全 文 ：不同产地哈药白喉乌头基因多态性的 ISSＲ分析
高福春1，孙 芸2，张 静1，张 帆1*
(1. 新疆医科大学中药系，新疆 乌鲁木齐 830011;2. 新疆名医名方与特色方剂重点实验室，新疆 乌鲁木
齐 830011)
摘要 目的:探讨白喉乌头种群间的遗传多样性和变异情况，并为乌头类药材之间的准确鉴定提供本质特征。
方法:利用植物基因组提取试剂盒提取 DNA，采用紫外分光光度法检测 DNA的浓度和纯度，使用 60 个引物分别对
10 个不同产地的白喉乌头野生种群样本的基因进行 ISSＲ 分析，应用 POPGEN32 和 NTSYS-PC 对所得数据进行处
理，得出不同产地白喉乌头的遗传相似系数和遗传距离，采用非加权平均法(UPGMA)进行聚类分析。结果:从 60
个引物中筛选出 11 个条带清晰、多态性明显并且重复性好的引物用于扩增，共扩增得到 101 个条带，其中多样性
条带 89 条，多态位点百分率(PPB)为 88. 1%，Shannon多样性指数(I)为 0. 5298，遗传相似系数(H)为 0. 3648，观察
等位基因数(Na)和有效等位基因数(Ne)分别为 1. 8911 和 1. 6555，遗传一致度在 0. 4950 ～ 0. 6931 之间，遗传距离
范围在 0. 3666 ～ 0. 7031 之间;根据 ISSＲ 聚类结果可将 10 个不同产地的白喉乌头聚为 5 大类群。结论:白喉乌头
种质资源间具有很高的多态性，遗传变异较大;可为种质资源遗传多样性提供分子水平的依据，为构建 DNA 指纹
图谱奠定基础。
关键词 白喉乌头;毛茛科;乌头属;ISSＲ;遗传多样性
中图分类号:Ｒ282. 5 文献标志码:A 文章编号:1001-4454(2014)01-0026-04
收稿日期:2013-06-13
基金项目:国家自然科学基金(81160547)
作者简介:高福春(1984-) ，女，硕士，研究方向:民族药材分子鉴定。
* 通讯作者:张帆，Tel:0991-4361850，E-mail:zhangfan596@ 163. com。
ISSＲ Analysis for Genetic Polymorphism of Aconitum leucostomum from Different Habitats
GAO Fu-chun1，SUN Yun2，ZHANG Jing1，ZHANG Fan1
(1. Chinese Medicine Department，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China;2. Xinjiang Laboratory of Famous Prescription
and Science of Formulas，Urumqi 830011，China)
Abstract Objective:To investigate the genetic diversities and variations of Aconitum leucostomum，and to supply essential charac-
teristics for identifying Aconitum crude drugs. Methods:Plant genome extraction kit was applied to extract DNA，and ultraviolet spectro-
photometer was used to detect the concentrations and purity of DNA. 60 ISSＲ primers were screened to analyze the DNA of Aconitum
leucostomum from 10 habitats. Biosoftwares including POPGEN32 and NTSYS-PC were used to analyze the polymorphic bands obtained，
and hence to yield the genetic similarity coefficient of the 10 habitats and map the related graphics，and cluster analysis were performed
by UPGMA method. Ｒesults:11 primers selected from 60 ISSＲ primers were used for amplification and a total of 101 DNA bands were
obtained，including 89 polymorphic bands，the average percentage of polymorphic bands(PPB)was 88. 1% . Shannon information index
(I)was 0. 5298，the genetic similarity coefficient(H)was 0. 3648，observed number of alleles was 1. 8911，and effective number of al-
leles was 1. 6555. The genetic identity was from 0. 4950 to 0. 6931，and the genetic distances were from 0. 3666 to 0. 7031. According to
cluster analysis result of ISSＲ，the 10 habitats of Aconitum leucostomum were classified into five groups. Conclusion:Germplasm re-
sources of Aconitum leucostomum show abundant polymorphism and higher genetic variation，which might supply molecular level basis，
and provide basis for building DNA fingerprint.
Key words Aconitum leucostomum Worosch;Ｒanunculaceae;Aconitum genus;Inter-Simple Sequence Ｒepeat;Genetic diversity
白喉乌头 Aconitum leucostomum Worosch 为毛
茛科乌头属多年生草本植物，主要分布于新疆天山
山脉海拔 1 400 ～ 2 300m的山坡草地和林缘〔1〕。白
喉乌头在西北地区被当作川乌和草乌的替代品使
用，同时也是哈萨克族的传统药材，主要用于止痛、
除湿、祛风寒，其块根曾被收载于前苏联的国家药典
中，酊剂外用为神经痛、牙痛、关节炎及其他各种疼
痛时的镇痛剂〔2〕。
目前，白喉乌头与其他野生乌头资源广泛分布
于新疆各山地与草原，由于药材混淆使用问题日益
突出，使得药材质量参差不齐，严重影响了该类药材
的研究与临床疗效，而传统方法又无法提供药材之
间本质差异。随着分子生物学的发展，分子标记技
术已应用到中药遗传关系的研究中〔3〕，为药材物种
的分类鉴定提供了更为准确的方法。本实验采用
ISSＲ标记方法对 10 个不同产地白喉乌头种群的
·62· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 37 卷第 1 期 2014 年 1 月
DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2014.01.008
DNA图谱进行分析，研究其种群间的遗传多样性及
变异情况，为从 DNA分子水平上对白喉乌头药材进
行鉴定和药材的规范使用提供依据。
1 材料
1. 1 仪器 My cycler PCＲ 仪(美国 BIO-ＲAD 公
司) ;Gel Doc紫外凝胶成像系统(美国 BIO-ＲAD 公
司) ;ND1000 超微量紫外分光光度计(美国 Thermo
Fishers公司) ;电泳仪(北京市六一仪器厂) ;JY-SPC
电泳槽(北京君意东方电泳设备有限公司) ;Centri-
fuge 5804 高速冷冻离心机(德国 Eppendorf公司)。
1. 2 试药 白喉乌头鲜药材于 2012 年 7 月采自新
疆伊犁新源县、昭苏县、特克斯县、巩留县等不同地
区的草原，共 10 个代表性的白喉乌头种群(表 1)。
每个种群采 10 株以上的个体，单株距离 30 m以上。
野外采集的白喉乌头新鲜叶片立即放入装有硅胶的
密封盒中，经笔者张帆教授鉴定为毛茛科植物白喉
乌头 Aconitum leucostomum Worosch 的全草，凭证标
本保存于新疆医科大学中药民族药博物馆。
表 1 白喉乌头种群产地
样品编号 产地 样品编号 产地
1 新源县那拉提 6 特克斯县科桑山
2 尼勒克县乔尔玛 7 特克斯县科桑草原
3 昭苏县夏塔 8 哈巴河县白哈巴
4 巩留县塔里木 9 哈巴河县林场
5 霍城县果子沟 10 布尔津县禾木
植物基因组 DNA提取试剂盒(北京天根生物技
术有限公司) ;哥伦比亚 UBC 系列引物(上海生工生
物有限公司) ;PCＲ 试剂盒(TaqDNA 聚合酶、dNTPs、
MgCl2、反应缓冲液，北京博迈德生物公司) ;琼脂糖、
溴化乙锭(EB)、氯仿和 β-巯基乙醇均为分析纯。
2 方法与结果
2. 1 药材基因组 DNA 提取与纯度检测 每种群
白喉乌头分别随机取至少 5 株以上的干燥叶，约 50
mg，采用快速干磨法研磨，按照北京天根生物科技
有限公司植物基因组 DNA 提取试剂盒的步骤，
CTAB法提取基因组 DNA。
用超微量紫外分光光度计检测 DNA 的纯度和
浓度、1%琼脂糖凝胶电泳分析 DNA 的完整性，在
Gel Doc紫外凝胶成像系统上观察并保存图像。提
取的基因组 DNA的 OD260 /OD280值在 1. 72 ～ 1. 88 之
间，表明 DNA浓度和纯度均满足要求，符合 ISSＲ扩
增反应对 DNA的质量要求。将基因组 DNA样品稀
释，浓度为 40 ～ 50 ng /μL。
2. 2 ISSＲ引物的筛选 利用上海生工生物有限公
司合成的哥伦比亚 UBC系列引物共 60 条，20 μL的
反应体系进行扩增筛选;每条引物用若干样品 DNA
模板再加 1 个灭菌双蒸水作空白对照，筛选出电泳
条带清晰、稳定、多态性强、重复性好的 11 条引物用
于遗传多样性分析(见表 2)。
表 2 筛选出 ISSＲ分析所用的引物及扩增结果
序号 引物 序列 退火温度 /℃ 扩增带数 多态条带 多态条带的百分率 /%
1 UBC807 (AG)8T 50. 3 11 10 90. 9
2 UBC808 (AG)8C 55 9 9 100
3 UBC810 (GA)8 T 50. 3 8 8 100
4 UBC840 (GA)8YT 52. 5 10 9 90
5 UBC842 (GA)8YG 53. 6 7 4 57. 1
6 UBC856 (AC)8YA 52. 5 8 7 87. 5
7 UBC868 (GAA)6 44. 4 9 8 88. 9
8 UBC873 (GACA)4 51. 5 13 12 92. 3
9 UBC880 (GGAGA)3 51. 5 10 9 90
10 UBC881 (GGGTG)3 59. 5 7 6 85. 7
11 UBC888 BDB(CA)7 53. 8 9 7 77. 8
总 数 101 89
平均数 9. 2 8. 1 88. 1
2. 3 ISSＲ扩增 以 10 个种群的白喉乌头的 DNA
为模板，分别用 11 条不同引物进行扩增。ISSＲ反应
总体系为 20 μL:2 × Taq PCＲ Master Mix 10 μL，其
中 Taq DNA Polymerase(recombinant) :0. 05 units /
μL;MgCl2:4 mmol /L;dNTPs(dATP，dCTP，dGTP，dT-
TP) :0. 4 mmol /L，模板 DNA 2 μL，引物 2 μL，其余
用 6 μL灭菌双蒸水补至总体积为 20 μL，每个引物
均设 1 个空白对照反应，即将反应体系中的模板换
为双蒸水，排除系统误差。反应程序为:95 ℃预变
性 4 min;每循环在 95 ℃变性 30 s，50. 3 ～ 59. 5 ℃退
·72·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 37 卷第 1 期 2014 年 1 月
火 45 s，72 ℃延伸 90 s，共 35 个循环;72 ℃总延伸 7
min。用 2. 0%琼脂糖凝胶电泳分离检测扩增产物，
电泳缓冲液为 1 × TBE 电泳，EB 染色，以 2 000 bp
marker作为对照，电压为 100 V，电泳 45 min，后用
Gel Doc紫外凝胶成像系统上检测拍照(见图 1) ，扩
增出的 DNA片段均在 250 ～ 2 000 bp之间。
图 1 引物 UBC842 对 10 个产地白喉乌头基因组 DNA的 ISSＲ扩增图谱
2. 4 数据统计与分析 对凝胶紫外成像系统中重
复性好且清晰的条带记数。对照反应产物在胶上的
位置，将迁移率相同的带作为同源位点处理，得到 1、0
数据(有带计为 1，无带计为 0)矩阵。采用 POP-
GEN32软件分析多态位点百分率(PPB)、Shannon 多
样性指数(I)和 Neis 遗传一致度和遗传距离(见表
3)。用 NTSYS-PC 软件按照 UPGMA 法进行聚类分
析，构建不同种源间的遗传关系树状图(见图 2)。
表 3 10 个产地白喉乌头遗传一致度(对角线上方)和遗传距离(对角线下方)
pop 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 ＊＊＊＊ 0. 6139 0. 5743 0. 5743 0. 5149 0. 6040 0. 5644 0. 5545 0. 5446 0. 5347
2 0. 4880 ＊＊＊＊ 0. 6634 0. 6040 0. 5842 0. 5743 0. 5347 0. 5446 0. 5941 0. 6832
3 0. 5547 0. 4104 ＊＊＊＊ 0. 6832 0. 6040 0. 5941 0. 6733 0. 5842 0. 5941 0. 5644
4 0. 5547 0. 5042 0. 3810 ＊＊＊＊ 0. 5446 0. 6139 0. 6931 0. 5842 0. 5545 0. 5644
5 0. 6639 0. 5376 0. 5042 0. 6078 ＊＊＊＊ 0. 6931 0. 6139 0. 5446 0. 4950 0. 5842
6 0. 5042 0. 5547 0. 5208 0. 4880 0. 3666 ＊＊＊＊ 0. 6832 0. 6139 0. 5644 0. 5743
7 0. 5721 0. 6261 0. 3956 0. 3666 0. 4880 0. 3810 ＊＊＊＊ 0. 6535 0. 5644 0. 5941
8 0. 5898 0. 6078 0. 5376 0. 5376 0. 6078 0. 4880 0. 4255 ＊＊＊＊ 0. 6931 0. 6040
9 0. 6078 0. 5208 0. 5208 0. 5898 0. 7031 0. 5721 0. 5721 0. 3666 ＊＊＊＊ 0. 5743
10 0. 6261 0. 3810 0. 5721 0. 5721 0. 5376 0. 5547 0. 5208 0. 5042 0. 5547 ＊＊＊＊
图 2 10 个产地白喉乌头 ISSＲ结果聚类分析图
从表 3看出，白喉乌头各种群间的遗传一致度变
化范围在 0. 4950 ～ 0. 6931 之间，遗传距离的变化范
围在 0. 3666 ～0. 7031之间;多态性位点百分率(PPB)
为 88. 1%;Shannon多样性指数(I)为 0. 5298;遗传相
似系数(H)为 0. 3648，观察等位基因数(Na)和有效
等位基因数(Ne)分别为 1. 8911和 1. 6555。
3 讨论
实验从 60 条 UBC引物中筛选出符合要求的 11
条引物进行扩增，产物集中在 150 ～ 2 000 bp。其多
态性表现不同，共扩增出 101 条清晰且重复性好的
DNA条带，有 89 条属多态条带，每个引物所扩增出
来的 DNA条带数目在 7 ～ 13 条之间，平均每个引物
扩增出 9. 2 条，总多态百分比为 88. 1%，其中引物
UBC808 和 UBC810 扩增的多态条带百分比最高，为
100%。表明白喉乌头种质资源间具有很高的多态
性，遗传变异较大。Shannon 多样性指数和 Neis 指
数既可以反映条带的丰富程度，又可以反映均匀程
度，而丰富度与均匀度是衡量多样性的 2 个重要指
标〔4〕。在亲缘关系上，遗传距离越小，遗传一致性
越大，药材间的亲缘关系也就越近，在 10 个产地的
·82· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 37 卷第 1 期 2014 年 1 月
药材中，亲缘关系最近的是地理距离比较近的哈巴
河县白哈巴和哈巴河县林场以及霍城县果子沟和特
克斯县科桑山，种群间遗传一致度为 0. 6931，遗传
相似系数最大;遗传距离最大的霍城县果子沟与哈
巴河县林场，种群遗传一致度最低，地理距离相对也
比较远，但是介于两者之间的药材间遗传分化没有
表现出和地理距离明显的相关性，在基于遗传分析
的树系图上，相对地理距离较近特克斯县科桑山和
特克斯县科桑草原的白喉乌头并没有完全聚在一
起，表明地理距离在白喉乌头的遗传分化中可能并
非主导因素。
10 个不同产地的白喉乌头可聚为 5 大类群。
产自新源县那拉提的白喉乌头单独聚为一类;产自
尼勒克县乔尔玛和布尔津县禾木的白喉乌头聚为一
类，说明这 2 个产地的白喉乌头亲缘关系较近;产自
巩留县塔里木和特克斯县科桑草原的白喉乌头先聚
为一类，又和昭苏县夏塔的白喉乌头聚为一大类，说
明这 3 个产地的白喉乌头亲缘关系较近;霍城县果
子沟和特克斯县科桑山的白喉乌头聚为一类;哈巴
河县白哈巴和哈巴河县林场的白喉乌头聚为一类，
这说明亲缘关系也很近。
从 ISSＲ 指纹图谱中可以看出，10 个种群间的
谱带存在着不同程度的差异，可能由于不同区域的
土壤、日照、降水等差异的影响，使其发生遗传上的
分化，其他遗传分化的因素还需要结合生殖生物学
与生态学方面的研究给出综合评价。因此，ISSＲ 分
子标记能有效揭示不同地区白喉乌头的多样性，为
白喉乌头种质资源遗传多样性、DNA 指纹图谱提供
分子水平依据。但是白喉乌头差异遗传片段与药效
的相关性还有待进一步研究。
参 考 文 献
［1］关克俭．中国植物志［M］．第 27 卷．北京:科学出版社，
1979:308-310．
［2］刘悦，蔡冬梅，哈木拉提·吾甫尔，等．白喉乌头的生药
鉴别［J］．中药材，2011，34(7) :1047-1049．
［3］朱岩芳，祝水金，李永平，等． ISSＲ 分子标记技术在植物
种质资源研究中的应用［J］．种子，2010，29(2) :55-59．
［4］梁呈元，刘艳，李维林，等．薄荷属植物遗传多样性的 IS-
SＲ分析［J］．中药材，2011，34(8) :1190-1193．
·加工炮制与养护·
基于多指标质量评价技术研究不同干燥方法对三棱品质的影响
贺潇潇，吴启南* ，王新胜，陈广云，陈 蓉，沈 蓓
(南京中医药大学，江苏 南京 210023)
摘要 目的:揭示各种干燥方法对三棱品质的影响，从而优选三棱的最佳干燥方式。方法:基于已建立的三棱
多指标质量评价技术体系，分别采用阴干、晒干、烘干、红外干燥、微波干燥的方法对三棱进行处理，以酚类(对羟基
苯甲醛、香草酸、对香豆酸、阿魏酸、芦丁、山柰酚、芒柄花素)、多糖、总皂苷、总酚为指标，通过高效液相色谱法及紫
外分光光度法，分析三棱中各类成分的含量变化情况。结果:采用微波干燥，三棱中的酚类、多糖及总酚含量最高，
采用烘干方法，三棱中的总皂苷含量最高。结论:不同干燥方法对三棱品质有明显影响。
关键词 黑三棱;干燥方法;多指标质量评价;成分;品质
中图分类号:Ｒ283. 3 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2014)01-0029-06
收稿日期:2013-05-22
基金项目:国家自然科学基金(81073002) ;江苏高等学校“中药资源化学研究”优秀科技创新团队(2011) ;江苏省中药资源产业化过程协
同创新中心(2011) ;江苏省六大人才高峰项目(2010)
作者简介:贺潇潇(1989-) ，女，在读硕士研究生，专业方向:中药品质评价研究;Tel:15851815650，E-mail:stitch0204@ 163. com。
* 通讯作者:吴启南，Tel:025-85811507，E-mail:qnwyjs@ 163. com。
Influence of Different Drying Methods on the Quality of Sparganii Ｒhizoma
Based on Multi-index Evaluation
HE Xiao-xiao，WU Qi-nan，WANG Xin-sheng，CHEN Guang-yun，CHEN Ｒong，SHEN Bei
(Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China)
Abstract Objective:To study the influence of different drying methods on the quality of Sparganii Ｒhizoma and obtain the optimal
one. Methods:Based on multi-index evaluation technology，Sparganii Ｒhizoma was processed using five drying methods including drying
·92·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 37 卷第 1 期 2014 年 1 月