全 文 ：台湾青枣多酚氧化酶特性的研究
李粉玲 , 蔡汉权 , 周燕芳 , 侯惠萍　(韩山师范学院 ,广东潮州 521041)
摘要　采用分光光度法 ,对台湾青枣多酚氧化酶(PPO)的催化特性、最适波长、最适反应时间 、最适温度、最适 pH值、热稳定性等性质进
行了研究 ,同时研究了抗坏血酸、柠檬酸、L-半胱氨酸3种添加剂对台湾青枣多酚氧化酶活性的影响 ,以寻求在果品的保鲜以及果肉初加
工过程中抑制 PPO活性的各控制手段与果品加工的有机结合方法 ,为防止褐变提供有效、合理的措施。实验结果表明:以邻苯二酚为反
应底物时 ,台湾青枣多酚氧化酶催化氧化产物的最适波长为 420nm ,最佳反应时间为 20min ,最适反应温度为 30 ℃,最适 pH值为 6.8。90
℃水浴处理 5min该酶已基本失活。3种抑制剂对该酶均表现出不同的抑制效果。单一抑制剂对台湾青枣多酚氧化酶酶促褐变抑制效
果的强弱次序为:L-半胱氨酸>抗坏血酸>柠檬酸。其中 L-半胱氨酸的有效抑制浓度为 0.100 0%。
关键词　台湾青枣;多酚氧化酶;活性;褐变;抑制
中图分类号　Q946　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2007)21-06410-03
Study on Polyphenol Oxidase Properties of Taiwanese Cyan Jujube
LI Fen-ling et al　(Hanshan Normal University , Chaozhou ,Guangdong 521041)
Abstract　The polyphenol oxidase(PPO)properties of Taiwanese cyan jujube were studied with spectrophotometer , including its catalytic characteristics ,
maximum absorbption wavelength , optimum temperature , optimum pH , thermostability of enzyme and so on.It was also studied the effects of the inhibitors
ascorbic acid , citric acid and L-cysteine on the activity of PPO of Taiwanese cyan jujube.When catechol was used as substrate , the results showed that the
optimum conditions were as follows:λ=420 nm , pH=6.8 , t=30 ℃, the time of reactivity≈20 min for PPO.However, the PPO was inactivated in 90 ℃
water for 5min.Three kinds of inhibitors had different inhibition effects on PPO activity.The anti-browning effect sequence of single inhibitors was L-cys-
teine> ascorbic acid> citric acid.The effective concentration of inhibitor L-cysteine was 0.100 0%.
Key words　Taiwanese cyan jujube;Polyphenol Oxidase;Activity;Browning;Inhibition
　　多酚氧化酶(Po1yphenol oxidase ,PPO)是由核基因编码的
铜金属酶 ,其酶促褐变机制是:内源性酚类物质在多酚氧化
酶的催化下氧化生成醌 ,醌再相互作用生成高分子聚合物 ,
从而导致褐色素的生成 。它能催化两类不同的反应 ,可以使
一元酚羟基化 ,生成相应的邻二羟基化合物;也可以氧化邻
苯二酚生成醌[ 1] 。果实的褐变不仅影响外观 、降低营养价
值 ,而且往往是败坏不可食用的标志。近年来 ,对多酚氧化酶
在果品加工中的影响研究日益受到重视 ,在番荔枝 、橄榄 、中国
木瓜 、荔枝 、苹果 、葡萄等植物的加工中均有报道。但对台湾青
枣PPO的活性及影响活性因素的研究则未见报道。
台湾青枣由于品种成熟期差异 , 12月至次年 4月份有成
熟鲜果上市 ,新鲜果实的货架期较短 ,在水果贮藏及果品加
工中容易发生褐变。笔者主要采用分光光度法研究台湾青
枣多酚氧化酶(PPO)的催化特性 、最适波长 、最适反应时间 、
最适温度 、最适 pH值 、热稳定性等性质 ,同时研究了抗坏血
酸 、柠檬酸 、L-半胱氨酸 3种抑制剂对台湾青枣多酚氧化酶
活力的影响 ,以寻求在果品保鲜以及果肉初加工过程中抑制
PPO活性的各控制手段与果品加工的有机结合方法 ,为防止
褐变提供有效 、合理的措施 ,为果实贮藏保鲜及在果品加工
中保持其原有营养和风味提供有效方法 ,并为其在果品加工
的安全生产 ,提高产品质量 ,防止褐变 ,开发台湾青枣新的经
济价值提供理论依据 。
1　材料与方法
1.1　材料　青枣为市场购得的八成熟 、外观良好 、无机械损
伤 、新鲜的台湾青枣。
1.2　试剂和仪器　试剂:邻苯二酚 、抗坏血酸 、L-半胱氨酸 、
柠檬酸 、三氯乙酸 、磷酸二氢钠 、磷酸氢二钠 、氢氧化钠 、甘氨
酸等 ,以上试剂均为分析纯。
作者简介　李粉玲(1970-),女 ,广东汕头人 ,化学实验师,从事无机及
分析化学实验工作。
收稿日期　2007-05-25
　　仪器:722型光栅分光光度计(上海光学仪器有限公司);
PHS-3C精密 pH 计(上海精密科学仪器有限公司);T-214电
子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);LD-5型电动
离心机(江苏省荣华仪器制造有限公司);HH-2数显恒温水
浴锅(常州市华普达教学仪器有限公司);电冰箱 (BCD-
217YB Haier);研钵 、离心管 、试管若干。
1.3　方法
1.3.1　PPO的提取 。参考詹嘉红[ 2]的方法并稍作修改。台
湾青枣果实洗净去皮 ,去核 ,按 5∶6(W/V)比例加入预冷的
0.07mol/L pH值 6.5的磷酸盐缓冲溶液 ,冰浴捣碎至匀浆 ,
置冰箱浸提 30min ,取出解冻至室温(16 ℃)5 000 r/min离心
10min ,吸取上清液作为粗酶液提取液 ,0～ 4 ℃保存备用。
1.3.2　PPO最适波长及酶活的测定。参考胡青霞等[ 3]的方
法并略作修改 。
以邻苯二酚为底物 ,反应体系包括PPO提取液 2 ml ,0.2
mol/L邻苯二酚 1 ml , 0.2 mol/L pH值 6.5的磷酸盐缓冲液 1
ml 。在 30 ℃恒温水浴锅中保温 ,反应 20min后用酶液加 2 ml
磷酸缓冲溶液作对照[ 4] ,各加三氯乙酸(TCA)0.2ml。在波长
405～ 460nm ,每隔 10 nm 测定一次吸光度值 ,以波长为横坐
标 ,吸光度值为纵坐标 ,绘制吸收曲线 ,确定最适吸收波长
(λ)。酶的活性以最适吸收波长处比色的吸光度 A值表示。
1.3.3　PPO最佳反应时间的确定。分别取 2 ml粗酶液加入
反应体系(0.2 mol/L邻苯二酚 1ml 、0.2 mol/L pH 值 6.5的磷
酸盐缓冲液 1 ml)各在 30 ℃恒温水浴锅中保温 1、5 、10、20
min。酶液加 2 ml磷酸缓冲溶液作对照 ,测定吸光度值 ,以确
定台湾青枣PPO最佳反应时间。
1.3.4　PPO最适温度的测定及其热稳定性。反应体系在温
度 18～ 90 ℃条件下反应 20min ,然后测定吸光度值 ,以温度
为横坐标 ,以吸光度为纵坐标 ,作出吸光度—温度曲线 ,以确
定 PPO反应的最适温度。
分别取 2ml粗酶液在 70 、80 、90 ℃恒温 1、5、10、20min 。
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2007 , 35(21):6410-6412　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　孙红忠　责任校对　李菲菲
取出迅速冷却至室温[ 5] ,以 2 ml原粗酶提取液作为反应对
照 ,分别加入 0.2 mol/L pH 值 6.5的磷酸盐缓冲溶液 1 ml ,
0.2 mol/L邻苯二酚 1 ml 。反应 20min后 ,加入 0.2ml三氯乙
酸终止反应。于波长 420 nm处比色测定吸光度值 。比较不
同的灭酶方法对PPO反应体系的灭活效果。
1.3.5　pH值对PPO活性的影响。用磷酸二氢钠-柠檬酸 、
磷酸氢二钠-磷酸二氢钠 、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制同
一浓度不同 pH 值的缓冲液。取 2 ml PPO粗酶液 , 1 ml 0.2
mol/L邻苯二酚 , 1 ml 0.2 mol/L 不同 pH 值缓冲液混合均
匀[ 5] ,水浴 30 ℃下加热 20min后测定 PPO活性 ,以吸光度值
A表示。
1.3.6　几种添加剂对PPO活性的影响。处理对比组同上。
选用柠檬酸 、抗坏血酸 、L-半胱氨酸作为抑制剂进行单因素
实验。
配制浓度各为 0.05%抑制剂 ,分别取 0.5 ml加入反应体
系 ,以粗酶液对照测定吸光度值。作出吸光度—抑制浓度曲
线 ,比较相同浓度下各种抑制剂对台湾青枣PPO活性的影
响 ,以确定最佳抑制剂。
1.3.7　L-半胱氨酸浓度对PPO活性的影响。处理对比组同
上。配制质量浓度分别为 0.025 0%、0.037 5%、0.050 0%、
0.100 0%、0.200 0%、0.3000%的L-半胱氨酸 ,各取 1 ml加入
反应体系 ,于 30 ℃水浴恒温反应 20 min后加入 0.2 ml 三氯
乙酸终止反应。于波长 420 nm处比色测定吸光度值。
2　结果与分析
2.1　PPO最适波长的测定　由图 1可见 ,台湾青枣 PPO作
用生成产物最大吸收波长为 420 nm。其吸收光波值为0.490。
所以 ,以邻苯二酚为底物测定台湾青枣中PPO活性时 ,确定
420nm为最适测定波长 。此结果与汤凤霞等[ 6]在枇杷果浆
多酚氧化酶活性抑制的研究和熊何健等[ 4] 在荔枝壳中多酚
氧化酶活性研究一致 。
图 1　不同测定波长对 PPO活性的影响
2.2　反应时间对 PPO活性的影响　由图 2可见 ,在最初 5
min反应非常缓慢 ,5 min后 ,反应速度加快 ,当反应时间达 20
min时 ,酶促褐变的反应现象开始明显。故反应时间以 20
min为宜。
2.3　PPO最适温度的测定及其热稳定性　温度对多酚氧化
酶活性的影响是双重的。不同的酶 ,最适温度不同[ 7] 。由初
步实验得出 ,台湾青枣PPO的最适温度在 30 ℃左右。由图 3
可见 ,吸光度在低温范围内即 16 ～ 30 ℃,随温度的升高而升
高 ,当温度在 30 ℃前和 70 ℃后台湾青枣PPO活性很低。
低温贮藏可使食品自身体内酶活性下降 ,代谢减慢 ,从
而延长食品的储藏期 ,故是较理想的台湾青枣水果贮藏方
法。而在果品加工制作过程中 ,高温处理可有效抑制酶的褐
变。可以考虑结合瞬间高温处理的方法使其不可逆变性 ,减
少酶促褐变对后续加工的影响。
图 2　反应时间对 PPO活性的影响
图 3　反应温度对 PPO活性的影响
　　在探讨不同的温度条件下与灭酶所需要的时间的关系
时(表 1、图 4),发现 70 ℃以上高温处理均能使PPO活性显著
降低。在 90 ℃组的曲线呈略微上升现象 ,则可能是 PPO在
长时间的高温加热过程中加快其催化反应速度 ,与残留在粗
酶液中的酚类物质发生催化反应和发生了美拉德反应的缘
故[ 8] 。也可能是酶促反应产物醌类物质不稳定:由于PPO粗酶
液中可能含有抗坏血酸等抗氧化剂 ,生成的产物邻-醌被抗坏
血酸还原为邻苯二酚。
　　表1 台湾青枣 PPO的热稳定性与时间的关系
处理
时间
mm
70 ℃
吸光
度值
抑制
率∥%
80 ℃
吸光
度值
抑制
率∥%
90 ℃
吸光
度值
抑制
率∥%
1 0.382 46.3 0.505 30.0 0.251 64.7
5 0.520 26.9 0.283 60.2 0.224 68.5
10 0.329 53.7 0.245 65.5 0.260 63.4
20 0.323 54.6 0.242 66.0 0.270 62.0
　注:CK 吸光度值为 0.711。
2.4　pH值对 PPO活性的影响　由图 5可知 ,以邻苯二酚为
作用底物时台湾青枣 PPO的最适 pH值为 6.8。当 pH值<
5.0或>8.0时 ,台湾青枣 PPO活力已得到显著抑制 。由于
PPO是碱性的含铜蛋白质 ,pH值影响酶活性催化基团的解离
状态 ,在较强的酸性条件下 ,辅基铜将以铜离子的形式解离出
来 ,从而使酶失活。而在碱性条件下铜会解离成氢氧化铜 ,使
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酶活性显著降低[ 9] 。因此 ,调节 pH 值能有效抑制PPO活性 ,
可以减轻台湾青枣果品加工中酶促褐变的影响。
图 4　台湾青枣 PPO的热稳定性与时间的关系
图5　pH值对PPO活性的影响
2.5　几种添加剂对 PPO活性的影响　由表 2可见 ,当选用
相同浓度 0.05%的柠檬酸 、抗坏血酸 、L-半胱氨酸作为抑制
剂进行单因素实验时 ,其对台湾青枣PPO活性的抑制由强到
弱的排列次序是L-半胱氨酸>抗坏血酸>柠檬酸。其中 ,L-
半胱氨酸对台湾青枣 PPO活性的抑制效果最好 ,分别是抗坏
血酸的 2倍和柠檬酸的 6倍。
　　表 2 几种添加剂对 PPO活性的影响
抑制剂 吸光度值 抑制率∥%
CK 0.711 　　　　　　-
L-半胱氨酸 0.400 　　　　　　43.7
柠檬酸 0.656 7.7
抗坏血酸 0.574 19.3
　　3种添加剂均对台湾青枣PPO活性有一定的抑制作用 ,
在果品加工过程中可根据经济价格因素 、绿色食品加工要
求 ,采用各不同抑制剂的适量浓度来作为有效抑制台湾青枣
酶促褐变的措施。
2.6　L-半胱氨酸浓度对PPO活性的影响　由表3可见 ,L-半
胱氨酸对台湾青枣PPO活性的抑制效果很明显。在质量浓度
为 0.025 0%时抑制率已达 25.5%。并在质量浓度为0.100 0%
时突增至 68.6%,其浓度为 0.200 0%和 0.300 0%呈稍微下
降的趋势。
　　表3 L-半胱氨酸浓度对 PPO活性的影响
质量浓
度∥%
吸光
度值
抑制率
%
质量浓
度∥%
吸光
度值
抑制率
%
CK 0.411 - 0.100 0 0.129 68.6
0.025 0 0.306 25.5 0.200 0 0.133 67.6
0.037 5 0.303 26.3 0.300 0 0.153 62.8
0.050 0 0.289 29.7
3　结论
(1)台湾青枣PPO的酶促褐变产物在可见光波长 420 nm
处有最大吸收峰。最佳反应时间为 20min ,最适 pH值为6.8 。
台湾青枣PPO对热较敏感 ,其最适温度为 30 ℃。
(2)当温度在 30 ℃前台湾青枣活性很低 ,低温贮藏方法
仍是台湾青枣较理想的贮藏方法。在 70～ 90 ℃的高温条件
下加热PPO均有较明显的钝化效果。因此 ,在果品加工中可
以结合利用瞬间高温灭酶的方法作为抑制褐变的措施。
(3)当 pH值<5.0或>8.0时 ,台湾青枣 PPO活力已得
到显著抑制。因此调节 pH值能有效抑制PPO活性 ,可以减
轻台湾青枣果品加工中酶促褐变的影响。
(4)柠檬酸 、抗坏血酸 、L-半胱氨酸对台湾青枣PPO活性
均有一定的抑制作用。在相同浓度下 ,对台湾青枣 PPO活性
的抑制由强到弱的排列次序是 L-半胱氨酸>抗坏血酸>柠
檬酸 。其中 , L-半胱氨酸在使用质量浓度为 0.100 0%时已有
很明显的抑制效果 ,其抑制率达 68.6%。
(5)低温能较好地抑制酶促褐变 ,与低温能较好地保存
果实中的抗坏血酸不无关系[ 10] 。而且抗坏血酸在酸性溶液
中较稳定。故在果肉初加工过程中可结合调节温度 、pH值 、
添加抑制剂等抑制PPO活性的手段与果品加工的有机结合
方法 ,有效 、合理防止褐变。
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