全 文 ：利用发根农杆菌 (Agrobacteriumrhizogenes)
Ri(rootinducing)质粒的T-DNA片段在药用植物
基因组中的整合和表达所产生的生长迅速的毛状根
培养物来生产药用植物的次生物质,已在人参
(Panaxginseng)、丹参 (Salviamiltiodrhiza)和三
裂叶野葛 (Puerariaphaseoloides)等多种药用植物
中获得成功[1-3]。龙葵 (SolanumnigrumL.) 属茄
科一年生草本植物,全草含龙葵碱 (solanigrine)、
澳洲茄胺 (solasodine)、澳洲茄边碱等多种生物
碱,具有抗菌、散淤消肿、清热解毒、止咳平喘、
利尿降压等功效[4,5]。近年的药理研究还表明,龙
葵所含的生物碱能通过显著降低肿瘤细胞膜的通透
性和流动性及膜蛋白水平而具有抗肿瘤活性[6,7]。
但迄今,利用发根农杆菌对茄科植物如 Solanum
aviculare和 (紫脉)少花龙葵 (S.photeinocarpum)
的遗传转化所产生的毛状根来产生澳洲茄胺或龙葵
生物碱和总皂甙已有报道 [8,9]。褐脉少花龙葵
(SolanumnigrumL.varpauciflorumLiou) 是茄科龙
葵属的药用植物之一,至今未见利用发根农杆菌对
褐脉少花龙葵进行遗传转化及利用毛状根生产其药
用次生物质如澳洲茄胺的正式报道。
植物毛状根培养所用的培养基一般由无机元素
和有机附加物等组成。已有的研究表明,培养基的重
要组成成分如无机营养元素等的变化能影响毛状根的
生长及其次生代谢物的产生[10,11],但有关这些组分在
培养基中的消耗变化及其与毛状根的生长或形态变化
等方面的研究较少。为此,本文首先通过发根农杆菌
ATCC15834对褐脉少花龙葵的遗传转化,获得可产
生次生物质澳洲茄胺的转化毛状根,并研究该毛状根
液体培养周期中无机元素氮和钙的消耗变化,为今后
确立该龙葵毛状根离体培养的最佳条件及利用该毛状
根来生产药用成分澳洲茄胺等奠定实验基础。
1 材料和方法
1.1 细菌菌株及培养
农杆碱型发根农杆菌 (Agrobacteriumrhizo-
褐脉少花龙葵毛状根的诱导、培养及其澳洲茄胺的产生
吴晓凤 1 施和平 1* TSANGPoKeungEric2
(1华南师范大学生命科学学院,广东省植物发育生物工程实验室,广州 510631;
2香港教育学院数社科学系,中国香港)
摘要 利用发根农杆菌的遗传转化和液体培养技术,研究了褐脉少花龙葵 (SolanumnigrumL.var.
pauciflorum)毛状根的诱导和离体培养及其澳洲茄胺的产生以及液体培养过程中培养基中 N源和
钙的消耗变化。结果表明,发根农杆菌ATCC15834感染褐脉少花龙葵叶片外植体5d后产生毛状
根,感染25d后,约90%的叶片外植体产生毛状根。毛状根能在无外源生长调节剂的 MS固体和液
体培养基上自主生长。PCR扩增结果显示发根农杆菌Ri质粒的rolB和rolC基因已在少花龙葵毛
状根基因组中整合并得到表达。所产生的毛状根能产生药用次生物质澳洲茄胺,其含量约为非转
化植株根的 1.3倍,达到 582.05μg/g干重。少花龙葵毛状根液体培养 0-5d内处于生长迟滞期、
5-15d为快速生长期、15d后进入生长平台期。培养基的硝态氮和铵态氮在毛状根液体培养过程
中被逐渐吸收和消耗,至培养15d时铵态氮被消耗殆尽,而硝态氮仍剩余44.7%;培养基中钙的浓
度在培养过程中虽逐渐降低,但在培养 25d时仍未被完全消耗,其浓度约为起始浓度的 43.5%。
该结果为今后设计合适的培养基来规模培养褐脉少花龙葵毛状根生产药用次生物质澳洲茄胺提供
了可能性。
关键词: 发根农杆菌 褐脉少花龙葵 毛状根 澳洲茄胺 氮源 钙
本文2008年1月23日收到。2008年4月10日接受。
*通讯联系人:Tel:86-20-85214793,E-mail:shihp@scnu.
edu.cn
第41卷 第3期 Vol.41,No.3
June20082008年6月
分 子 细 胞 生 物 学 报
JournalofMolecularCelBiology
41卷吴晓凤 施和平 TSANGPoKeungEric
genes)ATCC15834由德国 Martin-LutherUniversi-
taetHale/Witenberg的 PeterLindemann博士提供。
挑取该农杆菌单菌落,接种于添加了20μmol/L乙酰丁
香酮的YEB液体培养基中28℃震荡 (160r/min)培
养30h,供感染用。
1.2 外植体制备
实验用的褐脉少花龙葵 (S.nigrumL.var.
pauciflorumLiou)植株采自本校生物园,取其幼嫩
的叶片经常规消毒后,切成 1-1.5cm2的具叶脉的
叶片外植体,并置于无外源生长调节剂的MS[12]培养
基上预培养24h后,用于转化。
1.3 毛状根的诱导和培养
将上述预培养的少花龙葵叶片外植体浸入用
MS培养基稀释5倍的发根农杆菌ATCC15834菌悬
液中 15min,取出、吸干多余菌液并放回原培养
基上共培养2d后,转入MS+500mg/L头胞噻肟钠
(cefotaxime)的无外源生长调节剂的MS培养基上,
在25°C每天14h散射光下诱导毛状根。切取从外
植体产生的毛状根置于含 500mg/L头胞噻肟钠的
无外源生长调节剂的 MS培养基上除菌培养,直到
获得无菌的毛状根。取能在无外源生长调节剂培养
基上自主生长的无菌毛状根进行遗传转化鉴定;另
取遗传转化鉴定呈阳性的毛状根克隆 SN2置于无
外源生长调节剂的液体培养基中,25℃黑暗条件下
恒温振荡 (100r/min)培养 15d后,取出毛状根,
用滤纸吸干水分后,供进行次生物质澳洲茄胺含量
的分析测定用。
1.4 毛状根的PCR检测
取能快速自主生长的无菌毛状根 500mg,按
Ewards等[13]的方法提取毛状根基因组 DNA,纯化
后用作 PCR扩增的模板。以褐脉少花龙葵一年生
非转化植株根的基因组总DNA作对照。根据Furner
等[14]发表的序列,设计并合成扩增 rolB、rolC的
PCR引物,根据Choi等[15]发表的序列设计并合成扩
增 virC的 PCR引 物 。 rolB引 物 : P1: 5′-
GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3′,P2:5′-GAAG-
GTGCAAGCTACCTCTC-3′;rolC引物:P1:5′-
CTCCTGACATCAAACTCGTC-3′,P2:5′-TGCTTC
GAGTTATGGGTACA-3′;virC引 物 :P1: 5′-
GGCTTCGCCAACCAATTTGGAGAT-3′,P2: 5′-
TTTTGCTCCTTCAAGGGAGGTGCC-3′(引物由中
国科学院上海细胞生物学研究所合成)。
在 0.2mL的硅化离心管中加入模板 DNA50
ng,TaqDNA聚合酶 2个单位,PCR反应总体积
为 50μL。PCR扩增参数如下:rolB、rolC基因扩
增条件相同,其 PCR扩增的反应参数为:94℃起
始热变性 3min,接着进行 35个循环,每个循环
包括94℃变性 1min,53.5℃退火 1min和 72℃延伸
反应1min,最后72℃延伸10min;virC基因的扩增
条件为,94℃起始热变性 5min,接着进行 30个循
环,每个循环包括 94℃变性 45s,55℃退火 45s和
72℃延伸反应2min,最后 72℃延伸 7min。扩增产
物采用0.8%琼脂糖凝胶电泳和EtBr染色进行分析。
1.5 毛状根澳洲茄胺含量的分析测定
毛状根中澳洲茄胺化合物的测定:基本参照
NisitKitipongpatana等的方法进行[16]。将培养15d
的毛状根用吸水纸吸干,置于 50℃烘箱中烘干,
称取适量的毛状根,用研钵磨成粉末,加入 50mL
的氯仿温和震荡 30min,然后过滤,准确量取
20mL的滤液,装入离心管中,20℃3000g下离心
10min,去掉上清夜,留下沉淀,然后加入 10mL
不含酒精的氯仿使沉淀溶解,然后取 1-2mL溶液
转移到10mL的离心管中,加入不含酒精的氯仿定
容至 5mL,再加 2.5mL200μmol/L的溴麝香草酚兰
溶液,震动10秒钟,去掉上层的溴麝香草酚兰溶
液,取下层溶液 4mL,加入 0.1mL0.01mol/L的
NaOH,震荡使其混匀,然后用岛津UV-2100型紫
外-可见光分光光度计在 610nm处测定其光密度
(OD)值。测定前,配制一系列浓度的澳洲茄胺
(solasodine)标样的溶液并在610nm处测定光密度
(OD)值,作出澳洲茄胺含量的标准曲线,其回归
方程为 y=0.0205x+0.0492,相关系数为 R=
0.9953,并依据此回归方程计算出毛状根样品中澳
洲茄胺的含量。
1.6 毛状根的液体培养及其培养液中铵态氮、硝
态氮和钙含量的测定
将来自生长旺盛的少花龙葵毛状根克隆系SN2
的毛状根,切成长4-5cm、具根尖的毛状根根段,
接入盛有灭菌的MS液体培养基中进行培养。起始
接种量为 0.15gFW/瓶,在为期 25d的培养过程
中,每隔 5d,随机抽取毛状根培养物 3瓶;收取
毛状根,用无菌水冲洗后、用滤纸吸干毛状根培养
物表面的水分后测定其生物量。将毛状根取样后的
MS培养液过滤、去离子水定容后,测定其 NO3-、
NH4+和Ca2+含量的变化。其中,毛状根培养液中铵
态氮含量的测定按照上海市植物生理学会的方法进
184
3期 褐脉少花龙葵毛状根的诱导、培养及其澳洲茄胺的产生
行[17];培养液中硝态氮含量的测定按照张志良等[18]
的方法。而培养液中Ca2+浓度的EDTA络合滴定按
照阮湘元等[19]的方法。实验重复测定三次,取平均
值。
2 结 果
2.1 褐脉少花龙葵毛状根的诱导和培养
未感染的少花龙葵叶片外植体在无外源生长调
节剂的MS+500mg/L头胞噻肟钠的培养基上连续培
养30d后无一生根,仅可见大部分的叶片外植体变
黄或变褐;仅从少部分叶片的形态学下端切口中脉
处产生少量浅黄色致密的愈伤组织。而感染发根农
杆菌的叶片外植体培养5d后,从其叶片切口中脉
处或附近表面产生毛状根 (图1A),或从叶脉处产
生的浅黄绿色愈伤组织上产生毛状根。将所产生的
毛状根切下并置于 MS+500mg/L头胞噻肟钠中除
菌培养,每隔7d左右转接1次,约5-6次后即可
完全除菌。无菌的毛状根可在无外源生长调节剂的
MS固体或液体培养基上快速自主生长,且具较多
分枝 (图 1B,C)。所获得的可自主快速生长的毛
图1 褐脉少花龙葵毛状根的诱导和培养
A.感染发根农杆菌 ATCC1583410d后叶片外植体产生的毛状根;B.在无外源植物生长调节剂的 MS固体培养上生长
10d的毛状根;C.在无外源植物生长调节剂的 MS液体培养上生长 15d的毛状根;D.在液体 MS培养基中生长 25d的毛状
根 (其中:左为培养25d后的部分毛状根,右为培养25d后的残余培养基)。
Fig.1 InductionandcultureofS.nigrumL.var.pauciflorum hairyroots
A.Hairyrootsinducedfrom theleafexplantsongrowthregulator-freeMSmedium 10daysafterinfectionwithA.
rhizogenesATCC15834(scalebar1.8cm);B.Sterilehairyrootsculturedonsolid,growthregulator-freeMSMediumfor10
days (scalebar2.2cm).C.SterilehairyrootsculturedinliquidMSmediumfor15days (scalebar1.8cm);D.sterile
hairyrootsculturedinliquidMSmediumfor25days (scalebar2.2cm).Left:Partof25daysliquidculturedhairyroots.
Right:25-day-liquid-culturedMSmedium.
185
41卷吴晓凤 施和平 TSANGPoKeungEric
状根置于无外源植物生长调节剂的MS培养基中继
代保存,供进行遗传转化鉴定和药用成分澳洲茄胺
的分析测定用。
2.2 毛状根中rol基因的PCR扩增
rolB和 rolC是发根农杆菌 Ri质粒 TL-DNA
(T-DNA左臂)上的两个生根基因,而 virC是 Ri
质粒中参与T-DNA转化过程但本身并不整合进植
物基因组中的毒性基因之一。本实验中,采用对毛
状根基因组DNA进行virC基因的PCR扩增,以确
保毛状根的除菌效果。以 rolB、rolC和 virC的引
物分别从少花龙葵对照根、毛状根基因组 DNA及
发根农杆菌单菌落扩增产物的电泳结果如图2。从
图 2可见,利用 rolB和 rolC的 PCR引物能从少花
龙葵毛状根的总 DNA及发根农杆菌 ATCC15834
单菌落克隆中分别扩增到期望的 540bp和 770bp
左右的特异性DNA片段,而从少花龙葵非转化根的
总 DNA中扩增不到任何片段 (图 2);而以 virC
引物仅能从发根农杆菌菌落中扩增出约 650bp条
带,而不能从少花龙葵毛状根和非转化 (自然)根
基因组DNA中扩增出任何片段。这说明,发根农杆
菌的含 rol基因的 RiT-DNA部分已在少花龙葵毛
状根基因组中整合并得到表达。
2.3 褐脉少花龙葵毛状根药用次生物质澳洲茄胺
含量的分析测定
取经遗传转化鉴定为阳性的无菌毛状根系
SN2,置于无外源植物生长调节剂的 MS液体培养
基中培养15d后,取样进行药用次生物质澳洲茄胺
的分析测定。结果如表1所示。与对照 (一年生非
转化植株)相比,经发根农杆菌 ATCC15834诱导
的褐脉少花龙葵叶片产生的毛状根不仅能合成澳洲
茄胺,而且毛状根中的澳洲茄胺含量约为非转化植
株根的 1.31倍,达到 582.05±36.52!g/g干重;但
比具果实的非转化植株样品的澳洲茄胺含量低。
2.4 褐脉少花龙葵毛状根的生长特性
将经遗传转化鉴定为阳性的无菌毛状根系SN2
接种至液体MS培养基中培养1-2d后,可观察到
从毛状根根段开始产生出新的乳白色分枝根;而且
随着培养时间的延长,根段不断伸长;同时发现,
随着培养的进行,毛状根的颜色逐渐由白色变为浅
黄色;培养 20d后,还可观察到一小部分毛状根的
起始根段处开始出现局部轻微褐化。图3为少花龙
葵毛状根在液体培养过程中的生长变化。从图3可
图2 褐脉少花龙葵毛状根virC、rolB和rolC基因的PCR扩增产物的凝胶电泳分析
道 1:1KbDNAmarker;道 2,6和 10:从发根农杆菌菌体扩增的片段;道 3,7和 11:从非转化根 (自然根)扩增
的片段;道 4,5,8,9,12和13:从毛状根扩增的片段。
Fig.2 GelelectrophoresisanalysisofPCRfragmentsofvirC,rolBandrolCgenesamplifiedfrom thegenomeicDNA
ofS.nigrumL.var.pauciflorum hairyroots
Lane1:DNAmarker; Lane2,lane6,andlane10:fragmentsamplifiedfromthecelsofA.rhizozgenesATCC15834.
Lane3,lane7andlane11:fragmentsamplifiedfromuntransformedroots.Lane4-5,lane8-9andLane12-13:fragments
amplifiedfromhairyroots.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
3.0Kb
1.0Kb
virC rolC
rolB
186
3期 褐脉少花龙葵毛状根的诱导、培养及其澳洲茄胺的产生
见,褐脉少花龙葵毛状根的生长曲线基本符合 S
型。接种1-5d后毛状根生长比较缓慢,处于生长
迟滞期;培养 5-15 d毛状根培养物进入快速生长
期,表现在其生物量 (鲜重)迅速增加,从
0.284g.FW/瓶增至1.574g.FW/瓶;15-20d毛状根培
养物的生长变缓,进入生长的平台期;20d后,生
物量呈迅速下降的趋势,25d后还可观察到大部分
毛状根表面出现不同程度褐化,并发现毛状根可
向培养基中分泌可使培养基呈砖红褐色的物质
(图1D)。
2.5毛状根液体培养过程中培养基 NO3-和 NH4+
的消耗变化
图 4为褐脉少花龙葵毛状根液体培养过程中
培养基中氮源的消耗变化。从图 4可见,在毛状
根液体培养的0-15d内,培养基中硝态氮的消耗与
毛状根的生长变化基本同步,在接种后0-5d,培养
基中的硝态氮缓慢减少;而在毛状根快速生长期,
培养基中的硝态氮被毛状根迅速消耗;至培养15d
时,培养基中的硝态氮含量降到最低,约1.072mg/
mL,而同时毛状根的生物量 (干重)也达到最大;
但培养 15d以后,培养基中的硝态氮含量还略有
上升。
与培养基中的硝态氮变化相比,培养基中的铵
态氮含量在毛状根接种0-5d的生长停滞期内急剧
地增加;但当毛状根进入生长时期 (即培养后 5-
15d之间),培养基中的铵态氮则被快速消耗,其
浓度急剧下降,至培养15d时,铵态氮已几乎消耗
殆尽,其含量为49.441mg/L,约占培养基起始铵态
氮含量的 13.33%;随后,培养基中的铵态氮含量
又呈现逐渐升高的趋势。该结果表明,褐脉少花龙
葵毛状根液体摇瓶培养时,其培养基中硝态氮和铵
态氮的代谢周期约为15 d。
2.6毛状根液体培养过程中培养基Ca2+的消耗变化
图 5为褐脉少花龙葵毛状根液体培养过程中
培养基 Ca2+的消耗变化。从图 5可见,培养基中
Ca2+浓度随着培养时间的延长逐渐降低,但与培养
基中的铵态氮的消耗变化相比,毛状根对Ca2+的吸
收和利用速度相对较慢且不完全;至培养 25d时,
培养基中仍残存有占起始浓度约43.5%的Ca2+。这
表明,钙虽然是褐脉少花龙葵毛状根生长所必需的
矿质元素,但毛状根对钙的吸收和利用要比氮源慢
得多。
表1 褐脉少花龙葵毛状根澳洲茄胺含量的比色测定
Table 1 Colorimetric determination of solasodine content in S. nigrum L. var. pauciflorum hairy roots
植物材料
Plant materials
Untransformed roots
Untransformed plants with fruits
Hairyroots induced byATCC15834
澳洲茄胺含量(!g/g干重)
Solasodine content(!g/gdryweight)
443.70±22.08
693.46±16.12
582.05±36.52
图3 褐脉少花龙葵毛状根的生长曲线
Fig.3 Time course of growth for S. nigrum L. var pauciflorum hairy roots in liquid medium
187
41卷吴晓凤 施和平 TSANG Po Keung Eric
3 讨 论
通过利用发根农杆菌 Ri质粒的 T-DNA片段
在茄属药用植物基因组中的整合和表达所产生的生
长迅速的毛状根培养物来生产茄科药用植物的次
生物质如澳洲茄胺或龙葵皂甙等,已在Solanum
eleagnifolium[20]、S. aviculare[8]和 (紫脉)少花龙
葵 (S. photeinocarpum)[9] 等多种茄属植物中获得
成功。但至今为止,尚未见利用发根农杆菌对茄科
植物褐脉少花龙葵 (S. nigrum L. var pauciflorum)
的遗传转化,获得毛状根来产生其药用次生物质澳
洲茄胺的报道。在本实验中,我们利用含野生农杆
碱型Ri质粒的发根农杆菌ATCC15834对褐脉少花
龙葵的遗传转化,获得了能在无激素培养基上自主
生长,又能产生药用成分澳洲茄胺的毛状根,并且
其澳洲茄胺含量甚至比一年生非转化自然植株根含
量还高。这表明,利用可自主快速生长的褐脉少花
龙葵毛状根来生产其药用次生物质澳洲茄胺是可
能的。然而,龚玉莲等报道,发根农杆菌 R1601
遗传转化获得的少花龙葵毛状根所产生的总糖苷
生物碱和总皂甙含量分别为原植株根的 31倍和
107倍[9]。而这与本实验的结果不一致。不同的是,
在本实验中,我们所获得的褐脉少花龙葵毛状根在
培养15d时所产生的龙葵生物碱之一澳洲茄胺的含
量仅比非转化植株根提高约 31%。另外,有报道
表明,颠茄 (Atropa belladonna)不同毛状根克隆
间在生长速度和次生物质东莨菪碱和莨菪碱产生
能力方面均存在明显差异[21]。因而,我们认为,
造成这种差异的原因可能与植株品种、培养时间
长短、毛状根类型以及所测生物碱的种类及其测
定方法等有关。
研究培养基中主要营养元素的代谢变化是建立
图4 褐脉少花龙葵毛状根液体培养过程中培养基中硝态氮和铵态氮含量的变化
Fig.4 Changes of NO3--N and NH4+-N contents in culture medium during liquid culture of S. nigrum L. var
pauciflorum hairy roots
图5 褐脉少花龙葵毛状根液体培养过程中培养基钙含量的变化
Fig.5 Changes of Ca2+content in the culture medium during liquid culture of S. nigrum L. var pauciflorum hairy roots
188
3期 褐脉少花龙葵毛状根的诱导、培养及其澳洲茄胺的产生
和确定毛状根最佳离体培养条件的前提。硝酸盐和
铵盐是毛状根培养基中最重要的氮源。迄今为止,
关于培养基中氮源 (硝态氮和铵态氮)的含量或种
类及其配比对毛状根的生长及其次生代谢产物的影
响已有一些研究报道[9,22]。如发现培养基中的硝态
氮和铵态氮的比率还能明显影响 Atropabeladonna
毛状根的生长及其次生物质东莨菪碱/天仙子胺的
比率;而降低培养基中的硝态氮浓度还可促进毛状
根生物碱的产生[22]。而在培养基中添加 NO3-能使
Daturacandida×D.aurea毛状根的生物量增加及显
著提高天仙子胺生物碱的含量,但同时会使毛状根
的东莨菪碱 (Scopolamine)含量明显降低[9]。然
而,相比之下,对毛状根培养过程中培养基中氮源
本身的消耗速率与毛状根生长的关系的研究较少。
在培养栝楼 (Trichosantheskirilowi)毛状根时,
培养基中铵态氮和硝态氮随着生长的进行而被逐渐
消耗,在培养24d时铵态氮已被完全消耗,而此时
硝态氮则仍有 17%未被消耗和利用[23];然而,在
高山红景天 (RhodiolaSachalinensis) 细胞悬浮培
养中却观察到,其培养基中 NO3/NH4+浓度之比几
乎为一恒定值 [24];而当三裂叶野葛 (Pueraria
phaseoloides)毛状根液体培养 20d后,其培养基
中的硝态氮和铵态氮均被消耗殆尽[25]。而这些与本
实验的结果不完全一致。在本实验中我们发现,在
褐脉少花龙葵毛状根的生长迟缓期 (0-5d),培养
基中铵态氮的含量出现明显的上升;随后,铵态氮
和硝态氮含量同步下降,但铵态氮的利用速率较
快,至培养15d时培养基的铵态氮几乎消耗殆尽,
而此时,培养基中仍残存有占起始硝态氮浓度
44.7%的硝态氮未被毛状根吸收利用。这是因为植
物细胞吸收硝态氮后,必须先转化成铵态氮后才能
被细胞吸收和利用;因而,在毛状根0-5d的生长
停滞期 (培养初期)内,培养基中铵态氮含量的明
显上升和硝态氮含量逐渐降低可能与培养基中硝态
氮的转化有关。本实验结果表明,在液体培养过程
中褐脉少花龙葵毛状根对培养基中硝态氮的吸收和
利用较慢且不完全,而这种差异的产生可能与毛状
根的类型及植物种类等有关。
与氮一样,钙也是植物细胞生长发育必需的矿
质元素。如有研究表明,培养基中的 Ca2+浓度或
Ca2+的拮抗剂等能提高Polygonumhydropiper悬浮细
胞黄酮醇的产量[26]或促进长春花毛状根中吲哚生物
碱的产生和释放[27];而提高培养基的Ca2+浓度虽对
天仙子 (Hyoscyamusalbus)毛状根的生长无明显
影响,但却能明显提高毛状根中托品生物碱的产
量[28];然而。至今为止有关毛状根培养过程中培养
基中Ca2+浓度消耗变化的研究极少。我们的结果表
明,在褐脉少花龙葵毛状根培养过程中,培养基的
Ca2+可被毛状根逐渐吸收和利用,但与培养基的铵
态氮和硝态氮的消耗变化相比,毛状根对Ca2+的吸
收速度慢且利用不完全。
我们的结果表明,培养基的铵态氮、硝态氮
和钙离子的消耗变化可因植物毛状根的种类和培
养体系的不同而有所差别,而通过对培养基中氮
源和钙盐等消耗变化的测定,将能为大规模培养
毛状根时确定培养周期以及整个培养周期中氮源
和钙盐等的供给量提供理论依据和技术参数。本
实验的结果为今后开展少花龙葵毛状根的规模培
养提供了参考依据。
致谢 本研究工作得到了香港裘槎基金 (CroucherFounda-
tion)资助。德国马丁.路德大学 PeterLindemann博士馈赠
发根农杆菌菌种 ATCC15834;印度尼西亚 Airlangga大学药
学院GunawanIndrayanto博士馈赠澳洲茄胺标准品,在此一
并致谢。
参 考 文 献
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3期 褐脉少花龙葵毛状根的诱导、培养及其澳洲茄胺的产生
ABSTRACT ByusinggenetictransformationofAgrobacteriumrhizogenesandliquidculture,in-
ductionandcultureconditionsforSolanumnigrumL.var.pauciflorumLiouhairyrootsanditsso-
lasodineproductionandconsumptionchangesofNresourceandcalciuminthemediumduringliq-
uidculturewereinvestigated.Theresultsshowedthathairyrootscouldbeinitiatedfrom thecut
edgesofleafexplants5daysafterinoculationwiththestrainofA.rhizogenesATCC15834.The
percentageofrootedleafexplants25daysafterinfectionwasmorethan90%.Hairyrootscould
growrapidlyonsolidorliquidgrowthregulator-freeMSmedium.ThePCRamplificationofrol
genesandvirCgeneshowedthatrolgenesofRiplasmidofA.rhizogeneswereintegratedinthe
genomeoftransformedhairyrootsofS.nigrumLvarpauciflorum.Thehairyrootscouldproduce
medicinalsecondarymetabolitessolasodineandtheamountofsolasodineinthehairyrootcultures
reachedalevelof582.05μg/gdryweightandwas1.31timesasmuchasthoseintheuntrans-
formedroots.Thehairyrootsgrewveryslowlyin0-5daysintheliquidmedium,then,veryfast
from5to15days.Duringliquidculture,NO3- andNH4
+
inthemediumweregradualyabsorbed
andutilizedbyhairyroots.NH4+-Nofthemediumwasusedupatday15oftheculture,while
NO3-inthemediumwasnotusedup,thecontentofwhichwas44.7% oftheinitialamount.Ca2+
ofthemediumwasgradualyabsorbedandutilizedduringliquidcultureanditwasnotusedupat
day25,thecontentofwhichwasstil43.5% oftheinitialamount.Theresultspresentedherehad
providedthepossibilitiesonhowtoprepareoptimum medium forlargescalecultivationandpro-
ductionofsolasodinefromS.nigrumL.var.pauciflorumhairyroots.
Keywords: SolanumnigrumL.var.pauciflorum.Hairyroot.Solasodine.Nitrogenresource.
Calcium
INDUCTIONANDINVITROCULTUREOFHAIRYROOTSOF
SOLANUM NIGRUM L.VAR.PAUCIFLORUM LIOUANDITS
SOLASODINEPRODUCTION
WUXiaoFeng1 SHIHePing1* TSANG PoKeungEric2
(1ColegeofLifeSciences,SouthChinaNormalUniversity,GuangdongProvincialKeyLabofBiotechnologyfor
PlantDevelopment,Guangzhou510631,P.R.China; 2DepartmentofMathematics,Science,SocialScienceand
Technology,TheHongKongInstituteofEducation,HongKong,China)
*Corespondingauthor.Tel:+86-20-85214793;E-mail:shihp@scnu.edu.cn
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