全 文 ：书［收稿日期］ 20101122(001)
［基金项目］ 国家自然科学基金(81073034);国家“重大新药创制”科技重大专项(2009ZX09103440);河南省重大公益性科研招标项目
(08110091800)
［通讯作者］ * 冯卫生，教授，研究方向:中草药活性成分研究及新药开发，Tel:0371-65575963，E-mail:fwsh@ hactcm． edu． cn
［网络出版时间］ 2011-03-01 16:45
［网络出版地址］ http:/ / www． cnki． net / kcms / detail /11． 3495． R． 20110301． 1645． 004． html
DOI:CNKI:11-3495 /R． 20110301． 1645． 004
·工艺与制剂·
卷柏中雌激素类成分的提取
郑晓珂，李冬梅，蒋赟，苏成福，王小兰，张莉，冯卫生 *
(河南中医学院，郑州 450008)
［摘要］ 目的:对不同提取方法所得的卷柏提取物进行雌激素活性筛选，探索卷柏发挥雌激素作用的活性部位。方法:采
用小鼠子宫增重试验，将卷柏分别以 70%乙醇回流所得总部位经聚酰胺柱分离;95%乙醇回流药渣经水提取;药渣水提物去除
多糖等所得的卷柏各组分进行雌激素活性筛选。运用 HPLC 指纹图谱技术对卷柏 95%醇提物、药渣水提物进行分析。结果:
70%乙醇回流所得的卷柏总部位、药渣水提物高剂量、药渣水提物去多糖组与空白组比较，均能显著性增加小鼠子宫系数(P ＜
0. 01)，卷柏其余各组与空白组相比无明显作用;HPLC 指纹图谱显示卷柏 95% 醇提物中穗花杉双黄酮为其主要成分，而药渣
水提物中基本不含穗花杉双黄酮。结论:95%乙醇回流药渣水提法与聚酰胺柱分离法相比，前者更适合于卷柏雌激素活性物
质的提取分离;水溶性除多糖物质为卷柏中发挥雌激素样作用的有效部位;HPLC 指纹图谱结果提示，穗花杉双黄酮不是卷柏
发挥雌激素作用的成分。
［关键词］ 卷柏;雌激素类活性成分;子宫系数;提取方法;HPLC 指纹图谱
［中图分类号］ R283. 6 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2011)12-0001-05
Extraction of Estrogenic Active Substance from Selaginella tamariscina
ZHENG Xiao-ke，LI Dong-mei，JIANG Yun，SU Cheng-fu，WANG Xiao-lan，ZHANG Li，FENG Wei-sheng*
(Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，China)
［Abstract］ Objective:To identify the suitable extraction method and polarity for estrogenic active substance
in Selaginella tamariscina， through the estrogenic active screening of different extracts of S． tamariscina from
different extraction methods． Method:Selaginella tamariscina was extracted by 70% ethanol to obtain the total
fraction． The total fraction was separated by polyamide column to obtain the water fraction，50% ethanol and 80%
ethanol fractions;S． tamariscina was refluxed by 95% ethanol to obtain the 95% ethanol extract，and the residue
was decocted by water to obtain the residue water extract;the residue water extract was removed polysaccharides to
obtain non-polysaccharides part of water-soluble components． Then the uterine weight method in mice was adopted
to detect the estrogenic activity of all these different extracts． The 95% ethanol extract and the residue of water
extract were analyzed by high-performance liquid chromatography (HPLC)fingerprint． Result:Compared with the
control group，the total fraction，high dose of the water extract residue and non-polysaccharides part of water-soluble
components group significantly increased uterus coefficient (P ＜ 0. 01)，while the other groups of S． tamariscina
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2011 年 6 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 17，No． 12
Jun．，2011
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2011.12.037
showed no significantly effects (P ＞ 0. 05);HPLC fingerprint demonstrated that amentoflavone was the main
component of the 95% ethanol extract， but no amentoflavone was observed in the residue water extract．
Conclusion:The extraction method of 95% ethanol refluxing and the residue water decocting was more suitable for
extracting the estrogenic active substance of S． tamariscina; the non-polysaccharides part of water-soluble
components played an important role in estrogen activity in S． tamariscina;HPLC fingerprint suggested that
amentoflavone was not the estrogenic active component of S． tamariscina．
［Key words］ Selaginella tamariscina; estrogenic active substance; uterus coefficient; extraction;
HPLC fingerprint
由于健康状况和生活条件的普遍提高，英国、日
本妇女的平均预期寿命已分别达 80，82. 5 岁，即很
多妇女 1 /3 以上的时间将在绝经后度过［1］。伴随而
来的更年期综合征，如潮热、情绪变化、心血管系统
疾病、骨质疏松、免疫功能衰退等严重影响了更年期
妇女 的 生 活 质 量。雌 激 素 替 代 疗 法 (estrogen
replacement treatment，ERT)在改善这些症状的同时，
也增加子宫内膜癌、乳腺癌等的发病率。目前，植物
雌激素作为一种天然的选择性雌激素受体调节剂，
具有防治心脑血管系统疾病，预防骨质疏松，调节自
主神经，降低乳腺癌、子宫内膜癌的发病率等作
用［2-5］。因此，从天然植物中寻找和研究开发具有雌
激素作用的药物，包括发现和筛选其活性成分，确定
给药剂量，探讨作用途径，对临床安全用药具有重要
意义，从而为人类的健康需求提供更多的选择。
卷 柏 为 蕨 类 卷 柏 科 植 物 卷 柏 Selaginella
tamariscina(Beauv．)Spring 的全草，本实验对卷柏化
学成分进行了全面系统地分析，发现卷柏中含有大
量的黄酮类、木脂素类、核苷类和多酚类化合
物［6-11］。前期的研究发现，卷柏具有雌激素样作用，
用 pCXN2-hERα 或 pCXN2-hERβ，pERE-TAL-luc，
pβgal-Control 共转染 HEK293 细胞株，ERE 调控的
报告基因瞬时表达检测，卷柏发挥雌激素活性主要
是通过 ERβ 受体的介导［12-14］。为了明确卷柏中发
挥雌激素作用为何种化合物，本实验室首先采用聚
酰胺柱分离卷柏各部位［15］，运用小鼠子宫增重试验
进行雌激素活性筛选。此法中 70% 乙醇回流所得
的卷柏总部位经聚酰胺柱分离后，得到的各部位无
明显子宫增重作用，无法确定卷柏发挥雌激素作用
的活性部位。在此基础之上，本研究采用 95%乙醇
回流后药渣再水提［16］的方法，对 95%醇提物及其药
渣水提物进行筛选。并结合 HPLC 指纹图谱技术，
以期初步明确卷柏中发挥雌激素作用的物质的极
性，确立药物雌激素类活性物质提取分离的方法。
1 材料
1. 1 动物 昆明种小鼠，雌性，出生 21 d(刚断乳)，
体重 9 ～ 12 g，购于河南省实验动物中心，动物合格证
号 SCXK(豫)2010-0002。在二级动物房给予基础饲
料喂养，环境温度为 25 ℃ ± 1 ℃。
1. 2 药物与试剂 尼尔雌醇片(上海华联制药有限
公司)，己烯雌酚片(合肥久联制药有限公司)，基础
饲料(郑州大学实验动物中心提供)。甲醇、乙腈为
色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为超纯水。
1. 3 仪 器 AB204-N 1 /万 电 子 分 析 天 平
(METTLER TOLEDO 公司)，MCO-5AC 二氧化碳培
养箱(日本 SANYO 公司)，CKX-31 倒置显微镜(日
本 Olympus)，KDC-160HR 型高速低温冷冻离心机
(科大创新股份有限公司)，BIO-RAD 680 酶标仪
(美国 BIO-RAD 伯乐)，Shimadzu LC-10AT 型高效液
相色谱仪。
1. 4 药物的制备 卷柏购于河南省中药材市场，经
河南中医学院药学院董诚明教授鉴定为卷柏 S．
tamariscina。
聚酰胺柱分离法:卷柏全草加 10 倍量 70%乙醇
回流提取 2 次，每次 2 h，合并滤液，提取物减压浓缩
干燥得到卷柏总部位，上聚酰胺柱，依次用水、50%
乙醇、80%乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩干燥，得到水、
50%乙醇、80%乙醇各部位。
95%乙醇回流药渣水提法:卷柏全草加 10 倍量
95%乙醇回流提取 2 次，每次 2 h，提取物减压浓缩
干燥得到 95%醇提物。乙醇提取后的药渣用 10 倍
量的水煎煮 2 次，每次 2 h，水煎液减压浓缩干燥得
到药渣水提物。
药渣水提物去多糖的制备［17］:卷柏药渣水提物
加入适量水，80 ℃水浴使其完全溶解，加入适量乙醇，
使乙醇体积分数为 30%，搅拌，4 ℃静置过夜，6 000
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Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 17，No． 12
Jun．，2011
r·min － 1离心 10 min，分别收集上清液、沉淀。上清液
加入乙醇使其体积分数分别为 50%，80%，重复上述
操作。上清液减压浓缩干燥得到卷柏药渣水提去多
糖成分;多次离心后的沉淀物，依次用无水乙醇、丙
酮、乙醚相继洗涤，室温干燥，得到卷柏多糖成分。
2 方法
2. 1 小鼠子宫增重法 性未成熟雌性小鼠按体重
均衡和随机的原则分组，每组 10 只。空白对照组每
日灌胃 0. 01 mL· g － 1蒸馏水;阳性对照组每日灌胃
阳性药 0. 01 mL· g － 1(尼尔雌醇片按 1. 7 mg·kg － 1·
d － 1给药;己烯雌酚片按 0. 35 mg·kg － 1·d － 1给药)。
各给药组按临床用药的 20 倍量 ×提取率计算，配成
相应浓度的混悬液，每日按 0. 01 mL· g － 1灌胃。所
有小鼠给药期间均自由进食饮水。持续给药 7 d，最
后 1 次给药 24 h，摘除眼球取血，脱颈处死小鼠，迅
速剥离子宫称重。
子宫系数 =子宫湿重 /体重 × 100%
2. 2 卷柏提取物的 HPLC 指纹图谱分析［18］
Agilent Zorbox SB-C18色谱柱(4. 6 mm × 250 mm，5
μm)，流动相甲醇-0. 2%磷酸梯度洗脱，洗脱条件见
表 1，流速 0. 8 mL·min － 1，检测波长 337 nm，柱温 30
℃，进样量 10 μL。
表 1 卷柏提取物的 HPLC 指纹图谱的梯度洗脱条件
t /min A(甲醇)/% B(0. 2%磷酸)/%
0 30 70
30 100 0
38 30 70
2. 3 统计方法 试验结果用 珋x ± s 表示，应用 SPSS
13. 0 软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)
统计处理，P ＜ 0. 05 为有显著性差异。
3 结果
3. 1 聚酰胺柱分离法中卷柏各部位对性未成熟小
鼠子宫系数的影响 卷柏总部位组小鼠子宫系数增
加，与空白组比具有显著性差异(P ＜ 0. 01);卷柏
水、50%乙醇、80%乙醇部位与空白组比无统计学差
异，见表 2。
表 2 聚酰胺柱分离法中卷柏各部位对性未成熟小鼠子宫系数的影响(珋x ± s，n = 10)
组别 给药剂量 / g·kg － 1·d － 1 体重 / g 子宫湿重 /mg 子宫系数 /%
空白 － 16． 58 ± 1． 02 14． 10 ± 3． 09 0． 090 ± 0． 015
尼尔雌醇 0． 001 7 14． 11 ± 1． 05 69． 95 ± 8． 84 0． 551 ± 0． 1012)
卷柏总部位 0． 293 16． 53 ± 1． 06 32． 66 ± 10． 84 0． 245 ± 0． 0711，2)
卷柏水部位 0． 097 17． 25 ± 1． 23 19． 59 ± 3． 35 0． 119 ± 0． 0152)
卷柏 50%部位 0． 085 16． 71 ± 0． 95 16． 89 ± 3． 62 0． 116 ± 0． 0142)
卷柏 80%部位 0． 037 17． 76 ± 1． 95 19． 13 ± 4． 18 0． 123 ± 0． 0202)
注:与空白对照组比较1)P ＜ 0. 01;与尼尔雌醇组比较2)P ＜ 0. 01(表 3 ～ 4 同)。
上述结果显示，卷柏总部位经聚酰胺柱分离后，
各部位对小鼠子宫无明显作用，无法明确卷柏发挥
雌激素样作用的活性部位，说明此种分离方法不适
合于卷柏雌激素活性部位的提取和分离。
因此，我们改用 95% 乙醇回流药渣水提的方
法，对得到的不同部位进行雌激素活性成分的筛选。
3. 2 95%乙醇回流药渣水提法中卷柏各提取物对
性未成熟小鼠子宫系数的影响 卷柏药渣水提高剂
量组小鼠子宫系数增加，与空白组比具有显著性差
异(P ＜ 0. 01);卷柏药渣水提低剂量，95% 醇提高、
低剂量组均与空白组比无统计学差异，见表 3。
表 3 卷柏各提取物对性未成熟小鼠子宫系数的影响(珋x ± s，n = 10)
组别 给药剂量 / g·kg － 1·d － 1 体重 / g 子宫湿重 /mg 子宫系数 /%
空白 － 14． 49 ± 1． 54 17． 14 ± 5． 39 0． 104 ± 0． 017
己烯雌酚 0． 000 35 13． 25 ± 2． 85 70． 53 ± 10． 16 0． 596 ± 0． 0701)
药渣水提物 0． 235 14． 29 ± 2． 04 16． 70 ± 2． 58 0． 125 ± 0． 0182)
0． 470 14． 24 ± 1． 54 21． 83 ± 5． 98 0． 193 ± 0． 0511，2)
95%醇提物 0． 235 15． 03 ± 1． 74 16． 28 ± 3． 01 0． 138 ± 0． 0402)
0． 470 14． 67 ± 1． 44 16． 08 ± 3． 71 0． 131 ± 0． 0122)
上述结果显示，95%乙醇回流药渣水提法中，卷
柏药渣水提物对小鼠子宫有明显的增重作用，而
95%醇提物无明显作用。综上可知，卷柏中水溶性
成分可能为其发挥雌激素作用的有效部位。
卷柏药渣水提物为 95%醇提后药渣水煎所得，
含有大量的多糖类成分，多糖类化合物具有调节免
疫、抗炎、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、降糖降脂、抗凝
血、类似肾上腺皮质激素和促肾上腺皮质激素的作
用［19］。为进一步明确卷柏中发挥雌激素作用的物
质，我们对卷柏药渣水提物去除多糖进行雌激素活
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郑晓珂，等:卷柏中雌激素类成分的提取
性筛选。
3. 3 卷柏药渣水提物去多糖前后各组分对性未成
熟小鼠子宫系数的影响 卷柏药渣水提物，药渣水
提物去多糖组小鼠子宫系数均增加，与空白组比具
有显著性差异(P ＜ 0. 01);卷柏多糖组与空白组比
无统计学差异，见表 4。
表 4 卷柏药渣水提物去多糖前后各组分对小鼠子宫系数的影响(珋x ± s，n = 10)
组别 给药剂量 / g·kg － 1·d － 1 体重 / g 子宫湿重 /mg 子宫系数 /%
空白 － 14． 41 ± 0． 09 13． 86 ± 1． 37 0． 081 ± 0． 010
己烯雌酚 0． 000 35 13． 33 ± 1． 19 66． 54 ± 15． 60 0． 433 ± 0． 0461)
药渣水提物 0． 470 15． 60 ± 1． 73 16． 40 ± 2． 13 0． 119 ± 0． 0161，2)
药渣水提物去多糖 0． 071 15． 29 ± 0． 88 18． 50 ± 2． 30 0． 134 ± 0． 0071，2)
卷柏多糖 0． 375 15． 35 ± 1． 21 14． 50 ± 2． 39 0． 089 ± 0． 014
结果提示，卷柏药渣水提物对小鼠子宫有明显
的增重作用，且去多糖后对小鼠子宫的增重作用较
去多糖前更为明显，而卷柏多糖无明显作用，说明卷
柏中发挥雌激素作用的为水溶性除多糖物质。卷柏
药渣水提物去多糖后用药量大大减少，仅为去糖前
用量的 15. 1%，达到了临床用药量减效增的目的。
前期研究中发现，卷柏富含黄酮类化合物［7-9］，
且穗花杉双黄酮为卷柏总黄酮的主要成分［15，18］。
现代研究结果表明，植物雌激素主要包含 4 类:黄酮
类，木脂素类，二苯乙烯类和香豆素类化合物［20］。
为明确卷柏中黄酮类化合物是否也是其发挥雌激素
作用的成分，本实验以穗花杉双黄酮为对照品，对药
渣水提物、95%醇提物进行 HPLC 指纹图谱分析，以
期初步判断可能的有效成分。
3. 4 以穗花杉双黄酮为标准对照品，对卷柏 95%
醇提物、药渣水提物进行 HPLC 指纹图谱分析 结
果显示，穗花杉双黄酮为卷柏 95%醇提物的主要成
分，而药渣水提物中基本不含穗花杉双黄酮(图 1)。
图 1 卷柏 95%醇提物、药渣水提物的 HPLC
A. 对照品;B. 95%醇提物;C. 药渣水提物;1. 穗花杉双黄酮
4 讨论
子宫含有大量的雌激素受体(ERs)，雌激素或
具有雌激素活性的化合物通过与该受体结合，可诱
导子宫靶蛋白(IPs)含量增加，表现为子宫组织增
生［21］，因此通过测定外来激素对性未成熟小鼠促子
宫增长作用强弱评价药物的雌激素活性大小［22］。
本实验采用性未成熟雌性小鼠子宫湿重与体重之比
(子宫系数)作为评价雌激素活性的指标。
本实验室前期采用传统的 4 部位分离法，即卷
柏水煎煮提取液浓缩后依次用乙醚、醋酸乙酯、正丁
醇萃取，分别得到乙醚、醋酸乙酯、正丁醇和水部
位［12］，此种分离方法因使用大量有机溶剂，不适合
工业化大生产。在此基础上，改用适合于工业化大
生产的方法，即聚酰胺柱分离法。小鼠子宫增重试
验结果显示，卷柏总部位经聚酰胺柱分离后的各部
位对小鼠子宫的增重作用与空白组比无明显差异，
该方法不适合于卷柏雌激素活性部位的提取分离。
在此基础上，本研究采用 95%乙醇回流药渣水
提法，对得到的 95%醇提物、药渣水提物进行筛选。
该法中卷柏药渣水提物高剂量组具有明显的雌激素
活性，而 95%醇提物与空白组比无明显差异。卷柏
药渣水提物含有大量的多糖类成分，多糖类物质具
有多种生物学活性，为了进一步明确卷柏中发挥雌
激素作用的成分，本实验对卷柏药渣水提物去除多
糖进行筛选。结果显示，卷柏药渣水提物去除多糖
后，用药量仅为去糖前的 15. 1%，仍能显著性增加
小鼠子宫系数，达到了临床用药量减效增的目的，同
时也说明水溶性除多糖物质为卷柏中发挥雌激素作
用的有效部位。
上述结果表明，与聚酰胺柱分离法相比，95%乙
醇回流药渣水提法更适合于卷柏雌激素活性部位的
提取分离。此法中，95%乙醇和水的极性相差较大，
且卷柏经 95% 乙醇回流后，药渣再对其水煎，从而
避免了极性相近化合物在不同部位的大量交叉和流
失，适合于对无法明确极性范围或极性范围较大的
中药活性成分的筛选研究。
进一步通过 HPLC 指纹图谱分析结果显示，卷
柏 95%醇提物中穗花杉双黄酮为其主要成分，而药
渣水提物中基本不含穗花杉双黄酮。提示穗花杉双
黄酮不是卷柏中发挥雌激素作用的主要成分。
中药发挥雌激素样作用，对子宫的增重作用受
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到多种因素的影响，如:种属、年龄、靶器官功能状
态、剂量、方式、时间及代谢产物等［23］。有研究报
道［24］小于 20 mg 的子宫放在自然环境中，由于自然
干燥作用，在 1 min 内可使子宫质量下降 3. 9%，2
min 内下降 7. 8%，3 min 下降 11. 5%。我们在处死
动物解剖取子宫时，需要迅速修剪去除附在子宫上
的组织、脂肪，然后称重。
本实验通过小鼠子宫增重试验，确定了 95%乙
醇回流药渣水提法更适合于卷柏雌激素活性物质的
提取分离，同时筛选出水溶性除多糖物质为卷柏中
发挥雌激素作用的有效部位;HPLC 指纹图谱结果
提示以穗花杉双黄酮不是卷柏发挥雌激素作用的主
要成分。卷柏中发挥雌激素作用的为何种单体化合
物，同时，卷柏是通过何种途径发挥雌激素样作用
的，还需要进一步的实验研究。
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［责任编辑 仝燕］
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郑晓珂，等:卷柏中雌激素类成分的提取