 ,细胞外钙内
流;缺氧造成线粒体功能障碍 ,并且缺氧也可引起氧
自由基产生增多 ,从而抑制肌膜及肌浆网膜钙摄取;
缺氧引起细胞内酸中毒 , 降低钙依赖性 Na+-K+
ATP 酶活性 ,因而细胞内 Na+-H+交换增加 , 可继
发性激活Na+-Ca2+交换 ,最终造成内质网的钙外流
量增加 ,而导致细胞内游离钙过量;缺氧也可以降低
Ca2+-Mg2+ATPase酶的作用 ,最终导致[ Ca2+] i 增
加。因此准确测定[Ca2+] i对于了解 Ca2+在心肌细
胞的调控作用及研究药物机制具有重要意义 。
Fig.1 Intracellular free calcium concentration ([ Ca2+] i)
changes o f myocardial cell on different time (degree) of
normoxia state or hypoxia
本实验结果也证实低氧本身对心肌[ Ca2+] i 影
响很大 。本文又观察到在低氧 500 s的整个过程中
发现心肌[ Ca2+] i 的升高呈明显时相性变化 , 在低
氧 400 ～ 500 s ,心肌[ Ca2+] i增加具有较大的越迁 。
Randall[ 8]等用 Ca2+指示剂 indo-1 也观察到了谷氨
酸引起培养神经细胞[ Ca2+] i 升高有时相性变化 ,
有关这一特征性变化的机制目前尚不十分清楚 ,有
待进一步研究。
DHC 治疗冠心病的药理研究已有报道[ 3] ,目前
临床上应用 DHC 醇浸膏治疗心绞痛 、心肌梗塞有
效;但目前临床上多见用于治疗胃溃疡 , 治疗各种
急性 、慢性炎症性疾病及抗过敏反应;治疗血栓性疾
病 ,对兔主动脉内的血栓形成起到明显抑制作用 。
而对 DHC在心血管方面的机理研究甚少 , 尤其在
分子生物学水平的研究国内 、外尚未见报道 , 为此
进行了本实验。文献报告[ 3 ,9] DHC 可对心肌缺血有
保护作用。从本实验结果来看 , DHC 100 μmol/L
可显著减少正常氧和缺氧后心肌 [ Ca2+] i , 说明
DHC 通过降低钙超载 ,从而对心肌缺血有保护作
用 。本研究还证实了其作用与经典的钙通道阻断剂
Ver作用相似。但影响程度稍弱 , Ver 对心脏的抑
制作用 ,呈负性频率 、负性传导及负性肌力作用是所
有钙拮抗剂中作用最强的。此外 ,Ver 用药剂量的
安全范围较小 ,并呈剂量依赖性 ,而且容易造成不可
逆性的 Ⅲ度房室传导阻滞 、血压过低 、心脏骤停及阿
斯综合症的发生。因此 ,在应用 Ver 时要注意药物
的剂量及静脉注射的速度 ,并要求监测血药浓度。
然而 ,本实验结果表明 , DHC对缺氧后心肌[ Ca2+] i
升高速率较 Ver组相对缓慢 ,并且对低氧 400 ～ 500
s的心肌[ C2+] i 降低作用最明显 ,因此 , DHC 对低
氧心肌细胞降钙作用缓和而持久 ,用药的安全性较
好 ,对心脏的自律性及传导性影响小 。因此认为
DHC可能是一种更安全 、更有效的心肌缺血的保护
剂 。
目前 ,关于 DHC 对心血管系统作用机理 ,尚不是十
分清楚 ,本实验应用荧光指示剂 Fura-I I技术 ,证实
DHC 对心肌[ Ca2+] i 的有降低作用 ,这将为临床开
发应用DHC 提供了药理机制 ,并为研究中药来源的
心肌缺血保护剂提供了有力证据 。
4　参考文献
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THE INFLUENCEOF DEHYDEOCORYDALINE ON INTRACELLULAR
FREE CALCIUM CONCENTRATION DURING HYPOXIA IN
MYOCARDIAL CELL OF GUINEA-PIGS
ZHAO Xin1 , TANG Hao1 , WANG Ya-jie2 , YU Xin3 , LIU Ying2 , ZHANG Jie2 , QIN Jia1 , GUO Shan-fen4
(1.Department of Physiology , College of Basic Medical Sciences , C hina Medical Universi ty , Shenyang 110001 , China;
2.Depart rnent of biochemistry , College of Basic Medical S ciences , China Medical University , Shenyang 110001 , China)
ABSTRACT
Aim:To Study the effect of Dehydeoco rydaline and Verapamil(Ver)on intracellular freecalcium concentration of myocardial cell
([ Ca2+] i)under hypox ic condition.Methods:We adopted guinea-pig heart Langendo rff instillation.The myocardial cells w ere iso-
la ted bycollagenase(Tyoe I , sigma)and marked by fluorescence ratio imaging.The suspension of myocardial cells w as assigned to six
g roups:DHC , Ver , and control w ere each two.Each three groups was exposed to hypoxia and normox ia befo re determination of
[ Ca2+] i.Results:①In normoxia state , [ Ca2+] i was 120.5-8.3 nml/L(n=20).②In hypoxia state , the increased [ Ca2+] i of my-
ocardial cells w as proportional to the time(deg ree)of hypoxia.Correlation coefficient(r)was about 0.98.(3)Under the condition of
normoxia DHC and Ver decreased [ Ca2+] i.(4)DHC was obviously slow the increase of [ Ca2+] i after hypoxia.Conclusion:I n nor-
moxia and hypoxia , DHC decreases the increased [ Ca2+] i.I t can prevent intracellular calcium overload.We believ e DHC may im-
prove self-protected perfo rmance of myocardial cells.
　　KEY WORDS:　Dehydeocorydaline;　Verapamil;　in tracellular f ree calcium;　hypoxia
人绒毛膜促性腺激素对绒癌细胞系 T IMP表达的影响＊
庞战军 , 邢福祺
(南方医院妇产科 ,广东广州 510515)
摘要 目的:研究人绒毛膜促性腺激素(hCG)对滋养层细胞或绒癌细胞侵袭性的影响。方法:采用 RT-PCR方法, 观察不同浓度
hCG 对 JEG-3绒癌细胞系表达金属蛋白酶组织抑制因子 T IM P-1和 TIMP-2的影响。结果:用不同浓度 hCG 处理 48 h后 , JEG-3
细胞中 T IM P-1 mRNA 的表达略降低 ,而 TIMP-2 mRNA的表达则被诱导增加。结论:人绒毛膜促性腺激素(hCG)可能通过改变
绒癌细胞中 T IM P的表达 ,影响绒癌细胞的侵袭性。
关键词:　滋养层细胞;　绒毛膜癌;　侵袭;　人绒毛膜促性腺激素
KEY WORDS:　t rophoblast;　choriocarcinoma;　invasiveness;　human chorionic gonadot rophin
中图分类号:R730.1 文献标识码:A 文章编号:1000-6834(2003)03-0225-02
　　滋养层细胞通过表达和分泌基质金属蛋白酶(matrix met-
alloproteinase , MMP)等蛋白水解酶对子宫壁组织实施侵入 , 该
侵入过程调节失常会导致病变 ,其中滋养层细胞过度侵入是
绒癌的特征[ 1] 。人绒毛膜促性腺激素(hCG)是参与该调节的
因子之一。金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metal-
loproteinase, T IMP)可与 MMP结合, 抑制其活性 , 并因此具有
阻止滋养层细胞侵入的作用[ 2] 。为探讨 hCG 对滋养层细胞或
滋养层细胞来源的绒癌细胞侵袭力的影响, 观察了 JEG-3 绒
癌细胞系受 hCG 处理后 TIMP表达的变化。
1　材料与方法
1.1　材料
MEM 培养基购自GIBCO BRL 公司;人绒毛膜促性腺激
素(hCG)为瑞士 Serono公司产品;I I 型总 RNA 提取试剂盒
购自华美生物工程有限公司;焦碳酸二乙酯(DEPC)、矿物
油 、溴化乙锭(EB)为 Sigma公司产品;dNTPs、RNase抑制剂 、
Taq DNA 聚合酶等购自大连宝生物公司;MMLV 逆转录酶 、
o ligo(dT)12-18 购自美国 Promega公司;小牛血清购自杭州
四季青公司;其它试剂均为分析纯。绒癌细胞系 JEG-3 引自
北京中国科学院动物研究所计划生育及生殖生物学国家重
点实验室。所用引物均由上海 Sangon 公司合成 , 采用文献
报道的序列 , GAPDH:正义 CCA TGT TCG TCA TGG GTG
TGA ACC A 和反义 GCC AGT AGA GGC AGG GAT GAT
GTT C , 扩增产物 251 bp。 T IMP-1:正义 TTC CAC AGG
TCC CAC AAC 和反义CGT CCA CAA GCA ATG AGT , 扩增
产物 228 bp。 T IMP-2:正义 AAA CGA CAT TTA TGG CAA
CCC TAT C 和反义 ACA GGA GCC GTC ACT TCT CTT
GAT G , 扩增产物 405 bp。
225中国应用生理学杂志 2003;19(3)