全 文 ：琐琐葡萄多糖中糖醛酸含量的测定＊
俞　丹1＊＊ , 马　龙1＊＊＊ , 赵　军2 , 刘　涛1 , 张　琳1
(1新疆医科大学公共卫生学院卫生毒理学教研室 , 新疆　乌鲁木齐　830011;
2新疆药物研究所维吾尔药研究开发重点实验室 , 新疆　乌鲁木齐　830002)
摘要:目的:测定琐琐葡萄多糖中半乳糖醛酸的含量。方法:采用间羟基联苯法对琐琐葡萄多糖中的半乳糖
醛酸进行含量测定 ,并研究了四硼酸钠/硫酸溶液用量 , 加酸后沸水浴时间 、间羟基联苯溶液用量及中性糖对测定
结果的影响。结果:该测定方法不受中性糖的影响, 并测得琐琐葡萄多糖中半乳糖醛酸的平均百分含量为 38.17%,
RSD为 1.65%。结论:间羟基联苯法简便 、快速 、准确 ,适用于对琐琐葡萄多糖中的半乳糖醛酸含量进行测定。
关键词:琐琐葡萄多糖;糖醛酸;含量测定;间羟基联苯法
中图分类号:O629.12　　文献标识码:A　　文章编号:1009-5551(2009)05-0533-03
Quantitative determination of uronic acid in polysaccharides from Vitis vinifer L.
YU Dan , MA Long , ZHAO Jun , et al
(Department of Toxicolog y , College of Public Heal th , X inj iang Med ical Universi ty ,
Urumqi 830011 , China)
Abstract:Objective:To determine the galacturonic acid content o f the poly saccharides f rom Vit is vini f era
L.(VVP).Methods:The me thod wi th m-hydroxydipheny l w as used.The amount of tetraborate/H2 SO 4 ,
the boiling time , m-hydro xydipheny l and the interference by neutral sugar w ere studied.Results:The
method w e employed is no t af fected by the neutral sugars and the average content of galacturonic acid in
VVP is 38.17%, RSD is 1.65%.Conclusion:A s being simple and accurate , the me thod of m-hydro xydi-
phenyl can be w ell used for the de termination o f galacturonic acid in VVP .
Key words:Vitis vinifera L .poly saccha rides;uronic acid;quant itat ive determination;method of
m-hydro xydipheny l
　　琐琐葡萄(Vit is viniferal L.)属葡萄科小无核
红葡萄品系植物 ,药食兼用 ,主产于新疆吐鲁番 、和
田 、鄯善等地[ 1] 。作为药用果实 ,琐琐葡萄具有健脾
胃 、理肺 、生津 、养血等作用;维吾尔医学应用琐琐葡
萄治疗脾胃不和 、头晕腰酸 、神志不安等 ,民间用于
治疗小儿麻疹 、肝炎等症[ 2] ,其药用功效在《神农本
草经》 、《本草纲目》中均有记述 。多糖(poly saccha-
rides)是自然界中含量最丰富的生物聚合物 , 也是
构成生命活动的四大基本物质之一 ,近年来 ,多糖及
其衍生物作为组织支持物质和能量来源的传统观念
已被突破 ,作为一种非细胞毒物质 ,它还具有调节免
疫 、抗氧化 、抗肿瘤 、降血压 、降血脂 、降血糖 、抗衰
老 、抗辐射等多种生物活性 ,成为近年来天药研究的
热点课题之一[ 3] 。
多糖是琐琐葡萄的主要有效成分之一[ 4] ,研究
表明具有特殊生理活性的多糖其糖醛酸含量一般较
高 ,作为糖分子中 6位的羟甲基氧化成羧基的产物 ,
糖醛酸本身或含有糖醛酸结构单元的低聚糖或多糖
常显示出十分重要的生物活性 ,尤其对于从天然植
物中提取得到的多糖 ,确定其结构中是否含有糖醛
酸残基具有极为重要的意义[ 5] 。因此本研究采用间
羟基联苯法对琐琐葡萄多糖中的半乳糖醛酸进行含
量测定 ,以期为琐琐葡萄多糖的结构分析和生物学
活性研究提供研究基础 。
1　主要材料 、仪器及设备
1.1　主要材料　琐琐葡萄药材:购自新疆维吾尔自
治区吐鲁番市维吾尔医药市场 ,经专家鉴定确为琐
琐葡萄(Vit is viniferal L.)的成熟果实。琐琐葡萄
多糖:本实验室自制;半乳糖醛酸 、间羟基联苯购自
中国药品生物制品检定所;95%乙醇 、无水乙醇 、乙
醚 、丙酮 、正丁醇 、三氯甲烷 、EDTA 、浓硫酸 、葡萄
糖 、氢氧化钠和四硼酸钠均为国产分析纯试剂。
1.2　仪器及设备　DZTW 调温电热套(北京永光
明医疗仪器厂), DK-S24 型电热恒温水浴锅(上海
精宏实验设备有限公司), RE-52旋转式蒸发仪(上
533新疆医科大学学报　JOURNAL OF XINJIANG MEDICAL UNIVERSITY　2009 May., 32(5)
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基金项目:国家自然科学基金资助项目(30660157);高等学校博士学科点专项科研基金项目(200807600002)
作者简介:俞　丹(1982-),女 ,硕士研究生 ,研究方向:新疆特色药食兼用植物的开发应用研究。
通讯作者:马　龙 ,男 ,教授 ,博士研究生导师 , E-mail:ml@x jmu.edu.cn。
海安亭实验仪器有限公司), SHB-Ⅲ循环水式多用
真空泵(郑州长城科工贸有限公司), THZ-82A 气
浴恒温振荡器(江苏省金坛市医疗仪器厂),透析袋 ,
电子分析天平 ,分液漏斗 ,布氏漏斗 , UV-2501PC 型
双光束紫外分光光度计(日本岛津公司),XW-80旋
涡混合器(上海第一医学院仪器厂)。
2　方法与结果
2.1　琐琐葡萄多糖样品的制备　称取琐琐葡萄药
材400 g ,粉碎 ,过 20目筛 ,加 10倍体积的蒸馏水回
流提取 2次 ,每次 3 h ,提取液合并减压 ,浓缩至膏
状 ,加入 5倍体积的 95%乙醇 ,静置 12 h 。静置液
体经抽滤后取沉淀部分经无水乙醇 、丙酮 、乙醚充分
洗涤 ,干燥得多糖粗品 40 g 。多糖粗品经 Sevage 法
除蛋白 ,水相反复透析 ,得精制多糖 40 mg 。
2.2　试剂的配制　(1)半乳糖醛酸标准溶液:称取
干燥至恒重的半乳糖醛酸标准品 25.00 mg ,加水溶
解并定容至 25 m l ,混匀 ,制备成 1.00 mg/ml的标
准溶液。(2)四硼酸钠/硫酸溶液:准确称取 0.478 g
四硼酸钠溶解于 100 m l浓硫酸中 ,备用。(3)间羟
基联苯溶液:准确称取 0.15 g 间羟基联苯溶解于 5
mg/ml氢氧化钠溶液中 ,定容至 100 ml ,其质量浓
度为 1.50 mg/ml。(4)葡萄糖溶液:准确称取葡萄
糖 25.00 mg ,加水溶解并定容至 25 ml ,混匀 ,其质
量浓度为 1.00 mg/ml。
2.3　试验方法及最大吸收波长的选择　取半乳糖
醛酸标准溶液(1.00 mg/ml)0.50 ml ,置10 m l容量
瓶中 ,以水定容至刻度 , 摇匀(质量浓度为 0.05
mg/ml)。量取该溶液1.00 ml 置于 20 ml具塞试管
中 ,于冰水浴中 ,缓慢加入四硼酸钠/硫酸溶液 5 ml ,
待全部加完后 ,用旋涡混合器混匀 ,于沸水浴中加热
5 min ,冰水浴中冷却后加入 1.50 mg/ml间羟基联苯
溶液100 μl ,混匀后振摇 5 min ,静置待气泡除尽 。以
1 ml蒸馏水同上操作制得空白液调零 ,于 200 ～ 800
nm波长范围内扫描 ,确定最大吸收波长为 525 nm。
2.4　试验条件的考察[ 6] 　该测定方法中影响吸光
度 A的因素分别是四硼酸钠/硫酸溶液用量 、加酸
后沸水浴时间和间羟基联苯溶液用量。
2.4.1　四硼酸钠/硫酸溶液用量考察　多聚半乳糖
醛酸在热的浓硫酸作用下水解为半乳糖醛酸单体 ,
浓硫酸用量影响着水解反应的程度 。在硫酸中加入
一定量的四硼酸钠可增加半乳糖醛酸显色的敏感
性。因此 ,本研究考察了四硼酸钠/硫酸溶液用量对
测定的影响 ,结果如表 1所示(半乳糖醛酸标准溶液
1.00 m l ,四硼酸钠/硫酸溶液用量为 4.0 ～ 6.0 ml ,
沸水浴加热 5 min ,间羟基联苯溶液 100 μl)。
表 1　不同四硼酸钠/硫酸溶液用量测得的吸光度
四硼酸钠/硫酸溶液(ml) 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0
吸光度 0.281 0.368 0.541 0.689 0.598
从表 1中数据可看出 ,随着四硼酸钠/硫酸溶液用量
的增加 ,溶液吸光度相应增高 ,但是 ,过量的四硼酸
钠/硫酸溶液使溶液中衍生物的浓度降低 ,吸光度反
而下降 。由此表明 ,在本实验条件下四硼酸钠/硫酸
溶液用量的适宜值为 5.5 m l ,其吸光度最大 。
2.4.2　加酸后沸水浴加热时间考察　四硼酸钠/硫
酸溶液与多聚半乳糖醛酸的水解反应须在沸水浴加
热的条件下进行 ,水浴时间对反应的影响见表 2(半
乳糖醛酸标准溶液 1.00 ml ,四硼酸钠/硫酸溶液
5.0 m l ,沸水浴加热时间 2 ～ 15 min ,间羟基联苯溶
液 100μl)。
表 2　不同水浴时间测得的吸光度
水浴时间(min) 2 5 8 10 15
吸光度 0.523 0.592 0.572 0.557 0.582
从表 2数据可看出 ,水浴加热 5 min反应完全 ,
吸光度最大且此后反应趋于基本平衡。因此 ,沸水
浴加热 5 min是较适宜的 。
2.4.3　间羟基联苯用量考察　间羟基联苯可与多聚
半乳糖醛酸的水解产物反应 ,将其转化衍生后显色。
间羟基联苯用量对吸光度的影响见表 3(半乳糖醛酸
标准溶液1.00 ml ,四硼酸钠/硫酸溶液5.00 ml ,沸水
浴 5 min ,间羟基联苯溶液用量为70 ～ 130 μl)。
表 3　不同间羟基联苯用量测得的吸光度
间羟基联苯溶液(ml) 70 80 90 100 110 120 130
吸光度 0.775 0.800 0.657 0.638 0.640 0.497 0.617
从表 3数据表明 ,加入 100 μl间羟基联苯溶液
时溶液吸光度值比较稳定 ,为最佳用量。
依据以上试验结果 ,确定本次含量测定的最佳反
应条件为:四硼酸钠/硫酸溶液用量 5.5 ml ,沸水浴时
间 5 min ,1.5 mg/ml间羟基联苯溶液用量 100μl。
2.5　中性糖对糖醛酸含量测定的影响　经测定 ,琐
琐葡萄多糖提取物中含有中性糖 ,运用传统的“硫
酸-咔唑法”对天然产物中的糖醛酸进行定量分析
时 ,中性糖可与硫酸-咔唑形成棕色衍生物 ,干扰测
定结果的准确性[ 6] 。因此 ,在采用“间羟基联苯法”
测定糖醛酸含量时 ,需考察中性糖(以葡萄糖为例)对
测定结果的影响 ,即在一定浓度半乳糖醛酸标准溶液
中 ,添加不同质量的中性糖 ,以考查不同质量浓度的
中性糖对半乳糖醛酸溶液吸光度是否有影响 ,结果见
表 4(溶液中半乳糖醛酸质量浓度为50 μg/ml)。
表 4　中性糖对测定结果的影响
葡萄糖质量浓度(μg/ml) 0 50 100 150
吸光度 0.318 0.337 0.320 0.346
从表4数据可看出 ,当中性糖含量增加时 ,吸光度
值仅发生微小变化 ,该结果表明 ,采用间羟基联苯法测
定糖醛酸含量时 ,中性糖对测定结果的影响很小。
2.6　标准曲线的制备　取半乳糖醛酸标准溶液(1.00
534 新疆医科大学学报　JOURNAL OF XINJIANG MEDICAL UNIVERSITY　2009 May., 32(5)
mg/ml)0.50 ml ,置 10 ml容量瓶中 ,用水定容至刻
度 ,摇匀(质量浓度为 0.05 mg/ml)。分别取该浓
度的半乳糖醛酸标准溶液 0.1 、0.2 、0.3 、0.4 、0.5和
0.6 ml置于 20 ml具塞试管中 ,于冰水浴中加入四
硼酸钠/硫酸溶液 5.5 m l ,用旋涡混合器混匀 ,于沸
水浴中加热5 min ,冰水浴中冷却后加入 1.5 mg/ml
间羟基联苯溶液 100 μl ,混匀后振摇 5 min ,静置 。
以 1 ml蒸馏水同上操作制得空白液调零 ,在 525
nm 波长处测定吸光度。以标准糖醛酸含量(μg)为
横坐标 ,吸光度 A 为纵坐标 ,绘制标准曲线(图 1),
并拟合标准曲线的回归方程为:Y =0.014 94X -
0.003 93(R =0.999 4),表明半乳糖醛酸标准品在
5 ～ 30μg 范围内呈良好的线性关系 。
图 1　半乳糖醛酸对照品溶液的标准曲线
2.7　稳定性试验 、精密度试验及加标回收率试验
2.7.1　稳定性试验　准确称取样品 5 mg 置 100
ml容量瓶 ,加水溶解定容至刻度(浓度 50 μg/ml。
取该溶液 1 ml按“标准曲线的制备”项下操作 ,每隔
5 min测定一次吸光度 ,表 5中结果显示 ,1 h 内吸
光度值基本维持稳定 。
表 5　稳定性试验结果
显色后不同
时间点(min) 0 10 20 30 40 50 60 90 120
吸光度值 0.250 0.221 0.234 0.236 0.237 0.235 0.218 0.239 0.241
2.7.2　精密度试验　取同批样品溶液(50 μg/ml),
按“标准曲线的制备”项重复操作 5次并分别测定吸
光度 ,RSD为 2.50%,结果见表 6。
表 6　精密度试验结果
测定次数 1 2 3 4 5 平均值 RSD(%)
吸光度 0.206 0.202 0.213 0.215 0.209 0.209 2.50
2.7.3　加标回收率试验　取样品 10 mg 置 100 ml
容量瓶中 ,加水溶解定容至刻度(浓度 100 μg/ml)。
取该溶液 1 ml按“标准曲线的制备”项下操作 ,用标
准添加法分别添加不同质量的半乳糖醛酸标准品 ,
测得间羟基联苯法的平均回收率为 99.82%, RSD
为 1.82%,结果见表 7。
2.8　样品含量测定　分别称取样品 1和样品 2各 5
mg置 100 ml容量瓶中 ,加水溶解定容至刻度(浓度
50μg/ml)。分别取该浓度溶液 1 ml按“标准曲线的
制备”项下操作 ,每份样品平行测定3次 ,结果见表8。
表 7　加标回收率试验结果
样品中糖醛酸
含量(μg)
加标量
(μg) 吸光度值
测定量
(μg)
回收率
(%)
平均值
(%)
RSD
(%)
38.17 10 0.712 47.92 97.50 99.82 1.82
38.17 10 0.718 48.32 101.51
38.17 10 0.717 48.25 100.85
38.17 20 0.866 58.22 100.29
38.17 20 0.863 58.02 99.28
38.17 20 0.867 58.29 100.62
38.17 30 1.016 68.26 100.32
38.17 30 0.998 67.06 96.31
38.17 30 1.022 68.67 101.66
表 8　VVP 中样品含量测定结果
样品编号 吸光度值 半乳糖糖醛酸质量分数(%)
平均值
(%)
RSD
(%)
0.268 36.40
1 0.267 36.26 36.80 2.22
0.278 37.74
0.295 40.01
2 0.290 39.34 39.53 1.08
0.289 39.21
3　结论
间羟基联苯法是糖醛酸含量测定中比较成熟的
方法 ,然而其测定条件各文献报道间差异较大 ,因
此 ,本研究对影响测定的主要因素进行了逐一考察 ,
筛选出最佳试验条件 ,进一步提高了实验结果的科
学性和准确性。此外 ,天然药物提取的多糖以酸性
杂多糖的形式存在较多 ,由于中性糖 、糖醛酸并不是
独立存在 ,它们可能存在于同一糖链中 ,无法将它们
分离 ,在分别测定含量时可能存在相互干扰 ,本试验
结果表明 ,采用间羟基联苯法测定糖醛酸含量时 ,中
性糖对测定结果的影响很小 。
精密度 、稳定性试验和加标回收率试验的结果
表明间羟基联苯法操作简便灵敏 ,样品稳定性 、重现
性较好 ,回收率高 ,适合于对琐琐葡萄多糖中糖醛酸
含量进行测定 ,并最终测得琐琐葡萄多糖中糖醛酸
的平均百分含量为 38.17%, RSD 为 1.65%,为琐
琐葡萄多糖的构效关系研究和生物学活性的探索开
辟了新的思路和方向。
参考文献:
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木齐:新疆科技卫生出版社 , 1993:41.
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[ 5] 　刘翠平 ,董　群 ,方积年.一种判定多糖中有无糖醛酸残基的简
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化学工业与工程 , 2005 , 22(6):487-489.
[ 收稿日期:2008-12-26]
535新疆医科大学学报　JOURNAL OF XINJIANG MEDICAL UNIVERSITY　2009 May., 32(5)