全 文 ：229※营养卫生 食品科学 2010, Vol. 31, No. 09
琐琐葡萄多糖对小鼠免疫功能的影响
俞 丹 1，赵 军 2，刘 涛 1，苏德奇 1，马 龙 1,*
(1. 新疆医科大学公共卫生学院卫生毒理教研室，新疆 乌鲁木齐 830011；
2. 新疆药物研究所维吾尔药研究开发重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830002)
摘 要：目的：探讨琐琐葡萄多糖(VTP)对小鼠免疫功能的影响。方法：经热水提取、乙醇沉淀提取得到VTP，
采用苯酚 -硫酸法测定多糖含量，应用环磷酰胺制备免疫低下小鼠模型，通过测定给药后小鼠脾脏及胸腺指数、抗
体分泌细胞功能、血清溶血素水平和脾淋巴细胞转化功能，研究VTP对免疫低下小鼠免疫功能的影响。结果：提
取得到VTP粗品并测得其中多糖含量为 20.68%，RSD为 1.93%；与模型组相比，VTP可增加免疫低下模型小鼠脾
脏的质量，有效促进小鼠脾淋巴细胞的转化功能，明显改善小鼠抗体分泌细胞的功能，并可使红细胞半数溶血值
显著增高。结论：VTP 对免疫低下模型小鼠的体液免疫功能和细胞免疫功能具有一定的保护作用。
关键词：琐琐葡萄；多糖；免疫功能
Effect of Polysaccharides from Vitis viniferal L. on Immune Function in Mice
YU Dan1，ZHAO Jun2，LIU Tao1，SU De-qi1，MA Long1,*
(1. Department of Toxicology, College of Public Health, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China；2. Xinjiang Key
Laboratory for Research and Development of Uighur Drugs, Institute of Materia Medica of Xinjiang, Urumqi 830002, China)
Abstract ：Objectives: To study the effect of polysaccharides from Vitis viniferal L. (VTP) on immune function in mice. Methods:
VTP was extracted using water and precipitated using 95% ethanol. The content of VTP was assayed with phenol-vitriolic
colorimetry. Immunosuppressed mice were induced by cyclophosphamide and their indices of thymus and spleen, antibody-
secreting cell function, serum hemolysin level and lymphocyte transformation capability were measured. Results: The content
of polysaccharides in VTP crude extract was 20.68% with the RSD of 1.93%. Compared with the model group, VTP could
increase spleen weight of mice, significantly promote lymphocyte transformation capability and antibody-secreting cell function,
and improve serum hemolysin level. Conclusion: VTP could improve both humoral immune function and cellular immune
function of immunosuppressed mice.
Key words：Vitis viniferal L.；polysaccharides；immune function
中图分类号：TQ929.2 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)09-0229-05
收稿日期：2009-06-26
基金项目：国家自然科学基金项目(30660157)
作者简介：俞丹(1982—)，女，硕士研究生，研究方向为新疆特色药食兼用植物的开发应用。E-mail：YDWWL@163.com
*通信作者：马龙(1957—)，男，教授，硕士，研究方向为新疆特色药食兼用植物的开发应用。E-mail：xjmult@163.com
琐琐葡萄(Vitis amurensis)为葡萄科葡萄属植物葡萄
(Vitis vinifral L.)的成熟果实，属小无核红葡萄品系，木
质藤本，主产于新疆吐鲁番、和田、鄯善等地，是
医药文献如《神农本草经》、《本草纲目拾遗》、《维
吾尔药志》等所记载的药用葡萄品种之一[1]。维吾尔医
用于治疗脾胃不和、头晕腰酸、神志不安等，民间主
要用于小儿麻疹、肝炎等症，具有良好的临床效果[ 2]。
琐琐葡萄中除含有大量的葡萄糖、果糖、维生素、氨
基酸等营养成分外，还有多糖、鞣质类、黄酮、萜
类、甾类、白藜芦醇等多种生物活性物质[ 3 -4 ]，其中多
糖含量较高。植物多糖作为一类重要的天然活性物质，
具有增强免疫、抗氧化、抗肿瘤、降血压、降血脂、
降血糖、抗衰老、抗辐射等多种药理作用[ 5 ]，其最大
优点是来源广泛，毒副作用小，已成为近年来天然药
物的研究热点之一。本实验从琐琐葡萄药材中得到活性
物质多糖，并研究其对免疫低下模型小鼠的免疫保护作
用，以期为深入研究琐琐葡萄多糖的免疫调节机制及相
关保健食品或药品的开发提供参考。
1 材料与方法
... .
... .
2010, Vol. 31, No. 09 食品科学 ※营养卫生230
1.1 材料与试剂
琐琐葡萄购自新疆维吾尔自治区吐鲁番维吾尔医药
市场，经专家鉴定为葡萄科葡萄属植物琐琐葡萄(Vit is
viniferal L.)的成熟果实。
螺旋藻 美国联合邦利生物工程国际集团有限公
司；环磷酰胺 江苏恒瑞医药股份有限公司；RPMI1640
细胞培养液、胎牛血清 美国 Hyclone公司；刀豆蛋
白 A(ConA)、四甲基偶氮唑蓝(MTT) 美国 Sigma公
司；Hank s液(pH7.2～7.4)、绵羊红细胞悬液(SRBC)、
补体(豚鼠血清) 本实验室自制。
9 5 % 乙醇、无水乙醇、乙醚、丙酮、苯酚、浓
硫酸、二甲基亚砜(DMSO)均为国产分析纯试剂。
1.2 仪器与设备
DZTW调温电热套 北京永光明医疗仪器厂；DK-
S24电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；RE-
52旋转式蒸发仪 上海安亭实验仪器有限公司；SHB-
Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；
UV-2501PC双光束紫外分光光度计 日本岛津公司；
HF212UV CO2培养箱 上海力申科学仪器有限公司；
MoticAE31倒置相差显微镜 麦克奥迪实业集团有限公
司；MC318酶标仪 上海三科仪器有限公司；WZ-2A
微量振荡器 江苏省金坛仪器厂。
1.3 琐琐葡萄多糖的制备及其含量测定
1.3.1 琐琐葡萄多糖的制备[6-8]
称取琐琐葡萄药材 5.0kg，粉碎，过 20 目筛，以
料液比为 1:10加入蒸馏水恒温回流提取 2次，每次 3h，
提取液经抽滤后合并，减压浓缩至一定量(比重 1.1～
1.2)，加入 5倍体积 95%乙醇，充分混匀，静置 12h，
醇沉，过滤，得白色粉末，将此白色粉末分别以无水
乙醇、丙酮、乙醚依次充分洗涤，脱水干燥，即得
琐琐葡萄多糖(polysaccharides from Vitis viniferal L.，
VTP)粗品。
1.3.2 琐琐葡萄多糖提取物中中性糖含量的测定[9-10]
1.3.2.1 溶液的配制
1)葡萄糖对照品溶液的配制：精密称取葡萄糖对照
品 100.0mg，置 100mL容量瓶中，加水溶解并稀释至
刻度，摇匀，备用。2 )苯酚液的配制：精密称取苯酚
6.0g于 100mL棕色容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，
摇匀，密封备用。3 )多糖供试品溶液的配制：精密称
取VTP样品 75.0mg，置 50mL容量瓶中，加水溶解定容
至刻度，摇匀，备用。
1.3.2.2 最大吸收波长的选择
分别精密吸取葡萄糖对照品溶液、多糖供试品溶
液各 1.0mL 置具塞试管中，加水至 2.0mL，依次加入
6g/100mL的苯酚溶液1.0mL、浓硫酸5.0mL，静置10min，
摇匀，室温放置 20m in，以蒸馏水作空白，在 20 0～
800nm 波长范围内扫描，确定最大吸收波长。
1.3.2.3 标准曲线的制备
分别精密吸取 1.0mg/mL的葡萄糖对照品溶液 0.2、
0 .4、0 .6、0 .8、1 .0、1 .2mL，置具塞试管中，加水
至 2.0mL，加入 6g/100mL的苯酚溶液 1.0mL、浓硫酸 5.0
mL，静置 10min，摇匀，室温放置 20min，以蒸馏水
作空白，在最大吸收波长处测定吸光度。
1.3.2.4 琐琐葡萄多糖提取物的含量测定
精密称取 4份 VTP提取样品，加水溶解至一定浓
度，分别依次加入 6g/100mL的苯酚溶液 1.0mL、浓硫
酸 5.0mL，静置 10min，摇匀，室温放置 20min，以
蒸馏水作空白，在最大吸收波长处测定吸光度，计算
多糖的平均百分含量。
1.4 动物分组及剂量设定[11]
昆明种小鼠 144只，雄性，体质量(20± 2)g，由
新疆医科大学实验动物中心提供(SPF级，动物使用许可
证号：SYXK[新]2003-0001)，适应性饲养 3d后，按体
质量分层，随机分为两批(一批用于测定脏器指数和细胞
免疫功能，一批用于测定体液免疫功能)，每批 72 只，
随机分为 6组，分别为模型组(蒸馏水 10mL/(kg bw·d))、
阳性对照组(螺旋藻制剂 500mg/(kg bw·d))、VTP溶剂
对照组(蒸馏水 10mL/(kg bw·d))、VTP低、中、高
剂量组(42、208、1042mg/(kg bw·d))，每组 12只。
1.5 动物模型的建立及药物干预方案[12-13]
实验分两批次隔周进行，各组小鼠实验期间自由摄
取常规饲料、自由饮水并按 1.4节所设定剂量灌胃给予
对应药物或蒸馏水，连续 30d。第一批小鼠于实验第 25
天，VTP空白组腹腔注射生理盐水(10mL/(kg bw·d))，
其余各组腹腔注射环磷酰胺(100mg/(kg bw·d))，各组
小鼠于末次给药 24h后(第 31天)称量体质量，颈椎脱臼
处死，摘取胸腺和脾脏，计算胸腺、脾脏指数，并
测定脾淋巴细胞转化功能；第二批小鼠于实验第 25天，
VTP空白组小鼠腹腔注射生理盐水(10mL/(kg bw·d))，其
余各组小鼠腹腔注射环磷酰胺(100mg/(kg bw·d))，并
于实验第 26天，各组每只小鼠腹腔注射体积分数为 2%
的 SRBC 悬液 0.2mL进行免疫，于末次给药 24h后(第
31天)摘眼球取血，分离血清，进行血清溶血素检测，
并将动物颈椎脱臼处死，摘取脾脏进行抗体分泌细胞
的检测。
1.6 指标检测[14-15]
1.6.1 脏器系数
小鼠末次给药 24h后，称体质量，颈椎脱臼处死，
摘取胸腺和脾脏，吸干血迹称其湿质量，计算胸腺、
脾脏指数。
,
231※营养卫生 食品科学 2010, Vol. 31, No. 09

胸腺质量/mg
胸腺指数=——————— (1)

体质量/g

脾脏质量/mg
脾脏指数=——————— (2)

体质量/g
1.6.2 脾淋巴细胞转化细胞免疫功能测定(MTT法)
小鼠处死后无菌摘取脾脏，置于盛有适量无菌
Hank s液的平皿中，轻轻将其磨碎，用 4层纱布过滤，
制成单细胞悬液。用 H a nk s 液将细胞悬液洗涤 2 次，
1000r/min离心 10min，然后将细胞悬浮于 1mL的完全培
养液中，用台酚兰染色计数活细胞数，调整细胞浓度
为 3× 106个 /mL。将每只实验小鼠的脾细胞悬液分两孔
加入 24孔培养板中，每孔 1mL，其中一孔加 75μL ConA
液，另一孔作为对照，置于 5% CO 2、37℃ CO 2孵箱
中培养 7 2 h。培养结束前 4 h，每孔轻轻吸去上清液
0.7mL，加入 0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，
同时加入MTT(5mg/mL)50μL /孔，继续培养 4h。培养
结束后，每孔加入 1mL DMSO，吹打混匀，使紫色结
晶完全溶解，最后将 24孔中液体以每孔 3个复孔分装于
96孔培养板中，用酶联免疫检测仪，于 570nm波长处
测定每孔吸光度。
1.6.3 体液免疫功能测定
1.6.3.1 半数溶血值(HC50)的测定
分别取每只小鼠血清，用生理盐水稀释 200倍。取
稀释后的血清 1mL置试管内，依次加入体积分数 10%的
SRBC 0.5mL和补体1mL(以生理盐水按1:8稀释)。另设不
加血清的对照管(生理盐水)。置 37℃恒温水浴中保温
30min后，冰浴终止反应，2000r/min离心 10min。取
上清液 1mL，加都氏试剂 3mL，充分混匀，于 540nm
波长处以对照管作空白，测定各管吸光度，为样品吸
光度。另取体积分数 10%的 SRBC 0.25mL加都氏试剂至
4mL，充分混匀，放置 10min后，于 540nm波长处以
对照管作空白，测定其吸光度，为 SRBC半数溶血时的
吸光度。并依据公式(3)计算血清半数溶血值 HC 50。

样品吸光度
HC50=——————————————×稀释倍数(200) (3)

SRBC半数溶血时的吸光度
1.6.3.2 抗体分泌细胞检测
摘取脾脏，置于盛有Hanks液的小平皿内，轻轻将
脾脏磨碎，用 4层纱布过滤，制成单细胞悬液，1000/min
离心 10min，用Hanks液洗 2遍，最后将细胞悬浮在5mL
RPMI1640培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数，并
将细胞浓度调整为 5× 106个 /mL。另取试管若干，依
次加入脾细胞悬液 1mL、0.2%SRBC悬液 1mL、补体
1mL，另设不加补体的空白对照管，置 37℃水浴中温育
1h，以 3000r/min离心 5min，取上清，于 413nm波长
处测定各管吸光度。
1.7 数据统计方法
实验数据应用 SPSS11.0 软件进行单因素方差分析。
2 结果与分析
2.1 琐琐葡萄多糖提取物中多糖含量的测定
2.1.1 最大吸收波长的选择
紫外扫描图谱显示，葡萄糖对照品溶液和多糖样品
供试液均在 4 9 0 n m 波长处出现最大吸收峰，故选择
490nm波长为琐琐葡萄多糖的定量检测波长。
2.1.2 标准曲线的制备
以葡萄糖对照品溶液质量浓度对吸光度进行回归，
绘制标准曲线(图 1)，拟合标准曲线方程 Y = 11.6433X+
0.1107(r = 0.9992)，表明葡萄糖对照品溶液在 0.03～
0.18mg/mL质量浓度范围内呈现良好的线性关系。
样品 取样量 /mg A490nm 百分含量 /% 多糖平均百分含量 /% RSD/%
1 5.0023
0.477 20.97
0.475 20.86
2 5.0049
0.463 20.17
0.459 19.94
20.68 1.93
3 5.0072
0.474 20.80
0.427 20.74
4 5.0089
0.478 21.03
0.476 20.92
表 1 VTP中多糖含量测定结果
Table 1 Content of polysaccharides in VTP
2.1.3 琐琐葡萄多糖提取物中多糖含量测定结果
本研究采用水提醇沉法提取得到琐琐葡萄多糖粗提
物 500g，由表 1 可知，提取样品中多糖的平均百分含
量为 20.68%，RSD为 1.93%。
2.2 琐琐葡萄多糖对小鼠免疫器官质量的影响
图1 葡萄糖对照品的标准曲线
Fig.1 Standard curve of glucose
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0.452
A
49
0n
m
葡萄糖对照品溶液质量浓度 /(mg/mL)
0 0.03 0.06 0.09 0.12 0.15 0.18 0.21
0.804
1.172
1.537
1.887
2.434
,
2010, Vol. 31, No. 09 食品科学 ※营养卫生232
由表 2可知，模型组与 VTP空白组比较，胸腺指
数值和脾脏指数值均显著降低(P＜ 0.05)，表明免疫力低
下小鼠模型成立。阳性对照组和VTP中剂量组的脾脏指
数值与模型组相比较，差异有统计学意义(P＜ 0.05)，可
增加淋巴器官脾脏的质量，而VTP各剂量组与模型组相
比较对胸腺指数的影响差异均无统计学意义(P＞ 0.05)。
2.3 琐琐葡萄多糖对小鼠脾淋巴细胞转化功能的影响
组别 剂量 /(mg/(kg bw·d)) 动物数 抗体 A413nm HC 50
模型组 11 0.256 ± 0.007 0.0569 ± 0.004
阳性对照组 500 12 1.072 ± 0.041** 0.3740 ± 0.186**
VTP 空白组 11 0.469 ± 0.086* 0.0676 ± 0.009
VTP 低剂量组 42 12 0.633 ± 0.169* 0.1009 ± 0.083*
VTP 中剂量组 208 12 0.727 ± 0.183* 0.1535 ± 0.115**
VTP 高剂量组 1042 12 0.893 ± 0.147** 0.1950 ± 0.012**
表 4 VTP对小鼠抗体分泌细胞功能及血清溶血素水平的影响(x± s)
Table 4 Effect of VTP on antibody-secreting cell function and
serum hemolysin level (x± s)
注：* .与模型组比较， 差异显著(P＜ 0.05)；** .与模型组比较，差异
极显著(P＜ 0 .0 1)。下同。
组别 剂量 /(mg/(kg bw·d)) 动物数 A540nm
模型组 11 0.019± 0.018
阳性对照组 500 12 0.101± 0.031**
VTP 空白组 10 0.169± 0.082**
VTP 低剂量组 42 11 0.043± 0.028*
VTP 中剂量组 208 12 0.090± 0.041**
VTP 高剂量组 1042 11 0.107± 0.054**
表 3 VTP对小鼠脾淋巴细胞转化功能的影响(x± s)
Table 3 Effect of VTP on lymphocyte transformation capability
(x± s)
由表 3可知，模型组与 VTP空白组比较，小鼠脾
淋巴细胞转化功能显著降低(P＜ 0.01)，表明免疫力低下
小鼠模型成立。VTP 3个剂量组与模型组相比较，均显
示出对小鼠脾淋巴细胞转化功能的促进作用，其中VTP
高剂量组使ConA诱导的淋巴细胞转化A增加至 0.107，
数值已接近阳性对照组，较模型组提高了 4.63倍。
2.4 琐琐葡萄多糖对小鼠抗体分泌细胞功能及血清溶血
素水平的影响
抗体分泌细胞功能与血清溶血素水平是反映机体体
液免疫功能的重要指标，从表 4 可以看出，模型组与
VTP空白组比较，抗体 A413nm和半数溶血值均显著降低
(P＜ 0.05)，表明免疫力低下小鼠模型成立。VTP各个
剂量组均能有效提高小鼠抗体生成细胞的功能，其中
VTP高剂量组的抗体 A413nm高达 0.893，约是模型组的
4倍(P＜ 0.01)。VTP 3个剂量组均可使红细胞的半数溶
血值增高，其中 VTP高剂量组的 HC 50较模型组增加了
2.42倍(P＜ 0.01)。此外，实验结果还显示出，VTP 3
个剂量组对抗体分泌细胞功能和血清溶血素水平的影响
呈现一定的剂量依赖性。
3 讨 论
现代医学研究表明，机体免疫系统是清除致病微生
物、处理和呈递抗原、分泌细胞因子和维持机体内环
境稳定的重要系统。本研究中的药效学实验部分依照
《保健食品检验与评价技术规范实施手册》的要求，对
琐琐葡萄多糖的免疫调节功能进行了动物体内的实验研
究，分别从免疫器官质量、细胞免疫功能和体液免疫
功能 3个方面探讨了VTP在不同剂量水平下对免疫低下
模型小鼠免疫功能的影响。
在本研究中，模型组小鼠的各项测定指标均低于空
白对照组，4个实验项目均造模成功，稳定复制了环磷
酰胺所致的免疫低下小鼠模型，为免疫保护作用的研究
提供了必要前提。脾脏是由二级淋巴上皮组织构成的外
周免疫器官，是免疫致敏和淋巴细胞由初始型向记忆 -
效应型转变的部位，其发育依赖淋巴细胞的发育[16]。与
模型组相比，VTP中剂量组使小鼠脾脏的质量有所增加
(P＜ 0.05)。有关多糖类的药理学研究表明，多糖分子
存在活性中心，细胞表面有多糖受体，多糖分子通过
与其相应的受体结合进入细胞，大约 20%可以被吸收，
聚集在脾脏[16]。胸腺为一级淋巴上皮组织构成的中枢免
疫器官，游走的造血干细胞在此分化增殖成 T 淋巴细
胞。V TP 各剂量组小鼠的胸腺指数均低于模型组，表
明在本实验体系中VTP可能对小鼠胸腺的发育没有促进
作用。VTP还具有显著增强免疫低下小鼠特异性细胞免
疫及体液免疫的作用，经灌胃给予受试物作用 30d后，
VTP低、中、高 3个剂量组的脾淋巴转化细胞吸光度与
模型组相比均有统计学差异，尤其是在高剂量VTP作用
下，其吸光度已接近阳性对照药物螺旋藻。应用定量
溶血分光光度法检测抗体形成细胞所分泌的抗 SRBC抗
体，其结果也表明VTP可提高环磷酰胺抑制的小鼠体液
免疫功能，可能是直接刺激 B淋巴细胞增殖而增强小鼠
体液免疫功能所致。
依照《保健食品检验与评价技术规范实施手册》
中增强细胞免疫功能和体液免疫功能的判定标准，可初
注：* .与模型组比较，差异显著(P ＜ 0 .0 5)。
组别
剂量 /(mg/(kg
动物数 胸腺指数 /(mg/g) 脾脏指数 /(mg/g)
bw·d) )
模型组 11 2.96± 0.45 2.92± 0.59
阳性对照组 500 12 3.94± 0.13* 4.29± 0.69*
VTP 空白组 10 3.88± 0.62* 4.91± 1.01*
VTP 低剂量组 42 11 2.03± 0.34 2.51± 0.25
VTP 中剂量组 208 12 2.73± 0.23 3.94± 1.88*
VTP 高剂量组 1042 11 2.58± 0.35 2.96± 0.47
表 2 VTP对小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响 (x± s)
Table 2 Effect of VTP on indices of thymus and spleen (x± s)
233※营养卫生 食品科学 2010, Vol. 31, No. 09
步判定VTP具有增强昆明种小鼠细胞免疫和体液免疫功
能的作用，从而表明VTP是琐琐葡萄增强机体免疫力的
物质基础之一。然而，其免疫调节的作用机制还有待
于通过测定血清白细胞介素和γ-干扰素等细胞因子的变
化，分析 Th1/Th2细胞的功能和免疫平衡状态等方面开
展深入研究。
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