全 文 ：·药理·
收稿日期:2014-08-08
基金项目:国家自然科学基金资助项目(81100957，81374001);湖北省自然科学基金创新群体(2013CFA014)
作者简介:杨莉(1989-)，女，硕士，主要从事中药药理学研究;Tel:0717-6397466，E-mail:breezecheery@ 163. com。
* 通讯作者:王婷，Tel:0717-6397466，E-mail:tingting0301@ 126. com。
竹节参总皂苷通过 EＲK /Nrf2 通路对 H2O2 致 SH-SY5Y
细胞氧化损伤的保护作用研究
杨 莉1，2，袁 丁1，李 靳1，张长城1，王 婷1*
(1. 三峡大学医学院，湖北 宜昌 443002;2. 宜昌市中医医院，湖北 宜昌 443002)
摘要 目的:探讨竹节参总皂苷对 H2O2 致 SH-SY5Y 细胞氧化应激损伤的保护作用及其分子机制。方法:
H2O2 作用 SH-SY5Y细胞建立氧化应激损伤模型，以不同浓度竹节参总皂苷(0. 1、1、5、20 μg /mL)预处理 12 h，再
加入 H2O2 继续培养 12 h。通过 MTT检测细胞活力;酶生化法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含
量;Western blotting检测 Nrf2、p-EＲK、p-P38 蛋白表达;Ｒeal-Time PCＲ检测 NQO1、GCLC的 mＲNA表达。结果:各浓
度竹节参均能显著提高 H2O2 所导致的细胞活力降低、提高 SOD活性、降低 MDA含量，并能上调 Nrf2、p-EＲK蛋白
及 NQO1、GCLC mＲNA表达。结论:竹节参总皂苷对 H2O2 致 SH-SY5Y细胞氧化应激损伤具有保护作用，其作用机
制可能与调控 EＲK/Nrf2 通路，从而增强抗氧化基因表达有关。
关键词 竹节参总皂苷;SH-SY5Y细胞;过氧化氢;Nrf2;EＲK
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2015)06-1225-05
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2015. 06. 030
Protective Effect of Total Saponins of Panax japonicus Against H2O2-Induced Oxidative Stress Damage
YANG Li1，2，YUAN Ding1，LI Jin1，ZHANG Chang-cheng1，WANG Ting1
(1. Medical College，China Three Gorges University，Yichang 443002，China;2. Yichang Hospital of Traditional Chinese Medicine，
Yichang 443002，China)
Abstract Objective:To investigate the protective effects of total saponins of Panax japonicus(TSPJ)on H2O2-induced oxidative
stress damage in SH-SY5Y cells，and to explore the underlying mechanism. Methods:SH-SY5Y cells were incubated with 600 μmol /L
H2O2 for 12 h，then treated with various concentrations of TSPJ(0. 1，1，5 and 20 μg /mL)for 12 h，and then incubated with 600 μmol /
L H2O2 for 12 h. Cell viability was detected by MTT assay. Superoxide dicmutase(SOD)activities and malondialdehyde(MDA)contents
were measured by biochemical assay kits. Protein levels of Nrf2，p-EＲK，and p-P38 were detected by Western blotting. Levels of NQO1
and GCLC mＲNA expression were determined by real-time PCＲ. Ｒesults:Compared with control group，H2O2 stimulated the decrease of
cell viability and SOD activities as well as the increase of MDA contents，which were reversed by TSPJ treatment. Furthermore，TSPJ
treatment up-regulated not only the decreased protein expressions of Nrf2 and p-EＲK but also the decreased mＲNA expression of NQO1
and GCLC. Conclusion:TSPJ can protect SH-SY5Y cells from H2O2-induced oxidative stress damage. The mechanism may be related to
up-regulating the phosphorylation of EＲK thereby promoting the Nrf2 nuclear translocation and increasing the mＲNA expression of an-
tioxidant genes such as NQO1 and GCLC.
Key words Total saponins of Panax japonicus;SH-SY5Y cells;H2O2;Nrf2;EＲK
神经退行性疾病是一类严重威胁人类健康的疾
病，其发生原因复杂，发病机制也尚不完全清楚，缺
乏有效的治疗手段，是医学研究领域中的一大难题。
研究发现，在神经退行性疾病中出现自由基增多等
氧化应激增强现象，因此氧化应激的增强可能是神
经退行性疾病发病的基础。竹节参 Panax japonicus
C. A. Mey. 是我国常用中药。其主要活性成分是竹
节参皂苷、人参皂苷、竹节参多糖及挥发油等。现代
研究证明，竹节参的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水
提部位均对氧化损伤具有一定的保护作用，并已证
实正丁醇部位的总皂苷成分对氧化损伤具有明显的
保护作用〔1-3〕，但竹节参总皂苷对神经细胞氧化应激
损伤的保护作用鲜见报道。基于此本文采用体外培
养 SH-SY5Y 细胞，给予 H2O2 刺激建立氧化损伤模
型，探讨竹节参总皂苷对 SH-SY5Y细胞氧化应激损
伤的保护作用与机制，为神经退行性疾病药物的研
发提供理论基础。
1 材料与仪器
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1. 1 细胞株 人神经瘤母瘤细胞(SH-SY5Y)，华
中科技大学同济医学院惠赠。
1. 2 药物与试剂 竹节参经三峡大学医学邹坤教
授鉴定为五加科人参属植物竹节参 Panax japonicus
C. A. Mey. 的干燥根茎。取竹节参干燥根茎粗粉，
加入 60%乙醇加热回流 3 次，合并滤液后浓缩干
燥，得到竹节参总提物粉末，以人参皂苷 Ｒe 为对照
品，采用香草醛-高氯酸比色法测定竹节参总皂苷的
含量为 67. 66%;双氧水(H2O2)，北京化工厂生产;
DMEM培养基，Gibico 公司;胎牛血清，杭州天杭生
物科技有限公司;胰蛋白酶，Gibico 公司;四甲基偶
氮唑盐(MTT)，Sigma 公司;超氧化物歧化酶(SOD)
试剂盒，丙二醛(MDA)试剂盒，南京建成生物工程
研究所;Western blotting Marker，美国 Invitrogen 公
司;牛血清白蛋白(BSA)、PMSF、Triton X-100、Tris、
甘氨酸、SDS，美国 Sigma 公司;p-EＲK、p-P38、P38、
TBP抗体，美国 Cell Signaling公司;Nrf2、EＲK抗体，
美国 Santa Cruz公司;Trizol、DEPC，上海生工生物工
程有限公司;NQO1、GCLC以及 GAPDH 由上海生工
生物工程有限公司合成。见表 1。
表 1 实时定量 PCＲ引物序列
引物 引物序列(5→3) 扩增产物 /bp
NQO1-F GGAAGGATGGAAGAAACGCC 192
NQO1-Ｒ TGGTTGTCAGTTGGGATGGAC
GCLC-F TCGCAAACCATCCTGACTACAAG 118
GCLC-Ｒ CCAAGTAACTCTGGGCATTCACA
GAPDH-F ACTTCAACAGCGACACCCACTC 201
GAPDH-Ｒ TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC
1. 3 主要仪器 NU-4750E 型二氧化碳培养箱购
自 Nu Aire公司;DMＲ 型多功能显微镜及图像分析
系统购自德国 Leica 公司;SW-4T-2F 洁净工作台购
自上海博讯实业有限公司医疗设备厂;KQ-500B 超
声波清洗器购自昆山市超声仪器有限公司;Prime-
Script ＲT Ｒeagent Kit With gDNA Eraser 和 SYBＲ
Premix Ex TaqTM购自大连宝生物工程有限公司。
2 方法
2. 1 细胞培养 SH-SY5Y 细胞按常规培养，
DMEM 培养基，10% 四季青胎牛血清，置于 5%
CO2，37 ℃培养箱中培养，0. 25%胰酶消化传代，选
择对数生长期细胞进行试验。
2. 2 实验分组及药物处理 实验分组为正常对照
组、模型组(H2O2 600 μmol /L)及竹节参总皂苷
0. 1、1、5、20 μg /mL 组。孵育 24 h 后，除正常对照
组及模型组外，其余各组加入相应浓度的竹节参总
皂苷，12 h后，除正常对照组外，其余加入相同浓度
的 H2O2，继续孵育 12 h，检测各项实验指标。
2. 3 MTT法检测细胞活力 取对数生长期的细胞
接种于 96 孔板中，每孔加入 200 μL细胞悬液，接种
量为 8 × 103 /孔，处理方法同“2. 2”项下，各孔同时
加入 20 μL MTT(5 g /L)，37 ℃孵育 4 h，弃上清，每
孔加入 150 μL DMSO，混匀后于酶标仪上 570 nm测
定光密度。
2. 4 酶生化法检测 SOD 活性和 MDA 含量 SOD
活性和 MDA 含量检测根据南京建成生物工程公司
试剂盒说明书进行。
2. 5 Western blotting 分析 实验分组及药物处理
同“2. 2”项下，收集细胞后，加入蛋白裂解液，冰上
吹打，4 ℃、12 000 × g离心 15 min，取上清液加入 5
× 的上样缓冲液，煮沸 10 min，电泳并转 PVDF 膜。
5%脱脂奶粉封闭 1 h 后，分别使用 p-EＲK、EＲK、p-
P38、P38 以及 TBP、Nrf2 抗体，4 ℃孵育过夜，TBST
洗 3 次，二抗室温下孵育 1 h，TBST 洗 3 次，ECL 化
学发光法显影。
2. 6 Ｒeal-time PCＲ分析 收集细胞后，加入 Trizol
试剂，再根据试剂盒说明书提取 ＲNA 并翻转成 cD-
NA，在 94 ℃预变性 30 s、94 ℃变性 5 s、退火 30 s、
72 ℃延伸 40 s，循环 40 次的条件下进行扩增。实
时定量 PCＲ 仪绘出扩增曲线图，从而进行结果分
析，根据公式 ΔΔCt =(Cttarget － Ctactin)TimeX －(Cttarget －
Ctactin)Time0，应用公式 2
－ ΔΔCt计算并分析各基因表达
的差异性。
2. 7 统计学处理 数据资料用 珋x ± s 表示，应用
SPSS 13. 0 软件进行统计学处理，各组均数之间比
较进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，以 Dun-
nett-t检验比较各组间均数的差异，以 P ＜ 0. 05 为有
统计学意义。
3 结果
3. 1 不同浓度 H2O2 对 SH-SY5Y 细胞活力的影响
结果如表 2 所示，600 μmol /L H2O2 作用 SH-
SY5Y细胞 12 h后细胞活力下降至约 46%，因此选
取 600 μmol /L H2O2 制作氧化应激损伤模型。
表 2 不同浓度 H2O2 对 SH-SY5Y细胞活力
的影响(珔x ± s，n =6)
浓度 /(μmol /L) 细胞活力
0 1. 556 ± 0. 075
200 0. 830 ± 0. 096＊＊
400 0. 714 ± 0. 018＊＊
600 0. 722 ± 0. 043＊＊
800 0. 582 ± 0. 008＊＊
注:与对照组(0 μmol /L)比较，＊＊P ＜ 0. 01
·6221· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 38 卷第 6 期 2015 年 6 月
3. 2 竹节参总皂苷对 H2O2 损伤 SH-SY5Y 细胞活
力的影响 与正常对照组比较，模型组 SH-SY5Y细
胞活力显著性降低(P ＜ 0. 01)。与模型组比较，竹
节参总皂苷各剂量组的细胞活力显著性升高(P ＜
0. 01)，且有剂量依赖性。见表 3。
表 3 竹节参总皂苷对 H2O2 损伤 SH-SY5Y
细胞活力的影响(珔x ± s，n =6)
组别 细胞活力
正常对照组 1. 131 ± 0. 089
模型组 0. 470 ± 0. 019＊＊
竹节参总皂苷 0. 1 μg /mL组 0. 987 ± 0. 098##
竹节参总皂苷 1 μg /mL组 1. 079 ± 0. 072##
竹节参总皂苷 5 μg /mL组 1. 091 ± 0. 071##
竹节参总皂苷 20 μg /mL组 1. 112 ± 0. 112##
注:与正常对照组比较，＊＊P ＜ 0. 01;与模型组比较，##P ＜ 0. 01
3. 3 竹节参总皂苷对 H2O2 损伤 SH-SY5Y 细胞
SOD活性和 MDA 含量的影响 与正常对照组比
较，模型组细胞内 SOD 活性显著降低，MDA 含量显
著升高(P ＜ 0. 01)。与模型组比较，竹节参总皂苷
1、5、20 μg /mL 组细胞内 SOD 活性显著升高，MDA
含量显著降低(P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01)。见表 4。
表 4 竹节参总皂苷对 H2O2 损伤 SH-SY5Y细胞
SOD活性和MDA含量的影响(珔x ± s，n =6)
组别
SOD /
(U /mg prot)
MDA /
(nmol /mg prot)
正常对照组 145. 9 ± 8. 69 6. 02 ± 1. 09
H2O2 模型组 79. 9 ± 3. 71＊＊ 22. 2 ± 0. 968＊＊
竹节参总皂苷 0. 1 μg /mL组 78. 9 ± 6. 32 19. 9 ± 3. 61
竹节参总皂苷 1 μg /mL组 96. 8 ± 9. 26# 16. 7 ± 1. 42#
竹节参总皂苷 5 μg /mL组 109. 7 ± 14. 3## 12. 2 ± 1. 81##
竹节参总皂苷 20 μg /mL组 123. 7 ± 8. 66## 4. 03 ± 4. 23##
注:与正常对照组比较，＊＊ P ＜ 0. 01;与模型组比较，# P ＜
0. 05，##P ＜ 0. 01
3. 4 竹节参总皂苷对 H2O2 损伤 SH-SY5Y 细胞核
Nrf2 蛋白表达的影响 结果如图 1 所示，模型组较
正常对照组细胞核 Nrf2 的表达显著降低(P ＜
0. 01)，竹节参总皂苷各组较模型组细胞核 Nrf2 表
达显著升高(P ＜ 0. 01)。
图 1 竹节参总皂苷对 H2O2 损伤 SH-SY5Y
细胞核 Nrf2 蛋白表达的影响
A. 正常对照组 B. 模型组 C. 竹节参总皂苷 5 μg /mL组
D. 竹节参总皂苷 20 μg /mL组
注:与正常对照组比较，＊＊P ＜ 0. 01;与模型组比较，##P ＜ 0. 01
3. 5 竹节参总皂苷对 H2O2 损伤 SH-SY5Y 细胞
Nrf2 下游基因 NQO1 和 GCLC mＲNA表达的影响
结果如图 2 所示，模型组细胞较正常对照组细胞的
GCLC和 NQO1 mＲNA表达显著降低(P ＜ 0. 01)，竹
节参总皂苷 5、20 μg /mL 组较模型组 GCLC、NQO1
mＲNA表达显著升高(P ＜ 0. 01)。
图 2 竹节参总皂苷对 H2O2 损伤 SH-SY5Y细胞 Nrf2 下游基因 NQO1、GCLC mＲNA 表达的影响
A. 正常对照组 B. 模型组 C. 竹节参总皂苷 5 μg /mL组 D. 竹节参总皂苷 20 μg /mL组
注:与正常对照组比较，＊＊P ＜ 0. 01;与模型组比较，##P ＜ 0. 01
3. 6 竹节参总皂苷对 H2O2 损伤 SH-SY5Y 细胞 p-
EＲK、p-P38 蛋白表达的影响 结果如图 3 所示，模
型组较正常对照组 p-EＲK 表达下调(P ＜ 0. 01)，竹
节参总皂苷 5、20 μg /mL组 p-EＲK较模型组表达显
著上调(P ＜ 0. 01)，与 Nrf2 蛋白表达趋势一致。各
组 p-P38 表达均无明显差异。
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图 3 竹节参总皂苷对 H2O2 损伤 SH-SY5Y细胞 p-EＲK、p-P38 蛋白表达的影响
A. 正常对照组 B. 模型组 C. 竹节参总皂苷 5 μg /mL组 D. 竹节参总皂苷 20 μg /mL组
注:与正常对照组比较，＊＊P ＜ 0. 01;与模型组比较，##P ＜ 0. 01
4 讨论
尽管阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病等神经
退行性疾病的病因不尽相同，但氧化应激是其共同
发病机制之一。研究表明，在神经退行性疾病中，氧
化应激水平随之提高，神经细胞受到活性氧的攻击
后发生凋亡〔4〕。SH-SY5Y 细胞系是人神经母细胞
瘤细胞，分化程度较低，且增殖较快，在药理实验中
多采用 H2O2 诱导其凋亡作为神经退行性疾病模
型。本实验结果显示，H2O2 模型组细胞活性较正常
对照组减弱，而竹节参总皂苷处理组较模型组细胞
活性增强，表明竹节参总皂苷可增强细胞活性。自
由基能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸引发脂质过
氧化作用生成脂质过氧化物，如丙二醛(MDA)、酮
基、羟基以及羰基等。为了防御自由基损伤，机体内
部也有一套抗氧化系统，其中 SOD是清除自由基的
首要物质。SOD 活性的高低间接反映了机体清除
氧自由基的能力，而 MDA 的高低又间接反映了机
体细胞受自由基攻击的严重程度〔5〕。因此 SOD 活
性和 MDA含量可反映机体的氧化应激状态。本实
验结果表明，H2O2 可使细胞 SOD 活性降低，MDA
含量升高;竹节参总皂苷处理组细胞 SOD 活性升
高，MDA含量降低。表明竹节参总皂苷可通过提高
SOD活性来抵抗 H2O2 所造成的细胞损伤。为了抵
御氧化应激损伤，细胞内部有一套抗氧化系统来抵
御这种损伤例如内源性的抗氧化酶等，但产生这一
生物体抗氧化应激的防御机制主要通过抗氧化反应
元件(antioxidant response element，AＲE)来防御。
Nrf2 是细胞氧化应激中的关键因子，当细胞处于氧
化应激状态时，Nrf2 由胞浆转移入胞核中并启动抗
氧化基因的转录如 NQO1、GCLC 等〔6〕。本研究表
明，经 H2O2 处理的细胞胞核内 Nrf2 的表达量下调，
竹节参总皂苷预给药组较 H2O2 处理组核内 Nrf2 表
达上调;H2O2 处理组 NQO1 和 GCLC mＲNA 的表达
下调，竹节参总皂苷预给药组较 H2O2 处理组 NQO1
和 GCLC mＲNA的表达上调。表明竹节参总皂苷抗
氧化作用的机制可能与 Nrf2 /AＲE 信号通路的激活
有关。
丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是生物体内
重要的信号转导系统之一，参与了细胞生长、发育、
分化、凋亡及细胞间的功能同步等多种生理反应过
程。MAPK是细胞内的一类丝氨酸 /苏氨酸蛋白酶
激酶，由多种同工酶组成，它包括:①细胞外信号调
节的蛋白激酶(extracelular signal regulated kinase，
EＲK);②C-Jun N 端激酶(c-Jun N terminal kinase，
JNK)/应激激活的蛋白激酶(SAPK);③P38-MAPK
(P38 mitogen activated protein kinase)。MAPK 对转
录因子活性具有重要的调控作用，能把细胞外的氧
化应激刺激传递到细胞内并引起细胞核发生变
化〔7〕。在氧化应激条件下，MAPK 对细胞的促凋亡
及抗凋亡作用取决于细胞类型、细胞系来源、刺激方
式和刺激时间。MAPK的每一个成员都各自形成独
立的信号通路及网络。一般认为，EＲK 通路直接或
间接活化抑制细胞凋亡，促进细胞存活〔8〕。在人的
成胶质细胞瘤细胞中发现抑制 EＲK 磷酸化可导致
细胞内的 Nrf2 蛋白的表达减少。模型组细胞的 p-
EＲK表达量较正常对照组下降，竹节参总皂苷组较
模型组 p-EＲK的表达量升高，与胞核 Nrf2 蛋白表达
趋势一致，但 p-P38 无明显变化。由此初步推断竹
节参总皂苷可能通过 EＲK-Nrf2 通路发挥抗氧化作
用。除了 EＲK外，Nrf2 是否还受到其他蛋白的调控
·8221· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 38 卷第 6 期 2015 年 6 月
以及竹节参总皂苷是否还作用其他靶蛋白发挥保护
作用还需要进一步研究。
参 考 文 献
［1］贺海波，许佳，王洪武，等 . 竹节参不同提取部位预处理
对冠脉结扎诱导大鼠急性心肌缺血损伤的影响［J］．第
三军医大学学报，2011，33(14):1462-1466.
［2］贺海波，徐媛青，魏娜，等 . 竹节参总皂苷对 H2O2 致乳
鼠心肌细胞氧化应激损伤的保护作用［J］．中国实验方
剂学杂志，2012，18(17):187-191.
［3］贺海波，许佳，徐媛青，等 . 竹节参总皂苷预处理对冠脉
结扎致大鼠急性心肌缺血损伤的影响［J］． 中药材，
2012，35(5):774-749.
［4］ Won YS，Ah ＲG，Sung MJ，et al. Celastrol induces expres-
sion of heme oxygenase-1 through ＲOS /Nrf2 /AＲE signa-
ling in the HaCaT cells［J］． Biochem Biophys Ｒes Com-
mun，2011，407(3) :535-540.
［5］ Gupta YK，Briyal S，Sharma U，et al. Effect of endothelin
antagonist(TAK-044)on cerebral ischemic volume，oxida-
tive stress markers and neurobehavioral parameters in the
middle cerebral artery occlusion model of stroke in rat［J］．
Life Sciences，2005，77(1) :15-27.
［6］ Lee C，Park GH，Lee SＲ，et al. Attenuation of β-amyloid-in-
duced oxidative cell death by sulforaphane via activation of
NF-E2-related factor 2［J］． Oxidative Medicine and Cellular
Longevity，2013，2013:313510.
［7］ Munshi A，Ｒamesh Ｒ． Mitogen-activated protein kinases
and their role in radiation response［J］． Genes Cancer，
2013，4(9-10) :401-408.
［8］ Crossthwaite AJ，Hasan S，Williams ＲJ． Hydrogen peroxide-
mediated phosphorylation of EＲK1 /2，Akt /PKB and JNK
in cortical neurones:dependence on Ca(2 +)and PI3-ki-
nase［J］． J Neurochem，2002，80(1) :24-35.
·9221·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 38 卷第 6 期 2015 年 6 月